Extracto
Antecedentes
Reducción quimiosensibilidad de las células cancerosas sólidos representa un obstáculo fundamental en la oncología clínica . Por lo tanto, la caracterización molecular de las vías que regulan la quimiosensibilidad es un requisito previo fundamental para mejorar la terapia del cáncer. El factor HIF-1α inducible por hipoxia se ha relacionado con la quimiosensibilidad mientras que los mecanismos moleculares subyacentes permanecen en gran parte difícil de alcanzar. Por lo tanto, hemos analizado exhaustivamente el papel de HIF-1α en la determinación de la quimiosensibilidad centrándose en las vías moleculares responsables.
Metodología y Principales conclusiones
La interferencia de ARN se aplicó para inactivar HIF-1α o p53 en el cáncer gástrico humano líneas de células AGS y MKN28. Los agentes quimioterapéuticos 5-fluorouracilo y cisplatino se utilizaron y quimiosensibilidad se evaluó por ensayos de proliferación celular, así como la determinación de la distribución del ciclo celular y la apoptosis. La expresión de las proteínas p53 y p53 objetivo se analizó por transferencia de western. la actividad de NF-kB se caracterizó por medio de ensayo de cambio de movilidad electroforética. La inactivación de HIF-1α en células de cáncer gástrico resultó en robusto elevación de quimiosensibilidad. En consecuencia, las células de HIF-1a-competente muestran una reducción significativa de la senescencia y la apoptosis inducida por quimioterapia. Sorprendentemente, este fenotipo estaba completamente ausente en
p53
células mutantes, mientras que la inactivación de p53
per se
no afectó quimiosensibilidad. HIF-1α marcadamente suprimida la activación inducida por la quimioterapia de p53 y p21, así como la proteína del retinoblastoma, resultando eventualmente en la detención del ciclo celular. Reducción de la formación de especies reactivas del oxígeno en las células de HIF-1α-competentes fue identificado como el mecanismo molecular de la inhibición mediada por HIF-1α de p53. Además, la pérdida de HIF-1α abrogada, de una manera dependiente de p53, inducida por la quimioterapia de unión a ADN de NF-kappa B y la expresión de anti-apoptóticos genes diana NF-kB. En consecuencia, la reconstitución de la subunidad p65 de NF-kB revirtió el aumento de la quimiosensibilidad de las células de HIF-1a deficientes.
Conclusión y significado
En resumen, hemos identificado HIF-1α como un potente regulador de la la actividad de p53 y NF-kappa B en condiciones de estrés genotóxico. Llegamos a la conclusión de que
p53
mutaciones en los tumores humanos tienen el potencial para confundir a la eficacia de HIF-1-inhibidores en la terapia del cáncer
Visto:. Rohwer N, C Dame, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) factor inducible por hipoxia 1α Determina el cáncer gástrico Quimiosensibilidad través de la modulación de p53 y NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038
Editor: Deb Fox, del Instituto de Investigación de la Infancia del Hospital de Niños de Nueva Orleans, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de abril de 2010; Aceptado: July 19, 2010; Publicado: 10 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Rohwer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) para TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 y 133 /2-3), y NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC también fue apoyado por una beca de la Berliner Krebsgesellschaft eV (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
resistencia a los fármacos intrínseca y adquirida son las causas principales para la limitada eficacia de la quimioterapia en la mayoría de los cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer gástrico [1], [2]. La resistencia a fármacos es un fenómeno complejo y multifactorial relacionada con microambiente tumoral, por ejemplo, hipoxia, acidosis y la inflamación, así como la propia célula neoplásica [3]. la resistencia celular puede ser inherente al patrimonio genético específico de la célula tumoral o como resultado de mutaciones y alteraciones epigenéticas después de la terapia antiproliferativa [4], [5].
