Extracto
Antecedentes
El omeprazol se ha descrito recientemente como un modulador de la quimio-resistencia tumoral, aunque sus mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo controvertidos. Dado que los tumores pancreáticos son altamente quimioresistente, un paso lógico sería investigar los efectos farmacodinámicos, morfológicas y bioquímicas de omeprazol en líneas celulares de cáncer de páncreas.
Metodología /Principales conclusiones
Las curvas de dosis-efecto de omeprazol, pantoprazol, gemcitabina, 5-fluorouracilo y las combinaciones de omeprazol y 5-fluorouracilo o gemcitabina se generaron para las líneas celulares de cáncer pancreático MiaPaCa-2, ASPC-1, Colo357, PancTu-1, Panc1 y Panc89. Revelaron que inhibió la proliferación omeprazol en probablemente concentraciones no tóxicas y revirtió los fenómenos hormesis de 5-fluorouracilo. La microscopía electrónica mostró que el omeprazol condujo a la acumulación de phagophores y principios de autofagosomas en ASPC-1 y MiaPaCa-2 células. Señalar los cambios que indica inhibió la proliferación y la muerte celular programada se han encontrado por espectroscopia de RMN de protón de ambas líneas celulares cuando son tratados con omeprazol que se identificó intracelularmente. Omeprazol modula la vía de transporte lisosomal como se muestra por análisis de transferencia Western de la expresión de LAMP-1, la catepsina-D y β-COP en el complejo de Golgi y lysosome- que contiene fracciones de células. tinción con naranja de acridina reveló que la función de la bomba de la vATPase no fue inhibida específicamente por omeprazol. La expresión génica del gen LC3 relacionados con la autofagia-así como de Bad, Mdr-1, Atg12 y la vATPase se analizó después del tratamiento de las células con 5-fluorouracilo y omeprazol y confirmó los resultados anteriormente mencionados.
Conclusiones
Nos piensan que el omeprazol interactúa con las funciones reguladoras del vATPase sin inhibir su función de bombeo. Una modulación de la ruta de transporte lisosomal y la autofagia es causado en las células de cáncer de páncreas que conducen a la muerte celular programada. Esto puede eludir los mecanismos de resistencia comunes de cáncer de páncreas. Puesto que el uso de omeprazol ya se ha establecido en la práctica clínica, estos resultados podrían conducir a nuevas aplicaciones clínicas
Visto:. Udelnow A, Kreyes A, S Ellinger, Landfester K, Walther P, Klapperstueck T, et al. (2011) El omeprazol inhibe la proliferación y modula la autofagia en las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 6 (5): e20143. doi: 10.1371 /journal.pone.0020143
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Noviembre 2010; Aceptado: April 26, 2011; Publicado: 24 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Udelnow et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de la progresión relevante en el diagnóstico, la resección y quimioterapia, cáncer de páncreas se asocia con una supervivencia a corto [1]. proliferación constitutiva y profunda resistencia a la apoptosis son rasgos característicos de las células tumorales pancreáticas representación altamente resistentes a las estrategias quimioterapéuticos comunes. Se han descrito varios mecanismos responsables de la resistencia a la apoptosis incluyendo regulación a la baja de las proteínas pro-apoptóticos, la regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas [2], [3], la activación de diversas quinasas tales como proteína quinasa C (PKC) /proteína quinasa D1 (PKD1) y la caseína quinasa 1 (CK1) [4] - [6], la expresión elevada de diversos microRNAs [7], las mutaciones de p53 y MDM2 polimorfismos [8]. Por lo tanto, la identificación de sustancias que son capaces de eludir estos mecanismos serían valiosos.
Recientemente, omeprazol (OMP), establecido como un fármaco estándar mundial para la gastritis y úlcera duodenal desde la década de 1980, ha sido descrita como una agente antiproliferativo potencial y un modulador de la resistencia tanto en vitro y en xenoinjertos de tumores de ratones [9], [10]. Otras investigaciones han sugerido que la inhibición de la bomba de protones vacuolar (vATPase), que regula el pH lisosomal, o la acumulación en los lisosomas pueden ser los mecanismos que conducen a la sensibilización de las células hacia el tratamiento citostático [9] - [12]. Además, se ha informado de la formación de especies reactivas de oxígeno [9] y la participación de p38 MAPK [13] que se asocia con los efectos celulares inducidos por OMP. Además de P-glicoproteína (Pgp) [14] y del citocromo P450 2C19 isoforma [15] interacciones farmacocinéticas causa de OMP con otros medicamentos (es decir, antibióticos, barbitúricos, citostáticos), que son de relevancia clínica. Estos datos hasta ahora apuntan a los mecanismos complejos que implican, entre otros, el sistema de transporte lisosomal. El debate sobre si y cómo OMP puede inhibir el crecimiento de células cancerosas y aumentar los efectos citostáticos de citostáticos están en curso.
