Extracto
A pesar de las remisiones alcanzables con la terapia hormonal de primera línea en pacientes con cáncer de próstata (CaP), la enfermedad se escapa de la fase dependiente de hormonas a un estado más agresivo donde la quimioterapia es el único tratamiento eficaz y el tratamiento no es curativo. Esto hace que sea muy importante para identificar nuevos objetivos que pueden mejorar el resultado del tratamiento. ATM y DNA-PK son los dos quinasas responsables de la señalización y la reparación de roturas de la cadena doble (DBL). Por lo tanto, ambas quinasas son objetivos pertinentes en el tratamiento de CaP para potenciar la actividad de los numerosos DNA DSB agentes utilizados en el tratamiento de CaP como la radiación (IR) ionizante induce. ensayo de formación de colonias se utilizó para evaluar la sensibilidad de la hormona dependiente, p53 en peso (LNCaP) y la hormona mutante p53 independiente (PC3) líneas de células de CaP al efecto citotóxico de IR y doxorrubicina en presencia o ausencia de Ku55933 y NU7441 que son pequeñas molécula inhibidores de la ATM y DNA-PK, respectivamente. Flujo de métodos basados en citometría se utilizaron para evaluar el efecto de los dos inhibidores de ciclo celular, apoptosis y H2AX formación de focos. ensayo cometa Neutral se utilizó para evaluar la inducción de ADN DSBs. Ku55933 o NU7441 sí sola el aumento de la sensibilidad de las líneas celulares de cabeza en los agentes que dañan el ADN, sin embargo, la combinación de ambos inhibidores juntos dado lugar a una mejora adicional de la sensibilidad. El perfil del ciclo celular de las dos líneas celulares se alteró con un aumento de la muerte celular, el ADN DSBs y H2AX formación de focos. En este estudio se justifica una nueva evaluación de los inhibidores de la ATM y ADN-PK para su aplicación clínica en pacientes con NAC. Además, el efecto aumentada que resulta de combinar ambos inhibidores puede tener una implicación importante para el tratamiento de pacientes con NAC que tienen un defecto en una de las dos vías de reparación del OSD
Visto:. Shaheen FS, Znojek P, Fisher A , Webster M, Plummer R, Gaughan L, et al. (2011) Orientación de la maquinaria de reparación del ADN rotura del filamento doble en el cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e20311. doi: 10.1371 /journal.pone.0020311
Editor: Kerstin Borgmann, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: 18 Enero, 2011; Aceptado: 28 de abril de 2011; Publicado: 23-may 2011
Derechos de Autor © 2011 Shaheen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Aga Khan, www.akdn.org/AKF, CRUK, CancerResearchUK.org, MRC, www.mrc.ac.uk, y AICR, www.aicr.org.uk. . Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Uno de los autores, Graeme C. M. Smith, es empleado de una empresa comercial, KuDOS Pharmaceuticals Ltd., Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, Reino Unido. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales.