El factor de transcripción del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1 ) constituye un regulador central de la adaptación celular a la hipoxia y se ha implicado en la resistencia a fármacos [6] - [8]. La proteína HIF-1 es un heterodímero compuesto por una subunidad β-expresado constitutivamente (ARNT (aril hidrocarburo receptor translocador nuclear)) y una α-subunidad inducible por hipoxia [9]. En condiciones normóxicas, la actividad de HIF-1α puede ser inducida por diversos factores de crecimiento, citoquinas, oncogenes activados o pérdida de la función de genes mutados supresores de tumores [10]. HIF-1α está implicado en el centro de múltiples aspectos de la tumorigénesis incluyendo la proliferación de células tumorales, angiogénesis, metástasis, así como la respuesta a la quimioterapia y la radioterapia [11]. HIF-1α se sobreexpresa en un gran número de tumores sólidos, y la expresión de HIF-1α tumoral se asocia a menudo con un mal pronóstico [12] - [15]. Además, la inhibición de HIF-1α por medio de la interferencia de ARN o compuestos farmacológicos ha demostrado la eficacia antitumoral en diversos modelos de cáncer murino [16]. Una contribución de HIF-1α a la quimiorresistencia de las células neoplásicas se ha observado en un amplio espectro de tumores sólidos, incluyendo cáncer gástrico [6] - [8], [17] - [20]. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes, así como el papel de HIF-1α para la resistencia a los medicamentos en condiciones de normoxia permanecen en gran parte difícil de alcanzar [8], [18], [21]. Aquí, identificamos supresión de p53 y la promoción de la actividad del factor nuclear kappa B (NF-kB) como mecanismos centrales para de HIF-1α sensibilidad de determinación de papel contra 5-fluorouracilo (5-FU) y cisplatino en células de cáncer gástrico humano.
resultados
HIF-1α determina la sensibilidad de las células de cáncer gástrico hacia los agentes quimioterapéuticos 5-FU y cisplatino
inactivación funcional de HIF-1α se logró mediante transducción lentiviral de AGS y MKN28 células con pequeños ARN de interferencia (siRNA) dirigido específicamente a HIF-1α. Este enfoque experimental produjo una caída altamente eficiente demostrada por una falta completa cerca de las células transducidas para inducir la proteína HIF-1α en respuesta a la hipoxia tal como se publicó anteriormente [22]. Para evaluar la importancia de HIF-1α para la sensibilidad de las células de cáncer gástrico humanos hacia los agentes quimioterapéuticos establecidos, se compararon los efectos de 5-FU y cisplatino en HIF-1α-competente (codificado "SCR") y HIF-1α deficientes (knockdown "KD") células AGS. la inactivación funcional de HIF-1α desplazó la dependencia de la dosis de la inhibición del crecimiento hacia las concentraciones de fármaco inferiores (Figura 1A y la Figura S1), lo que sugiere que HIF-1α es capaz de reducir la susceptibilidad de la quimioterapia de las células de cáncer gástrico en condiciones de normoxia. En línea con los informes anteriores [6] - [8], [17], [18], la exposición a la hipoxia aumenta la resistencia al 5-FU en las células AGS, sin embargo inactivación de HIF-1α resultó en robusto elevación de la quimiosensibilidad en condiciones de hipoxia ( Figura S2). En un enfoque complementario, se estudiaron las consecuencias de la sobreexpresión de HIF-1α (pcDNA HIF-1α) para la quimiosensibilidad de las células AGS. células AGS sobreexpresan HIF-1α fueron considerablemente más resistentes al tratamiento con 5-FU (Figura 1B). la expresión de HIF-1α estable fue confirmada por HRE (hipoxia elemento de respuesta) de ensayo de luciferasa (Figura 1C). Estos resultados sugieren fuertemente que HIF-1α limita la acción citotóxica de 5-FU y cisplatino en células de cáncer gástrico humano y que la inactivación de HIF-1α puede tener efectos beneficiosos sobre la quimiosensibilidad
.
(A) Proliferación de AGS KD y células SCR 24 h después del tratamiento con concentraciones crecientes de 5-FU en condiciones de normoxia. El número de células se muestran como porcentaje de células no tratadas (*,
P
& lt; 0,05; **,
P
& lt; 0,01). (B) de tipo salvaje células AGS fueron transfectadas con el vector de HIF-1α expresión (pcDNA HIF-1α) o vector vacío (pcDNA 3.1) y tratados con 5-FU 24 h después de la transfección. El número de células se determinó 24 h después del tratamiento con 5-FU, y se muestran como porcentaje de células control sin tratar (**,
P
& lt; 0,01). células (C) AGS de tipo salvaje fueron co-transfectadas con cualquiera de pcDNA HIF-1α o pcDNA 3.1 plus reportero HRE-luciferasa (Phre-Luc) y
Renilla
reportero (phRL nulo) como control interno. Las células se recogieron 48 h después de la transfección. la actividad de luciferasa HRE, normalizada para
Renilla
actividad de la luciferasa, fue expresado en relación a la de células de control transfectadas (***,
P
& lt; 0,001).