Hasta la fecha, ni la droga en sí ni ninguna de sus objetivos se han observado directamente dentro de las células cancerosas. También hay prácticamente no hay datos que describen la relación dosis-efecto de la OMP en las células tumorales. Sería de gran interés si este fármaco es eficaz en concentraciones clínicamente aplicables. Por otra parte, a nuestro entender, OMP todavía no se ha utilizado en el tratamiento del cáncer de páncreas, a pesar de que los datos obtenidos en pacientes con show de Zollinger-Ellison que OMP tiene un amplio rango terapéutico y sólo causa efectos secundarios raros y leves, incluso a dosis más altas [ ,,,0],dieciséis]. Por el contrario, otros moduladores de resistencia, como verapamilo [17] o bafilomycin [18] son demasiado tóxicos para su uso clínico.
Teniendo en cuenta la alta quimio-resistencia de las células tumorales pancreáticas, uno de los principales objetivos de nuestro estudio fue determinar si OMP sería eficaz en líneas celulares de cáncer de páncreas. Por lo tanto se investigó la relación dosis-efecto de una y dos dimensiones de OMP solo o en combinación con 5-fluorouracilo (5-FU) o gemcitabina (GEM) en las líneas pancreáticos humanos bien caracterizados de células de cáncer MiaPaCa-2, ASPC-1 , Colo357, Panc1, Panc89 y PancTu1 in vitro [19] - [21]. Nuestros resultados indican que las concentraciones inhibitorias medias (IC
50) de OMP estaban en el rango de aplicabilidad clínica en estas líneas celulares.
En las nuevas investigaciones que utilizamos las dos líneas celulares MiaPaCa-2 y ASPC -1, y, al lado de OMP, el citostático 5-FU con el fin de evaluar la especificidad de los efectos OMP causas dentro de estas líneas celulares.
Se investigaron los cambios subcelulares y moleculares en MiaPaCa-2 y ASPC- 1 en las células tratadas con OMP. Se llevaron a cabo la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones de las células viables (H-NMRS). Se encontró que la modulación de la autofagia es un efecto temprano de la OMP. Por otra parte, el análisis de las fracciones subcelulares que contienen lisosomas y complejos de Golgi por Western blot y la espectroscopia de RMN en sin tratar y células MiaPaCa-2 tratados confirmó que los lisosomas son la principal diana intracelular de OMP en efectos sobre el reciclaje de proteínas y el transporte vías, incluyendo el complejo de Golgi .
Nuestros resultados muestran que OMP inhibió el crecimiento de células de cáncer de páncreas de una manera dependiente de la dosis y, probablemente, a concentraciones no tóxicas en vitro. OMP también mejora los efectos de 5-FU y GEM. La vía de transporte lisosomal se altera tras el tratamiento OMP y la autofagia es, directa o indirectamente, modulada. Por lo tanto, OMP puede proporcionar un nuevo enfoque terapéutico en el tratamiento de cáncer de páncreas.
Resultados
OMP inhibe la proliferación de células de cáncer de páncreas en una forma dependiente de la dosis y aumenta los efectos citostáticos de GEM y 5- FU
las curvas de dosis-efecto de OMP, pantoprazol (PZL), GEM y 5-FU se generaron usando el ensayo de ATP bioluminiscencia. Uno de los objetivos de nuestra investigación fue evaluar la aplicabilidad clínica de OMP. Por lo tanto se determinó la IC
años 50 mediante el ajuste de las curvas a un modelo log-logístico de tres parámetros. El IC
50, que se enumeran en la tabla 1, osciló entre 9-42 g /ml para OMP, 22-99 mg /ml para PZL, 0.004-0.24 mg /ml para GEM y 0.20-0.57 mg /ml de 5- FU dependiendo de la línea celular.