Introducción
De acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud U.S, la tasa de incidencia ajustada por edad de cáncer de próstata 2003-2007 fue 156,9 por 100.000 hombres por año. Aunque altas tasas de respuesta pueden ser alcanzados por la terapia de primera línea con cirugía, radioterapia, antiandrógeno o sus combinaciones; el progreso natural de la enfermedad es hacia la hormona estado refractario [1], donde la quimioterapia es el tratamiento más eficaz, pero todavía no curativa [2]. Esta resistencia se destaca la importancia de identificar nuevas dianas que pueden aumentar la sensibilidad de las células de CaP y por lo tanto las tasas de respuesta y la supervivencia global de los pacientes. La ataxia telangiectasia mutada (ATM) y la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) son miembros de las quinasas de fosfatidilinositol 3-quinasa relacionada (PIKK) superfamilia. Los miembros de esta familia se caracterizan por su alto peso y la similitud de secuencia molecular de la subunidad p110 de lípido quinasa PI3-quinasa [3]. En células de mamíferos, ATM y DNA-PK juegan un papel clave en la respuesta de ADN de doble filamento romper (OSD), a través de recombinación homóloga (HR) y la recombinación no homóloga (NHEJ), respectivamente [4], [5]. fosforilación rápida tanto de ATM y DNA-PK se produce en respuesta a OSD siguiente insultos endógenos o exógenos. Una vez activado, cajero automático y señal de DNA-PK a un amplio espectro de objetivos de abajo que están involucrados en el proceso de reparación, la regulación del ciclo celular y la apoptosis [6]. La elección de la vía de reparación del OSD es la fase del ciclo celular dependiente, con NHEJ siendo la vía dominante en G0 y G1, y HR domina en S y G2 /M fases [7]. ATM y DNA-PK se escinden por la caspasa 3 una vez que la decisión de activar la apoptosis se hace en la célula y este evento de escisión se cree que facilitar la apoptosis mediante la desactivación de la maquinaria de señalización y reparación del ADN [8], [9]. inhibidor de PI3K tradicional, wortmannin con generalmente baja selectividad frente a diferentes clases y /o isoformas de PIKK se ha utilizado ampliamente para estudiar ATM y DNA-PK vías de señalización [10]. Ku55933 fue identificado como un inhibidor competitivo de ATP potentes y específicos de ATM (IC
50 13 nmol /L) con respecto a la inhibición de otros miembros de la familia PIKK. Ku55933 aumentó la sensibilidad de las células de cáncer de mama a IR, altera su perfil del ciclo celular, y se inhibe la fosforilación de un panel de objetivos ATM. A las células-T no mostraron estos efectos cuando son tratados con Ku55933 [11]. NU7441 se identificó como un inhibidor competitivo de ATP potentes y específicos de DNA-PK (IC
50 14 nmol /L) con una selectividad de 100 veces para el ADN-PK en relación con otros miembros de la familia PI3KK. NU7441 aumentó la sensibilidad de las células de cáncer de colon a los inhibidores de IR y de la topoisomerasa II, y alteró su perfil del ciclo celular. V3 células deficientes ADN-PK no mostraron estos efectos cuando son tratados con NU7441 [12]. Este estudio fue diseñado como una evaluación preclínica de ambos inhibidores de la ATM y ADN-PK para investigar si estos inhibidores pueden mejorar la eficacia de los agentes inductores de ADN OSD para el tratamiento de la PAC.
Materiales y Métodos
Químicos
Todos los productos químicos eran de rutina de compra de Sigma salvo que se indique lo contrario. NU7441 se sintetizó en el Instituto de Investigación del Cáncer del Norte, la Universidad de Newcastle (Newcastle upon Tyne, Reino Unido), en colaboración con KuDOS Pharmaceuticals (Cambridge, Reino Unido). KU-55933 fue una especie de regalo de felicitaciones farmacéuticos. Tanto los inhibidores se disolvieron en DMSO a una concentración de stock de 2000 × la concentración final requerida para el experimento. La doxorrubicina se disolvió en agua a una concentración de stock de 1000 × la concentración final requerida para el experimento. Todos los compuestos se almacenaron en alícuotas a -20 ° C.
Cultivo de células
hormonales LNCaP sensible (p53 de tipo salvaje) y de la hormona PC3 insensibles (null) p53 líneas celulares de CaP fueron adquiridos de ATCC y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% (v /v) de FCS. Ambas líneas celulares fueron rutinariamente para detectar Mycoplasma.