límites de HIF-1a quimioterapia inducida por detención del ciclo celular y la apoptosis a través de la supresión de p53
Comenzamos una caracterización de la inhibición del crecimiento observada mediante el análisis de los patrones de distribución del ciclo celular después de la quimioterapia. G
1-sincronizado, las células AGS privadas de suero fueron liberados de G
0 /G
1 fase mediante la adición de suero y perfiles del ciclo celular se determinaron después de la adición de 5-FU. culturas liberados de AGS no tratados progresaron fácilmente a través de G
1
en 2 /M fases [22] S y G, mientras que las células tratadas con 5-FU se mantuvieron en G
1 fase (no se muestra). Curiosamente, la retención de 5-FU-dependiente de las células en G
1 fase se aumentó en gran medida en AGS KD comparación con las células AGS SCR, en consonancia con G
detención del ciclo celular 1 (Figura 2A). detención del ciclo celular irreversible ha surgido como un modo importante de acción de los agentes antiproliferativos y se caracteriza por las características celulares de la senescencia [7], [23]. En consecuencia, se determinó la fracción de células senescentes. De hecho, el tratamiento con 5-FU dio lugar a un sólido de inducción de senescencia en células AGS. Esta respuesta fue significativamente mayor en las células con pérdida concurrente de HIF-1α (Figura 2B). Además, la inducción de apoptosis fue sugerido por un mayor
1 fracción pre G en histogramas de ADN de células AGS KD tratados con 5-FU (no mostrado). Por lo tanto, se obtuvo un análisis cuantitativo de la fracción de células apoptóticas en base a la detección de exfoliados caspasa-3 (Figura 2C). En consonancia con los datos sobre la distribución del ciclo celular, la fracción apoptótica inducida por 5-FU fue significativamente mayor en HIF-1α deficientes en células AGS KD en comparación con células HIF-1a-competentes.
(A) AGS KD y células SCR se trataron durante 24 h con 10 mg /ml 5-FU, y la distribución del ciclo celular se determinó mediante análisis FACS (**,
P
& lt; 0,01). la senescencia inducida por quimioterapia (B) se cuantificó en las células AGS KD y SCR 4 días después del tratamiento con 5-FU mediante la medición de la actividad de SA-β-Gal (**,
P
& lt; 0,01). células AGS KD y SCR (C) se trataron durante 48 h con 10 mg /ml 5-FU y la apoptosis se cuantificó basándose en la detección de activa la caspasa-3 usando citometría de flujo (**,
P
& lt; 0,01 ). (D) Análisis de inmunotransferencia Representante de p53, p21, CDK2, ciclina A y los niveles de proteína pRb en AGS KD y células SCR tratado con 10 mg /ml 5-FU para 6 y 24 h. Actina sirvió como control de carga. ppRb, pRb fosforilada.
senescencia inducida por la quimioterapia y la apoptosis tanto han estado íntimamente ligada a la supresor de tumores
p53
. Por lo tanto, la hipótesis de que p53 podría contribuir a la citotoxicidad aumentada de 5-FU en caso de pérdida de HIF-1α. Después de tratamiento con 5-FU, la proteína p53 acumula gradualmente en las células AGS, un efecto que fue sorprendentemente mejorada en las células AGS HIF-1a deficientes (Figura 2D). Esta estabilización de p53 se asoció con un aumento de los niveles de la p21 inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (CDK), un objetivo transcripcional bien establecida y el efector aguas abajo de p53 con funciones en la detención del ciclo celular, inducción de senescencia y apoptosis (Figura 2D). Una vez más, las células AGS HIF-1a deficientes mostraron un aumento mucho más vigoroso en p21 que las células AGS HIF-1a-competente. Se espera que la inducción fuerte de p21 para inhibir la actividad de G
1 ciclina /CDK, resultando en hipofosforilación de la proteína retinoblastoma (pRb) y el fracaso para inducir S ciclinas de fase, por ejemplo, ciclina A. De hecho, tanto la pRb hypophosphorylation y niveles reducidos de ciclina A se confirmaron en las células AGS KD tratados con 5-FU y - en menor medida - también en células AGS SCR (Figura 2D). Estos cambios corroboran la retención G
1 fase observada en los histogramas de ADN y son consistentes con la irreversible G
1 detención observada en la senescencia inducida por quimioterapia. Por lo tanto, los diferentes resultados biológicos del tratamiento con 5-FU en las células AGS HIF-1α deficientes y -proficient surgen de la regulación diferencial de p53 y su aguas abajo p21 objetivo.