Estas dosis-efecto curvas (Figura 1) mostraron diferencias graduales de sigmoidicidad y otros parámetros farmacodinámicos. Es obvio que en concentraciones más bajas de los medicamentos de la cuenta de células puede ser aún mayor que en el grupo de control respectivo (valores por encima de 1 en la Figura 1) lo que indica un efecto estimulador del crecimiento. Este fenómeno, llamado hormesis, que se define como un reponse overcompensatory de los organismos a diversos factores de estrés [22] de estar, puede dar cuenta de la aparición de resistencia durante la quimioterapia [23].
ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo -357, Panc-1, Panc-89 y PancTu-1 en las células se cultivaron en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de omeprazol, 5-fluorouracilo, gemcitabina o pantoprazol, respectivamente, durante 4 días para determinar la IC
50 valores. El IC
50 IES y los sigmoidicities se diferencian gradualmente entre las líneas celulares. En concentraciones más bajas se observó un ligero efecto estimulante del crecimiento (hormesis).
Por ello, investigó los efectos de la OMP cuando se combina con un citostático en concentraciones más bajas con el fin de evaluar su papel en la quimio-resistencia y superar hormesis . Aditivo, interacciones mutuas sinérgicos o antagonistas de dos fármacos pueden ser cuantificadas dentro de la región cuasi-lineal de la relación dosis-efecto curvas usando el principio de efecto mediano de Chou [24] o el área de superficie de respuesta unificada de Greco et al. [25]. Sin embargo, las interacciones de la combinación de fármacos es difícil de cuantificar de dosis-respuesta relaciones hormetic [26]. Hay varios modelos para evaluar hormesis para un solo tratamiento de drogas [27], [28].
Tabla 2 muestra la fracción afectada (F
u), que es la célula contar relacionada con el control, tras bajas concentraciones de 5-FU y GEM cuando se utilizan como agentes únicos. En ASPC-1, se observaron elevaciones de las células Panc-1 y PancTu-1 significativos de la f
u superiores a 1 sobre 5-FU, lo que indica la hormesis. Por el contrario no había hormesis significativo sobre GEM. Cuando se añade OMP a 5-FU en estas concentraciones, la hormesis se mitiga en el ASPC-1, líneas Panc-1 y PancTu-1 de células (Figura 2). En MiaPaCa-2 células de la OMP y la combinación de 5-FU mostró efectos aditivos, en la línea celular Panc-89 OMP dio lugar a una interacción antagónica. En las células Colo357 no dosis-efecto de la curva se podría establecer debido a grandes errores estándar. GEM y OMP mostraron interacciones aditivas o antagonistas (datos no mostrados).
Las líneas de células ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo357, Panc-1, Panc89 y PancTu1 estaban sin tratar o tratados con 5-FU solo o en combinación con las concentraciones indicadas de OMP para 4 días. A dosis más bajas de 5-FU solo (líneas negras, 0 mg /ml OMP) se observó un crecimiento-estimuladoras efecto (hormesis) en las líneas de células ASPC-1, Panc-1 y PancTu-1. Los puntos de datos muestran las medias de 8 mediciones. Las curvas se montan en estas líneas celulares utilizando el modelo de Cerebro-Cousens (véase la subsección 4.11). En MiaPaCa-2 y células Panc-89 no se produjeron hormesis, estas curvas se ajustaron utilizando un modelo logístico de tres parámetros. En las células Colo357 las curvas no se podrían caber por cualquier modelo farmacodinámico debido a grandes errores estándar a estas concentraciones más bajas (puntos de datos mostrados). Las líneas rojas, verdes y azules indican las curvas de dosis-efecto de 5-FU cuando se añadieron diversas concentraciones de OMP (10, 20 y 40 mg /ml, respectivamente). En ASPC-1 y Panc-1 células la hormesis de 5-FU se invirtió y PancTu-1 de células se mitigado por OMP dependiendo de la concentración de 5-FU. En MiaPaCa-2 células, encontramos una interacción aditiva de 5-FU con OMP. En las células Panc-89 era la interacción antagónica.