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a diferentes densidades. Después de permitir que adjuntar, las células se incubaron con Ku55933 (10 M) solo o en combinación con NU7441 (1 M) durante 1 h antes de que cualquiera de irradiación (0-2 Gy) o tratamiento con doxorubicina (0-75 nM). 24 h más tarde, los pocillos se lavaron suavemente dos veces con PBS caliente antes de añadir medio fresco y se devolvieron a la incubadora durante 7-10 días para células PC3 y 12-14 días para las células LNCaP para formar colonias. Las colonias se fijaron con fijador de Carnoy, se secó, se tiñeron con 0,4% de cristal violeta y se cuentan manualmente. El factor de reducción de la supervivencia se calculó como la fracción de supervivencia de células en ausencia de los inhibidores, dividida por la fracción superviviente de las células en presencia de inhibidores para cualquier dosis dada o la concentración de agente citotóxico.
método de flujo basado en citometría de para el ciclo celular
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos. 24 h después, las células se trataron con 1 M NU7441 y /o 10 mM Ku55933 antes del tratamiento IR o doxorrubicina. 48 h más tarde, se recogieron las células en tubos de FACS (Becton & amp; Dickinson, Oxford Reino Unido) mantener el medio de crecimiento antes de ser teñidas con yoduro de propidio (PI). Las muestras se analizaron directamente en un FACScan (Becton & amp; Dickinson)., La intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias se representó en histogramas, y las fases del ciclo celular se determinaron usando WinMDI Versión 2.8 (El Instituto de Investigación Scrrips, EE.UU.)
el flujo basado en el método de citometría de caspasa activa 3
las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con los inhibidores y /o agente que daña el ADN tal como se describe anteriormente y se recogió en tubos de FACS que mantienen el medio de crecimiento. Las células se tiñeron con anticuerpo conjugado con FITC activa la caspasa 3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Becton Dickinson, Oxford Reino Unido) y se analizaron directamente en un FACScan. La intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias se representó gráficamente en diagramas de puntos, y la intensidad de fluorescencia media se calculó usando WinMDI version2.8.
de flujo basado en el método de citometría de formación de focos γ-H2AX
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, se trató con los inhibidores y /o agente que daña el ADN tal como se describe anteriormente y se recogió en tubos de FACS. Las células se tiñeron con anticuerpo conjugado con FITC γH2AX como se describe anteriormente [13]. Las muestras se analizaron directamente en un FACScan. La intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias se representó en histogramas, y la intensidad de fluorescencia media se calculó utilizando version2.8 WinMDI.
se prepararon Western Blot
Extractos de células enteras 6 h después de 1 mM y 1 doxorrubicina h después de 10 Gy IR en presencia y ausencia de los inhibidores. cantidades equivalentes de lisado de células se cargaron en 4,5, 6, 12 y 15% en geles junto a un marcador de proteína SeeBlue® Pre-Stained Standard (Invitrogen, EE.UU.). Los geles se sometieron a electroforesis y las proteínas se transfirieron a una membrana Hybond-C. ECL-sistema (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) se utilizó para detectar las proteínas conjugados de anticuerpos de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se visualizaron por exposición a película de rayos X (Kodak, Herts, UK). Anti DNA-PK, anti ATM, anti DNA-PK
Ser2056 y anti DNA-PK
Thr2906 fueron adquiridos de (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Lucha contra el cajero automático
Ser1981, anti H2AX
Ser139 y anti p53
Ser15 se adquirieron de (Gen Tex, EE.UU.), (Upstate, Reino Unido) y (Señalización celular, Reino Unido), respectivamente.
neutro ensayo cometa
PC3 fueron sometidos a la prueba del cometa neutra de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Se aplicaron dos modificaciones principales, las células se lisaron durante 1 h y a electroforesis durante 30 minutos a 30 V. Los cometas se visualizaron por fluorescencia Leica DMR microscopio y se analizaron usando Komet 5,5 (imágenes cinética Ltd, Nottingham, Reino Unido).
análisis estadístico
El análisis estadístico se aplicó utilizando el software prisma version4 (GraphPad Prism, San Diego, EE.UU.).