La inactivación de p53 embota el papel de HIF-1α para quimiosensibilidad
para obtener evidencia experimental para el proyecto de papel de p53 en la regulación de HIF-1α-mediada de quimiosensibilidad en células AGS, que p53 funcionalmente inactivado por la interferencia del ARN mediante transfección transitoria de anticuerpos anti-p53 siRNA (p53 si) , o un control mezclado siRNA (si scr). P53 fue eliminado de manera eficiente hacia abajo, como se indica por el fracaso de las células transfectadas para inducir la p21 efectores p53 y MDM2 en respuesta a 5-FU tratamiento (Figura 3A). Curiosamente, las células AGS KD transfectadas con p53 si fueron significativamente menos susceptibles a la inhibición del crecimiento por 5-FU de las células AGS KD transfectadas con ARNsi de control (Figura 3B). En línea con estos descubrimientos, G retención ciclo
1 celular y la apoptosis de las células AGS KD tratados con 5-FU se redujeron en caída p53 en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control (Figura 3D y 3E). En agudo contraste, la quimiosensibilidad de las células AGS HIF-1a-competente no fue influenciada por la inactivación de p53 (Figura 3C).
células AGS fueron transfectadas con siRNA control (SI SCR) o siRNA contra p53 (p53 SI) y 10 mg /ml de 5-FU se añadió 24 h después de la transfección. (A) El análisis por inmunotransferencia de p53, p21 y MDM2 en extractos de células enteras a partir de células AGS KD después del tratamiento 5-FU. Actina sirvió como control de carga. (B y C) El número de células de scr Si y p53 si transfectadas células AGS se determinó 24 h después del tratamiento con 5-FU. Los resultados se muestran como porcentaje de células control sin tratar (**,
P
& lt; 0,01). Las células en el G
1 fase (D) y thesub-G
1 población (E) se evaluaron a partir de histogramas de ADN de células AGS KD transfectadas con p53 si o scr Si y tratados durante 24 h con 5-FU ( *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P
. & lt; 0,01) guía empresas
HIF-1α no puede afectar a la quimiosensibilidad en
p53
células mutantes
para confirmar la regulación de HIF-1α dependiente del 5-FU y la capacidad de respuesta para caracterizar aún más la contribución de p53, se analizó una segunda línea celular de cáncer gástrico humano (MKN28), lo que conlleva un cambio de sentido mutación en
TP53
en el codón 251. Curiosamente, la supresión de HIF-1α en células MKN28 no para mejorar la inhibición del crecimiento después de la exposición a 5-FU (Figura 4A). Del mismo modo, inducida por 5-FU G
1 acumulación y apoptosis de las células MKN28 no se vieron afectados por la pérdida de HIF-1α (Figura 4B y 4C). De acuerdo con estos resultados, los niveles de proteína de p53 y pRb se mantuvo sin cambios en las células tratadas MKN28-5-FU durante el periodo de 24 h, y la inducción de p21 estaba ausente (Figura 4D). Sin embargo, cuando la función de p53 fue restaurada por el pretratamiento con el compuesto químico PRIMA-1 [24] knockdown HIF-1α se tradujo en una mejora de forma significativa citotoxicidad 5-FU (Figura S3). Consonancia con la función establecida de p53 en citotóxica inducida por la quimioterapia /efectos citostáticos, el tratamiento con PRIMA-1
per se
reducido ligeramente la proliferación de las células MKN28 y mejora de forma significativa la eficacia del 5-FU en MKN28 células (Figura S3).