Por lo tanto, OMP tiene un efecto antiproliferativo dependiente de la dosis y la in vitro IC
50 de OMP en éstos apoyan la hipótesis de aplicabilidad clínica (que se analiza en la sección de discusión). Sin embargo, la relación dosis-efecto de los fármacos diferente entre líneas celulares. El tratamiento combinado de OMP, ya sea con 5-FU o GEM reveló interacciones aditivas dependientes de la dosis y una mitigación de la estimulación del crecimiento hormetic de bajas dosis de 5-FU en las células Panc89 ASPC-1, Panc1 y. .
cambios específicos línea celular en el pH intralisosomal después del tratamiento de células de cáncer pancreático con OMP y 5-FU solo o en combinación
naranja de acridina se realizó (AO) microscopía de fluorescencia para determinar si OMP aumenta el pH intralisosomal como se describe en informes recientes, ya sea mediante la inhibición de la vATPase [10] o por la acumulación en los lisosomas [11]. ácidas compartimentos celulares se tiñen de color rojo y compartimentos neutros aparecen teñidas de verde por la AO. La inhibición específica de la vATPase por bafilomycin A1 se ha demostrado que conducen a una rápida inhibición de la fluorescencia roja [29], [30].
Los coeficientes de fluorescencia de rojo a verde cuantificados por análisis de imagen cuantitativo para MiaPaCa -2 y células ASPC-1 se muestran en la Figura 3. Los primeros cambios (después de 30 minutos de tratamiento) consistió de una acidez ligeramente superior al tratamiento con 5-FU en las células MiaPaCa-2 y en las células ASPC-1 tratados con OMP o OMP + 5-FU. Después de 24 horas, la acidez lisosomal de MiaPaCa-2 células fue gradualmente, pero suprimió significativamente por OMP, 5-FU y OMP + 5-FU. Sin embargo estas observaciones no se corresponden de manera inequívoca a los informes mencionados anteriormente, ya que el efecto no era específico de OMP. En las células ASPC-1, los tres regímenes de tratamiento dieron lugar a una acidez ligeramente superior después de 24 horas.
naranja de acridina se añadió a la vida no tratadas y células ASPC-1 y MiaPaCa-2 tratados con 5-FU, OMP o la combinación de ambos durante 30 minutos o 24 horas. imágenes microscópicas de vida se tomaron a 525 nm (verde) y 650 nm (rojo) para detectar cambios en el valor de pH lisosomal (tres imágenes por placa, tres placas por grupo). El rojo de relación de fluorescencia verde de los lisosomas de las células tratadas se compararon con los grupos de control por parte de la-Whitney U-test de Mann. Diferencias significativas en comparación con el control están marcados con *. En las células ASPC-1, después de 30 minutos de tratamiento, la acidez intralisosomal aumentó tras el tratamiento con OMP (p: 0,0051) y 5-FU + OMP (p & lt; 0,0001). Después de 24 horas, la acidez se incrementa a todos los regímenes de tratamiento (5-FU - p: 0,0002; OMP - p & lt; 0,00001; OMP + 5-FU - p: 0,037). En las células MiaPaCa-2 la acidez es elevada después de 30 minutos a 5-FU (p: 0,005) y disminuyó después del tratamiento con OMP (p: 0,037), 5-FU (p: 0,00026) y 5-FU + OMP (p: 0,011) después de 24 horas.
por lo tanto concluimos que OMP no causó un cambio constante en el valor de pH intralisosómico de las células de cáncer de páncreas. Sin embargo, una ligera inhibición ocurrió en MiaPaCa-2 células a todos los regímenes de tratamiento después de 24 horas. Por el contrario, ASPC-1 en las células mostraron una mayor acidez lisosomal cuando se tratan con OMP, 5-FU o una combinación de ambos.
Phagophores y autofagosomas acumulan en ASPC-1 y MiaPaCa-2 células después del tratamiento OMP
Hasta ahora, nuestros resultados sugieren que la inhibición vATPase y elevación lisosomal pH no fueron los principales efectos causados por OMP en líneas de células ASPC-1 MiaPaCa-2 y. La microscopía de fluorescencia AO sin embargo, reveló que los lisosomas estaban implicados tanto en OMP- y la inhibición de la proliferación de 5-FU-mediadas. Por lo tanto se examinaron los cambios morfológicos subcelulares después del tratamiento con OMP, 5-FU y la combinación de ambos por TEM.