resultados
Ku55933 y NU7441 inhibir la ATM y DNA-PK quinasa actividad, respectivamente, en las células de CaP IR y tratados con doxorubicina
cajero automático que dependen ATM
Ser1981, fueron inducidos p53
Ser15, H2AX
Ser139 y DNA-PK
Thr2609 fosforilación 1 h después de 10 Gy y 6 h después de 1 M doxorrubicina y fueron inhibidas por Ku55933. IR inducida DNA-PK
Ser2056 fosforilación (reportado como sitio de autofosforilación DNA-PK) fue inhibida por NU7441 (como se esperaba) y, sorprendentemente, doxorubicina inducida DNA-PK
fosforilación Ser2056 fue también inhibida por Ku55933. NU7441 no inhibió ATM
Ser1981, p53
Ser15, H2AX
Ser139 y DNA-PK
Thr2609 fosforilación (Figura 1).
extractos de células LNCaP entero se prepararon después de 1 h 10 Gy y 6 horas después de la doxorrubicina 1 M ± NU7441 10 M Ku55933 o 1 mM. Los extractos se analizaron por transferencia de Western y se sondearon con los anticuerpos indicados. Datos es una representativos de tres experimentos independientes.
Ku55933 y NU7441 son citotóxicos para las células de CaP mínimamente
Con el fin de determinar la citotoxicidad intrínseca de Ku55933 y NU7441 en relación con la quimioterapia y la radiosensibilización , las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de Ku55933 o NU7441 con la concentración mínimamente citotóxica de IR (1 Gy) o doxorrubicina (10 nM). Tanto Ku55933 (10 mM) y NU7441 (1 M) causaron mínima o ninguna citotoxicidad en células LNCaP (Figura 2A & amp; B) y PC3 (Figura 2 C & amp; D). Cada inhibidor aumentó significativamente IR y la citotoxicidad doxorrubicina en ambas líneas celulares de CaP en una manera dependiente de la dosis del inhibidor. Estos dos concentraciones (10 M Ku55933 o 1 M NU7441) se utilizaron en experimentos posteriores
LNCaP (A & amp; B). O PC3 (C & amp; D) células se sembraron en diferentes densidades y se dejan unir antes de 1 h la incubación con concentraciones variables de Ku55933 o NU7441 antes de la irradiación 1 Gy o 10 tratamiento con doxorubicina nM durante 24 h (
P
& lt; 0,001). LNCaP (E & amp; F) o PC3 (G & amp; H), las células fueron sembradas en diferentes densidades y se dejan unir antes del 1 h de incubación con Ku55933 (10 M) o NU7441 (1 mM) antes del tratamiento con dosis IR variables o concentración de doxorubicina para 24 h (
P Hotel & lt; 0,001). Todos los resultados son la media de tres experimentos independientes ± SEM.
Ku55933 y NU7441 reducen las líneas de células de CaP supervivencia celular en respuesta a la IR o doxorrubicina
Después de haber demostrado una quimioterapia dependiente de la concentración y radiosensibilización en ambas líneas celulares, entonces investigó la respuesta a una concentración fija de cada inhibidor con el aumento de concentraciones de doxorrubicina o dosis IR. Hubo una disminución dependiente de la dosis en la supervivencia celular en respuesta a IR. células PC3 muestran resistencia a la IR en comparación con LNCaP, combinando NU7441 o Ku55933 con IR redujo significativamente la supervivencia de las células de LNCaP (Figura 2E) y sustancialmente para PC3 (Figura 2G). Del mismo modo, doxorubicina reduce la supervivencia celular en ambas líneas celulares, más quimio-sensibilización resultado de la combinación de NU7441 o Ku55933 en LNCaP (Figura 2F) y PC3 (Figura 2H). La combinación de ambos inhibidores significativamente el aumento de la quimio-radiosensibilización y NU7441 combinación fue más eficaz en la inducción de quimiosensibilizar en LNCaP mientras que la combinación Ku55933 tuvo un mayor efecto en la inducción de radiosensibilización en PC3 que sugiere un papel para ATM avanzado en el modelo refractario hormonal.