(A) El número de células de MKN28 KD y células SCR 24 h después del tratamiento con 5-FU en condiciones de normoxia. Los datos se muestran como porcentaje de células no tratadas. Las células en G
1 fase (B) y las células apoptóticas (C) se cuantificaron a partir de histogramas de ADN de MKN28 KD y las células SCR tratadas durante 48 h con 10 mg /ml 5-FU. (D) El análisis por inmunotransferencia de p53, p21 y los niveles de proteína pRb en MKN28 KD y células SCR tratados con 10 mg /ml 5-FU para 6 y 24 h. Actina sirvió como control de carga.
NF-kB es un importante mediador de la función del HIF-1α en quimiosensibilidad
La activación de NF-kappa B se asocia con la protección frente a la apoptosis inducida por la quimioterapia y , a la inversa, la inhibición de NF-kB puede mejorar la eficacia de los agentes anti-neoplásicos, tanto
in vivo
y
in vitro
[25] - [27]. Por lo tanto, se determinó la actividad de NF-kB de unión al ADN en las células AGS HIF-1α-deficientes y -proficient después del tratamiento con 5-FU mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA). El tratamiento con 5-FU potentemente activa NF-kB de unión al ADN en las células AGS SCR, con niveles pico a las 6 h después de la exposición a 5-FU (Figura 5A). El tratamiento con TNF durante 4 h sirvió como control positivo para la activación de NF-kB. Además, un supershift fue inducida por un anticuerpo anti-p65, lo que confirma que los complejos de NF-kB 5-FU inducidas contenían la subunidad 65-kDa (p65). La pérdida de HIF-1a activación significativamente inhibido de NF-kappa B en respuesta a 5-FU y TNF (Figura 5A). En consonancia con esta observación, 5-FU tratamiento también falló para inducir los genes diana NF-kB cIAP1 y A20 en células AGS KD, mientras que se indujo fácilmente en las células AGS SCR (Figura 5B).
(A) los extractos nucleares de células AGS KD y SCR se prepararon en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento con 10 mg /ml 5-FU o TNFa como control positivo, y la actividad de unión a ADN de NF-kB fue examinado por EMSA. Para los experimentos de supershift, extractos nucleares se incubaron con un anticuerpo anti-p65. (B) Expresión de NF-kB genes diana cIAP1 y mRNA A20 en extractos de ARN total a partir de células AGS KD y AGS SCR 48 h después del tratamiento con 10 mg /ml 5-FU. Los datos se expresaron en relación con los niveles de ARNm en las células AGS SCR no tratados, fijado en 1,0 (*,
P
& lt; 0,05; **,
P
& lt; 0,01). las células (C) AGS KD fueron co-transfectadas con o bien p65 o pcDNA pcDNA 3.1 y tratados con 5-FU 24 h después de la transfección. Los números de células fueron tras otro 24 h y se presentan como porcentaje de células de control sin tratar (***,
P
& lt; 0,001). (D) actividad de unión de ADN para NF-kB fue examinado por EMSA utilizando extractos nucleares de MKN28 KD y células SCR tratados con 10 mg /ml 5-FU o TNF durante los tiempos indicados. la inhibición de anticuerpos se realizó con un anticuerpo anti-p65.
Para hacer frente a la importancia funcional de NF-kB para la inhibición del crecimiento inducida por 5-FU, overexpressed p65 (p65 pcDNA) en células AGS KD. La transfección de p65 pcDNA, pero no el vector de control vacío, dio lugar a una inducción significativa de la proteína p65 y la actividad transcripcional NF-kB en las células AGS kD (Figura S4). Es de destacar que las células AGS KD HIF-1a-deficiente que sobreexpresan p65 fueron considerables más resistentes al tratamiento con 5-FU en comparación con células AGS KD transfectadas con el vector de control (Figura 5C), consistente con un papel esencial de NF-kappa B en la mediación de la quimiorresistencia hacia 5-FU en células de cáncer gástrico. Tomados en conjunto, una activación simultánea de p53 y la inhibición de NF-kappa B en 5-FU-tratadas, se observó células AGS HIF-1a-deficiente. Para aclarar, si los dos eventos son interdependientes, se estudió la activación de NF-kB inducida por 5-FU en MKN28 células con el mutante
p53.