Figura 4 compara una no tratada ASPC-1 de células (Figura 4 A) con las células tratadas con 160 mg /ml (Figura 4B) y con 80 mg /ml OMP (Figura 4C) durante 24 horas. El tratamiento con 80 mg /ml OMP resultó en la autofagia como se indica por la aparición de los primeros phagophores de copa que contienen material citoplasmático y autofagosomas llenos de vesículas recubiertas (Figura 4C). Después del tratamiento con 160 mg /ml OMP, las células ASPC-1 fueron sometidos a la apoptosis después de 24-48 horas (Figura 4B). No se observaron cambios similares en las células MiaPaCa-2 tratados con 80 mg de OMP /ml incluyendo vacuolización como un signo concomitante de la apoptosis (Figura 4D).
(A) ASPC-1 de células sin tratamiento (800 veces). (B) ASPC-1 de células en la apoptosis en 160 mg /ml OMP después de 24 horas (800 veces). Vacuolización del citoplasma y la condensación del núcleo son visibles. (C) Phagophores y autofagosomas en un segmento de una célula ASPC-1 tratados con omeprazol 80 mg /ml durante 24 horas (ampliación 2800fold). Los phagophores se caracterizan por una forma de copa (flechas blancas). Autofagosomas son partículas cerrados, el número de la que se incrementa en las células tratadas (flechas negras). (D) phagophores temprana y autofagosomas también se encuentran en MiaPaCa-2 células tratadas con OMP 80 g /ml después de 24 horas en una región perinuclear que contienen lisosomas y el complejo de Golgi. En contraste con las células ASPC-1, los primeros signos de apoptosis tales como vacuolización, también están presentes. (E) Barchart de los números de autofagosomas y lisosomas por célula en MiaPaCa-2 y ASPC-1 células no tratadas o tratadas con 5-FU, OMP o la combinación de ambos durante 24 horas con los errores estándar. Diferencias significativas en comparación con el control están marcados con *. En ASPC-1 células se observaron diferencias significativas en comparación con el control en el grupo OMP (p: 0,03) y el grupo OMP + 5-FU (p: 0,03). En MiaPaCa-2 células del grupo 5-FU + OMP difería significativamente de control (p & lt; 0,001).
Aunque phagophores se identifican fácilmente por morfológicas únicas características, autofagosomas, lisosomas, endosomas y no podía autolisosomas distinguirse por TEM. se observaron cantidades significativamente mayores de todos estos organells lisosomas como en las células ASPC-1 tratados con OMP o OMP + 5-FU y en MiaPaCa-2 células tratadas con OMP + 5-FU (Figura 4E).
en resumen, OMP condujo a la acumulación de los marcadores de las primeras etapas de la autofagia (autophagophores) en ambas líneas celulares. Aunque los marcadores de las etapas posteriores, tales como autolisosomas, no podía distinguirse morfológicamente de otras vías de transporte lisosomal, el número total de los orgánulos lisosomas como el aumento en las células ASPC-1 tras el tratamiento con OMP o 5-FU + OMP y en MiaPaCa-2 Las células tratadas con 5-FU + OMP. Estos hallazgos sugieren que, o bien la activación de la proteína volumen de negocios o el menoscabo de la vía de transporte lisosomal ocurrió.
Identificación de los cambios metabólicos en las células viables después del tratamiento con OMP, 5-FU o una combinación de ambos
espectroscopia de RMN de protones de las células viables se realizó en líneas de células ASPC-1 MiaPaCa-2 y con el fin de analizar los procesos bioquímicos asociados con los cambios morfológicos descritos anteriormente. Varios metabolitos intracelulares característicos de bajo peso molecular, tales como ácidos grasos, aminoácidos, fosfolípidos de membrana asociada mebolites y metabolitos del ciclo de glucólisis y citrato intermedios fueron identificados (Figura 5).