Ku55933 y NU7441 alteración del ciclo celular y aumentó su apoptosis en respuesta al daño del ADN en las líneas celulares de CaP
a continuación se determinó si el aumento de la sensibilidad de líneas de células de CaP es acompañado por aumento de la apoptosis o cambios en el perfil del ciclo celular. IR causada mínimo /no aumento de LNCaP (Figura 3A) en comparación con un aumento dependiente de la dosis en acumulación de G2 en PC3 (Figura 3B). Además, la combinación de ambos inhibidores tenía un efecto aditivo sobre la acumulación G2 a baja dosis (2 Gy), pero no a alta dosis (10 Gy). las células de tratamiento causado doxorrubicina se acumulen en G2 /M, especialmente a altas dosis. En general, la combinación ya sea con un inhibidor de la doxorrubicina dosis baja (20 nM) aumentó la acumulación G2 /M, aunque NU7441 tenía sólo un efecto modesto en células LNCaP (Figura 3C). Considerando que la combinación de inhibidores solo a alta dosis de doxorrubicina (200 nM) dio como resultado un aumento notable en subG1 en LNCaP (Figura 3C) en comparación con un aumento interesante en G1 en células PC3 (Figura 3D). Se observó un efecto aditivo cuando se combinan ambos inhibidores
LNCaP (A & amp; C). y PC3 (B & amp; D) las células se incubaron con Ku55933 (10 M) y /o NU7441 (1 M) antes de ser expuesto a las dosis indicadas de IR o doxorrubicina durante 48 h y luego se tiñeron con PI y se analizaron directamente en FACscan. Los datos son representativos a tres experimentos independientes. Se trataron células LNCaP (E) y PC3 (F) como se describió anteriormente y se tiñeron con anticuerpo FITC-conjugado anti caspasa 3 antes del análisis directo en FACScan. Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± SD.
IR indujo una muerte celular dependiente de la dosis en ambas líneas celulares. apoptosis LNCaP se mejoró al combinar Ku55933 y /o NU7441 (Figura 3E). Sin embargo, la muerte celular PC3 (Figura 3F) se incrementó en respuesta a las combinaciones de inhibidores en única dosis baja. El aumento de la apoptosis causada por la combinación de ambos inhibidores es consistente con los datos de supervivencia que muestran la radio-sensibilización fue más pronunciada para las dos líneas celulares tratados con ambos inhibidores juntos. Además, Ku55933 indujo una mayor muerte celular en células PC3 en comparación con NU7441, que era una observó consistentemente efecto de Ku55933 en la supervivencia de las células PC3 irradiados. La doxorrubicina causó un aumento dependiente de la dosis en la actividad de caspasa 3 en ambas líneas celulares. Combinando Ku55933 y /o NU7441 con 20 nM doxorrubicina mejoró la muerte de las células del LNCaP (Figura 3E) y células PC3 (Figura 3F). Un aumento masivo de LNCaP apoptosis resultado de Ku55933 y /o NU7441 combinado con doxorrubicina 200 nM, 95 a 99% de las células fueron positivas para caspase3 activo, mientras que no se detectó ningún aumento en PC3 en las mismas condiciones.
Finalmente , los datos de la apoptosis es consistente con los datos de supervivencia como la inducción de la apoptosis masiva se correlaciona con la reducción severa en la supervivencia celular a altas dosis de doxorrubicina. Además, NU7441 fue superior a la Ku55933 en la inducción de apoptosis en células LNCaP. Considerando que, Ku55933 tuvo mayor efecto en las células PC3 que es consistente con los datos de supervivencia.