Las células fueron cosechadas de cultivo en monocapa, mantenidos y medidos a 20 ° C. Medición se realizaron con un espectrómetro Bruker 600 MHz. Para una mejor visibilidad de la parte del espectro que muestra los protones de los grupos alifáticos está dividido en 2 partes - A y B. (A). parte alifática I. El metilo y grupos metileno ß-y γ- de diversos ácidos grasos y aminoácidos son visibles. Además, isopropanol y tetrachlorethan (el estándar de la concentración externa) se produjeron como contaminaciones. (B) alifáticos parte II. metabolitos de fosfolípidos y los grupos a-metileno de aminoácidos y lactato son visibles. (C) Fórmula de la OMP con numeración de los respectivos protones. Los grupos metilo (1-3, 9) y el grupo metilo (4) están cubiertos por otros metabolitos en las partes alifáticas de espectro. En contraste, los protones aromáticos son visibles (H5, H8, H10). (D) de superposición de las partes aromáticas de diferentes espectros para la identificación intracelular de OMP. El singulet del protón H5 y los dublets de los protones H8 y H10 se puede identificar cuando el medio y los espectros de células se comparan con aquellos sin tratamiento OMP. Su abreviaturas: - histidina, Tyr - tirosina, fenilalanina - fenilalanina, Leu, Ile, Val - leucina, isoleucina, valina. Ala - alanina. Glu - glutamato, Gln - glutamina, PC - fosfatidilcolina, Cho - La colina, GPC - glicerofosfocolina, Tau - taurina, SCYLO -. Scylloinositole
OMP sí se detectó de forma intracelular en ambas líneas celulares después del tratamiento con 80 g /ml durante 24 horas. Las señales de los protones aromáticos H8 y H10 de OMP (Figura 5C) se identifican fácilmente (Figura 5D) en MiaPaCa-2 células. OMP también fue identificado dentro de las células ASPC-1 por el protón H5 (datos no mostrados). Para nuestro conocimiento, este es la primera vez que OMP se ha observado dentro de las células.
Aunque la determinación de las concentraciones intracelulares absolutos por espectroscopía de RMN es generalmente propensa a errores sistemáticos, el cálculo de los coeficientes integrales de diversas señales puede contener información cuantitativa útil sobre las vías metabólicas. Estas rutas metabólicas se muestran como una red muy simplificada para las células ASPC-1 en la Figura 6 y MiaPaCa-2 células en la figura 7. Una línea entre dos señales simboliza una vía metabólica. La línea es de color naranja cuando la relación de intensidad de la señal de las sustancias conectados difiere de la de control con p & lt;. 0.05 y en rojo cuando p es inferior a 0,01
La línea de células ASPC-1 se muestra sin y de diversos regímenes de tratamiento ( OMP, 5-FU o 5-FU + combinación OMP). Los nodos de esta red simbolizan señales de metabolitos, sus colores corresponden a la intensidad relativa de la señal (en comparación con un patrón externo) como se indica en la escala de mapa de calor a continuación. La intensidad de señal está relacionada linealmente con la concentración intracelular. El fondo de los nodos se deja en blanco cuando la intensidad de la señal está fuera del rango indicado por la escala de mapa de calor. Las líneas entre las cajas simbolizan simplifican fuertemente vías metabólicas. Los colores de estas líneas indican diferencias significativas de las relaciones de intensidad de señal de los metabolitos conectados en comparación con el grupo control cuando naranja (p & lt; 0,05), líneas rojas indican p & lt; 0,01. Los cambios más evidentes es que la relación PC /Cho es significativamente menor en el grupo OMP en comparación con el grupo control. A 5-FU, el Cho /disminución de la relación acetato es el único cambio significativo. En el grupo + OMP 5-FU, hay varios cambios significativos, i.e.the relación /CH = CH FACH2 es significativamente mayor. Además, la relación Cho /Acetato cambió a 5-FU + OMP como en el grupo de 5-FU, sino también la relación de citrato /GSH. Los efectos bioquímicos celulares implican principalmente el ácido graso y el metabolismo de fosfolípidos que señala a la membrana anabolismo. Abreviaturas: Gln - glutamina, Ala - alanina, PC - fosfatidilcolina, Cho - La colina, LAC1 + FACH2 - señal de grupo metilo de los grupos de lactato y metileno de los ácidos grasos, Lac2 - grupo metileno de lactato, CH = CH - protones de los grupos methin de los ácidos grasos insaturados.