Ku55933 y NU7441 aumentar la inducción de DSB de ADN en líneas celulares de CaP
Hemos investigado si el aumento de células de CaP sensibilidad líneas en respuesta a la ATM y /o la inhibición de ADN-PK es un resultado de aumento del número de ADN DSBs por una medida directa de la señal de H2AX y una medida directa de DNA DSB (ensayo cometa neutral). Como se preveía γ-H2AX señal aumentó 0,5 horas después de la RI en ambas líneas celulares y volvió a niveles normales dentro de 4 h en células LNCaP (Figura 4A), mientras que sólo se redujo en un 50% en las células PC3 (Figura 4B) que sugieren una mayor capacidad de reparación en LNCaP en comparación con PC3. el tratamiento con doxorubicina causó aumento dependiente del tiempo en γ-H2AX en LNCaP (Figura 4C) y PC3 (Figura 4D). La combinación de cualquiera de Ku55933 o ambos inhibidores, ya sea con IR o doxorrubicina redujo la señal de γ-H2AX en ambas líneas celulares en todos los puntos de tiempo examinados, que es consistente con ATM siendo la principal quinasa responsable de la fosforilación H2AX y la incapacidad de DNA-PK para fosforilar H2AX en la presencia de ATM inhibido. NU7441 inhibió moderadamente la inducción γ-H2AX inicial en ambas líneas celulares después de IR y doxorrubicina. Sin embargo, en momentos posteriores inhibir la DNA-PK produjo un aumento de la señal de γ-H2AX lo que refleja un aumento de las DSB de ADN destacados por γ-H2AX, una consecuencia de la fosforilación por el cajero automático activo. Digno de mención, en experimentos en los que ambas quinasas se inhibieron no hubo más aumento de la señal H2AX. células PC3 mostraron un pequeño aumento en el cometa cola momento 24 h después de IR o doxorrubicina que refleja su alta capacidad de reparar sus lesiones daño del ADN. Sin embargo, la combinación de ambos, ya sea con inhibidor agente que daña el ADN causado aumento modesto en el momento de la cola. La combinación de ambos inhibidores había un aumento aditivo en el momento de la cola (Figura 4E)
LNCaP (A & amp; C). Y PC3 (B & amp; D) las células fueron tratadas con 10 Gy o 1 M doxorrubicina siguiente 1 h de incubación con Ku55933 (10 M) y /o NU7441 (1 M) y se tiñeron con anticuerpo conjugado con FITC H2AX antes de ser analizadas directamente en FACscan. Los resultados son la media de al menos 5 experimentos independientes ± SEM. PC3 (E) las células se trataron como anteriormente durante 24 h y se analizaron usando el ensayo de cometa, 50 células se contaron por tratamiento brazo. Los resultados son la media de 3 experimentos independientes ± SEM
Cabe señalar que el aumento resultante del tratamiento con doxorubicina fue mayor en comparación con la que resulta de IR.; Esto podría ser en parte relacionada con el hecho de que el IR induce principalmente de un mayor nivel de roturas de cadena individuales.
Discusión
Ku55933 y NU7441 son potentes inhibidores de la ATM y DNA-PK, respectivamente. Cada inhibidor abolió la autofosforilación de su propia proteína diana en ambas líneas celulares de CaP siguiente IR. Los datos con tratamiento de doxorrubicina fue similar entre las dos líneas celulares, pero la fosforilación de la DNA-PK
Ser2056 no parece ser inhibida por NU7441. Cabe destacar que la fosforilación de los objetivos de abajo H2AX
Ser139 y p53
Ser15 que están regulados principalmente por ATM fue abolida cuando se combinaron ambos inhibidores. Por otra parte, se informó aquí un novedoso evento de fosforilación como la fosforilación de Ser2056 de DNA-PKcs, se cree que es un verdadero sitio de autofosforilación de DNA-PK [14], se redujo después del tratamiento Ku55933 (no NU7441) en respuesta a la doxorrubicina, pero no IR tratamiento sugiriendo este sitio podría ser el blanco de ATM, dependiendo del agente de inducción de daño en el ADN. Un control pertinente sería para agotar nativa ATM y sustituirlo con un ATM quinasa muerta.
La combinación de cualquiera de inhibidor con IR o doxorrubicina dado lugar a un aumento masivo y significativo en la sensibilidad de las células LNCaP y PC3 a la citotóxico efecto tanto de IR y doxorrubicina. Además, la combinación de los dos inhibidores junto con agentes que daña el ADN resultó en una mejora adicional en la citotoxicidad en comparación con la combinación única inhibidor. Esto coincide con la literatura reportada en la orientación ATM y DNA-PK utilizando la metodología siRNA indicó incremento de la sensibilidad a la IR y la quimioterapia en diferentes líneas celulares tapa [15]. El aumento de la sensibilidad resultante de la combinación de dos inhibidores podría tener una implicación importante para el tratamiento de la NAC en pacientes con un defecto en la AR o NHEJ vías tales como los portadores de mutaciones BRCA [16]. Los pacientes con defectos en una vía de reparación potencialmente podrían ser tratados con el inhibidor de la otra vía y beneficiarse de resultado máximo el tratamiento con toxicidad mínima.
Aquí, una característica importante del ciclo celular PC3, la falta de función de p53, dado lugar a un aumento de la acumulación en la fase G2 /M del ciclo celular en presencia de ATM, DNA-PK o ambos inhibidores particularmente cuando se combina con el tratamiento con IR. Sin embargo, la inhibición de cualquiera de ATM o ADN-PK o ambos en combinación con el tratamiento con doxorubicina alta dosis aumentó la acumulación de la fase G1, lo que sugiere la activación del punto de control de G1 por otras vías tales como la p38MAPK /MK2 [17]. En presencia de p53 funcional (células LNCaP), las células acumuladas en la fase M /G2 cuando ATM se inhibió mientras se acumulan en G1 cuando el ADN-PK se inhibió. Esto podría explicar los datos de supervivencia ya que la acumulación en G2 permitiría más la reparación del ADN mediada por NHEJ. Estos datos apoyan los informes previos que sugieren que el efecto de DNA-PK en p53 contribuye al proceso de apoptosis en lugar de control del ciclo celular. Es interesante que la inhibición de ATM conduce a la acumulación G2 que puede explicarse por el efecto de la quinasa ATR activo en ausencia de activo ATM quinasa [18]. Curiosamente, la combinación de cualquiera de inhibidor o la combinación inhibidor dual con doxorrubicina dosis alta (daño en el ADN excesiva) dio como resultado un aumento dramático en la población subG1, una indicación de la apoptosis. Esto sugiere que la presencia de p53 puede desencadenar la muerte celular cuando el daño en el ADN es demasiado sustantivo a ser reparado. Nuestros datos son consistentes con un papel para ATM y DNA-PK en la regulación del ciclo celular a través de su efecto sobre diferentes proteínas [19].
En este estudio, el efecto de la inhibición de ATM o DNA-PK en la muerte celular líneas de células de CaP revelaron que, independiente del estado de p53 o la dependencia de la hormona, esta inhibición aumentó la muerte celular programada inducida por bajas dosis de doxorrubicina o IR. Sin embargo, la presencia de p53 (células LNCaP) aumentó considerablemente la población apoptótica con doxorrubicina dosis alta. Considerando que, en ausencia de p53 (células PC3) se produjo o bien ninguno o un pequeño aumento en la muerte celular con doxorrubicina alta dosis que es consistente con el aumento observado en la detención del ciclo celular. La apoptosis más pronunciada en PC3 en comparación con LNCaP a dosis bajas de daño en el ADN podría explicarse por el período de tratamiento más corto (48 h) para LNCaP en comparación con (96 h) para células PC3.