La línea celular se muestra sin y después de varios regímenes de tratamiento (OMP, 5-FU o 5-FU + combinación OMP). Los nodos de esta red simbolizan señales de metabolitos, sus colores corresponden a la intensidad relativa de la señal (en comparación con un patrón externo) como se indica en la escala de mapa de calor a continuación. La intensidad de señal está relacionada linealmente con la concentración intracelular. El fondo de los nodos se deja en blanco cuando la intensidad de la señal está fuera del rango indicado por la escala de mapa de calor. Las líneas entre las cajas simbolizan simplifican fuertemente vías metabólicas. Los colores de estas líneas indican diferencias significativas de las relaciones de intensidad de señal de los metabolitos conectados en comparación con el grupo control cuando naranja (p & lt; 0,05), líneas rojas indican p & lt; 0,01. Tras la OMP, el PC /ratios de Cho son significativamente más bajos en comparación con el control. Además, la relación de etilo /FACH2 se reduce significativamente en el grupo OMP. Este último también mostró un mayor nivel de CH = CH, la relación a FACH2 es, sin embargo, disminuyó. A 5-FU y 5-FU + OMP, se pudieron observar cambios similares. Además, en contraste con las células ASPC-1, la vía Ala /Gln /AMP está también involucrado. Abreviaturas: Gln - glutamina, Ala - alanina, PC - fosfatidilcolina, Cho - colina. LAC1 + FACH2 - señal de grupo metilo de los grupos de lactato y metileno de los ácidos grasos, Lac2 - grupo metileno de lactato, CH = CH -. Protones de los grupos de ácidos grasos insaturados methin
graso unido a la membrana los ácidos son generalmente RMN-visible sólo cuando se utiliza el ángulo mágico-Spinning (MAS) técnica [31]. En cambio, el ácido graso poliinsaturado móvil grupos (PUFA) (viz. El CH = CH en 5,3 ppm o CH = CHCH2CH = CH en 2,8 ppm), que se han asociado con la formación de lípidos cae en autofagosomas durante la autofagia y la muerte celular programada (PCD) [32], llegó a ser prominente en los espectros de RMN de protón de MiaPaCa-2 células tratadas con OMP o 5-FU + OMP. Además se observó un aumento en los grupos de metileno de ácidos grasos (FACH2) en comparación con el acetato en OMP y tratamiento con 5-FU + OMP en MiaPaCa-2-, pero no en células ASPC-1. Esto se correlaciona con los datos de microscopía electrónica que muestra que los cambios morfológicos asociados con la autofagia se acompañan de vacuolización que apunta al inicio de la apoptosis en MiaPaCa-2, pero no las células ASPC-1, a 80 mg /ml OMP.
Cho y fosfocolina (PC) son las señales de indicadores de crecimiento en las células humanas, por lo cual PC elevada se asocia con la rápida proliferación y el comportamiento maligno [33] - [35]. La supresión de PC puede ser causada por la colina quinasa y la fosfolipasa C y regulación a la baja de la fosfolipasa A2 de inducción que conduce a la inhibición de la proliferación [36]. En nuestro estudio, PC significativamente fue suprimido en comparación con Cho en células MiaPaCa-2 tratados con OMP, 5-FU y 5-FU + OMP y en células ASPC-1 tratados con OMP solo.
En conjunto, estos datos muestran que el ácido graso y señales de metabolitos de fosfolípidos cambiaron tras el tratamiento OMP. Aunque no se observaron cambios similares en ambas células ASPC-1 y MiaPaCa-2, estos cambios fueron más reforzada en MiaPaCa-2 células, especialmente con respecto a los cambios de la señal que indica inhibió la proliferación (PC) y CPD (PUFA). Esto corresponde a los cambios farmacodinámicos y morfológicas descritas anteriormente. Sin embargo, en MiaPaCa-2 células de los efectos bioquímicos no se limitan al tratamiento OMP, pero también se produjeron en 5-FU y 5-FU + OMP y por lo tanto no pueden ser consideradas para ser específicos de OMP.