Se observó que la inducción primaria de H2AX focos se redujo sustancialmente mediante la combinación de uno o ambos inhibidores con agentes que dañan el ADN. En puntos de tiempo posteriores, la formación H2AX focos estaban siendo inhibida en los grupos de combinación de inhibidores de ATM, mientras que aumentó en los brazos inhibidores de ADN-PK. Esto implica que la inhibición de ADN-PK aumenta las DSBs de ADN que se destacan por el aumento de número de focos H2AX formado en el sitio de daño. Sin embargo, la disminución de la formación de focos H2AX en los brazos inhibidor de la ATM no es una consecuencia de las DSB menos que se generan a medida que demostró una mayor DSB de ADN mediante el ensayo cometa neutro. Esto es coherente con los datos que sugieren que ATM es la principal quinasa que induce focos H2AX y que el ADN-PK puede fosforilar H2AX sólo en la ausencia de ATM, pero no en la presencia de ATM inhibido químicamente [20]. Estos datos son consistentes con un informe de uso de otros métodos para la detección de H2AX [21] donde se suprimió la formación H2AX focos iniciales (30 min después de IR) cuando la combinación de ATM y /o inhibidores de la DNA-PK. Otro informe contradice con nuestros datos [22] en la que demostraron DNA-PK juega un papel dominante en la formación de focos H2AX en ausencia de la función de ATM; Sin embargo, este informe utiliza líneas celulares que carecen de cualquiera de ATM o ADN-PK, que no es el caso en nuestras líneas celulares. Además, la inhibición de tanto ATM y DNA-PK no dio como resultado un aumento de la señal de H2AX en todos los puntos de tiempo. Esto sugiere que ATR (la tercera quinasa implicada en la fosforilación de H2AX) es incapaz de llevar a cabo esta función de fosforilación en presencia del cajero automático y DNA-PK aun cuando ambos están inhibidas. Un enfoque interesante sería la de investigar el efecto sobre la formación de focos Rad51 cuando se inhiben estas quinasas.
El papel clave de cajero automático y DNA-PK en la reparación de DSB de ADN en células de mamíferos sugiere que la anulación de la función de uno o ambas proteínas deben aumentar el número de RBC de ADN después de un tratamiento inductor. Usando el ensayo cometa neutra hemos demostrado que la inhibición de ATM y /o DNA-PK dio lugar a mayor número de RBC de ADN después de la RI o el tratamiento con doxorubicina. Un efecto aditivo se observó en los grupos de tratamiento en los que se inhibían ambas quinasas. Es interesante que las colas de los cometas son casi iguales en los brazos de inhibidor individuales aunque sería de esperar que el inhibidor de la ADN-PK debería causar más aumentar en DSBs como NHEJ es la principal vía para la reparación de DSBs de ADN. Esto puede ser debido a que se realizó el ensayo cometa a las 24h, que es fisiológicamente más significativo para las células, pero no necesariamente refleja la cinética de reparación. La mayoría de las DSB se reparan rápidamente por NHEJ y luego cinética más lenta por HR para las DSB DSB y francas residuales resultantes del tenedor de replicación estancado. ATM impactos sobre recursos humanos, por lo tanto KU55933 deberían disminuir esta fase lenta aún más y, por tanto, un mayor número de interrupciones a las 24 h en comparación con cuando no se inhibe HR (brazos de control y de inhibidores de ADN-PK).
En resumen, este estudio informa de un nuevo tratamiento para el cáncer de próstata por la orientación del ADN DSB maquinaria de reparación. Se demuestra que la orientación de reparación de DSB confiere una quimio- y radio mejorada sensibilidad de la hormona líneas celulares de CaP sensibles e insensibles asociadas con aumento de la muerte celular programada. Una evaluación más profunda de los inhibidores específicos debe llevarse a cabo en modelos animales, incluyendo la evaluación de la disponibilidad de plasma, la toxicidad y la eficacia antes de moverse más hacia cualquier ensayo clínico.