Implicación de los lisosomas y el complejo de Golgi en la respuesta celular a OMP
objetivos subcelulares potenciales de OMP fueron identificados mediante el aislamiento de organelos de MiaPaCa-2 células por centrifugación de densidad. Como se muestra en la Figura 8, la primera y segunda fracciones de densidad contenían principios y finales de los endosomas y lisosomas que fueron identificados por anticuerpos catepsina-D (Figura 8B) LAMP-1 y en el grupo control. En el grupo tratado OMP, se encontró que estas proteínas sólo en la primera fracción. La tercera fracción del grupo de control contenía el complejo de Golgi, como se indica por el anticuerpo β-COP. Sin embargo, la expresión de esta proteína disminuye tras el tratamiento OMP. Los espectros de RMN de protón de estas fracciones se muestran en las figuras 8A y 8C. La Figura 8A muestra las asignaciones de señales que comparan los espectros de estas fracciones (llamado F1-F3) a las de iodixanol (Optiprep), y una fracción de células lisosomal de las células sin tratar (F1 *), que se lavó con PBS una vez después de la ultracentrifugación (en contraste a las fracciones F1-F3, que se lavaron dos veces). Iodixanol se produjo en todas las fracciones, pero disminuyó después de lavar los ultracentrifugates dos veces. Esto apunta a la incorporación parcial de iodixanol en las membranas o el lumen de los orgánulos. La mayor parte de las sustancias de menor peso molecular solubles en agua se redujo también en F1-F3, tales como lactato y citrato, en comparación con F1 *, que apuntaba a un fracaso. La integridad de los orgánulos se autentificado mediante el uso de un estándar externo (tetrachlorethan) para la calibración del desplazamiento químico. Hubo un cambio dependiente del pH de las señales de citrato a la acidificación en las fracciones lisosomales en comparación con las suspensiones de células enteras.
(A) Superposición de los fragmentos del espectro de RMN de protón de las siguientes suspensiones (de arriba a abajo) : primera (lisosomal) fracción sin tratar de células después de ultracentrifgation y uno de lavado (F1 *), iodixanole (Optiprep) la suspensión, inferior (F3), medio (F2) y la fracción superior (F1) de los ultracentrifugates después de dos lavados. Los desplazamientos químicos de los espectros fueron calibrados a la señal de colina /fosfatidilcolina (Cho /PC). Aparte de iodixanol, que podríamos identificar los grupos de PUFA (grupos metileno situados entre dos grupos CH = CH), Cho /PC y glicerofosfocolina (GPC) en la F1 * y F1-3. Además se observó lactato y los grupos metileno de ácidos grasos (en 1,3 ppm), el citrato de (al 2,55 y 2,7 ppm) y fosfoetanolamina (a 3,1 ppm) en el F1 *, pero no en los grupos F1-F3 .. (B) Western el análisis de transferencia de LAMP-1, un marcador endosoma tardío, que se distribuyó casi idéntica en las dos primeras fracciones en comparación con catepsina-D, en el grupo controle, pero ocurrio sólo en la primera fracción en el grupo tratado OMP. β-COP como un indicador de la Golgi-complejo, se encuentra fuertemente en la fracción inferior en el grupo control, pero muy débilmente en el grupo tratado OMP. La catepsina - D, un marcador endosoma temprano, que se puede encontrar en la fracción superior y media del grupo de control, pero en relación con el grupo de OMP, se sólo se encuentra en la primera. (E) de superposición de espectros de RMN de todas las fracciones de control y OMP. La diferencia más relevante es el destete de la señal de GPC después del tratamiento OMP en la 1ª fracción después de sólo 6 horas.
En contraste con el espectro total de células (véase la figura 5B), glicerofosfocolina (GPC) era encontrado en la primera fracción (lisosomal). Al comparar el control para el grupo tratado con OMP (Figura 8C), la señal de GPC disminuido claramente tras el tratamiento OMP. Además, un aumento en PUFAs en el grupo tratado con OMP fue confirmada (Figura 8C) en forma análoga a todo el espectro de la célula. OMP no pudo ser identificado en cualquiera de estas fracciones y, por tanto, probablemente no se acumula en los lisosomas o en el complejo de Golgi. Esto pone de relieve el hallazgo de que las fracciones endosoma y lisosomas sufrieron cambios anabólicos OMP durante el tratamiento (que corresponde a los datos de TEM). Sin embargo, el complejo de Golgi, como parte sustancial del sistema de transporte lisosomal, también está involucrado.
Determinación de la actividad de autofagia
Se realizó el análisis de transferencia Western-LC3 para detectar cambios en la expresión de LC3 . La expresión LC3-gen se correlaciona bien con el número de autofagosomas [37], [38]. Además dos fracciones por lo general se pueden diferenciar - LC3-I y LC3-II. Los primeros occures en autophagophores y se considera un indicador de la inducción de la autofagia, este último está contenido dentro de los autofagosomas y se degrada, después de su fusión con los lisosomas, en autolisosomas. [10]. [61].