Tanto el 5-FU y TNF activan NF-kB de unión al ADN en un tiempo de manera dependiente, indicando mecanismos independiente de p53 de la activación de NF-kB por 5-FU (Figura 5D). Sin embargo, a diferencia del hallazgo en las células AGS, esta activación de NF-kB en el
p53
línea celular mutante no fue mitigado por la inactivación de HIF-1α. Por lo tanto, HIF-1α puede apoyar la activación de NF-kB inducida por quimioterapia contrarrestando los mecanismos inhibitorios de p53-dependiente.
Altered la formación de ROS es responsable de la modificación inducida por HIF-1α de la actividad de p53
Para aclarar el mecanismo subyacente superinducción p53 molecular en 5-FU tratada con células HIF-1α-deficientes, que caracteriza el papel de las especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS constituye un vínculo candidato como (i) ROS son potentes activadores de la función de p53 y los factores clave que se consideran en la inducción de p53 por diversos agentes quimioterapéuticos [28], y (ii) HIF-1α puede suprimir la generación de ROS por la disminución de la actividad mitocondrial y la biogénesis [22], [29], [30]. En consecuencia, las células AGS KD se trataron previamente con el cloruro de ROS inhibidores diphenyleneiodonium (DPI) o apocinina. Tanto los inhibidores confirieron protección significativa contra la inhibición del crecimiento inducida por 5-FU en las células AGS KD (Figura 6A y 6B). Por otra parte, el DIP y apocinina impedía casi por completo la inducción de p53 y p21 su objetivo abajo en 5-FU tratados con células (Figura 6C y 6D). Estos resultados sugieren una intersección de la señalización de HIF-1α con la respuesta mediada por p53 para 5-FU en el nivel de la producción de ROS. Para establecer un papel causal de HIF-1α para el potencial redox de las células AGS después del tratamiento 5-FU, los niveles de ROS intracelulares se determinaron en células AGS KD y SCR por citometría de flujo. Se encontró que los niveles de superóxido intracelular en células AGS KD tratados con 5-FU eran 2,5 veces mayores que los de las células AGS SCR tratados con 5-FU (Figura S5), lo que indica que la inactivación funcional de HIF-1α en células AGS dio lugar a elevación significativa y funcional de estrés oxidativo intracelular incluso bajo tratamiento quimioterapéutico.
(a-D) células AGS KD se pretrataron durante 16 h con diferentes concentraciones de los inhibidores de NADPH oxidasa diphenyleneiodonium (DPI) o apocinina. Proliferación de DPI-pretratado (A) o apocinina pretratados (B) células AGS KD 24 h después del tratamiento con 10 mg /ml 5-FU en condiciones de normoxia (***,
P
& lt; 0,001). El número de células se muestran como porcentaje de células no tratadas. (C y D) El efecto de DPI (C) y apocinina (D) en los niveles de proteína p53 y p21 se determinó mediante análisis de inmunotransferencia usando extractos de células enteras de células AGS KD tratadas durante 24 h con 10 mg /ml 5-FU. (E) Modelo propuesto para la regulación de HIF-1-dependiente de la quimiosensibilidad por la modulación inducida por ROS de p53. (Panel izquierdo) la respuesta inducida por la quimioterapia en las células de HIF-1-competente. HIF-1 contrarresta la generación de ROS en el nivel mitocondrial. La disminución de los niveles de ROS a su vez la activación de p53 Abate y permitir la progresión del ciclo celular a pesar de la quimioterapia. Por lo tanto, las células de HIF-1-competente mostrar un fenotipo más quimiorresistente. Ub, ubiquitina; P, fosfato. (Panel derecho) la respuesta inducida por la quimioterapia en las células de HIF-1-deficientes. La inactivación de HIF-1 conduce a la generación de ROS mitocondrial acelerado. ROS son potentes inductores de p53 y por lo tanto a aumentar la activación de p53 por parte de agentes quimioterapéuticos. P53 en transactivates su vez -entre otros - la quinasa (CDK) inhibidor de p21 dependiente de ciclina e inhibe la actividad de NF-kB. La activación combinada de p53 y la inhibición de NF-kB, da lugar a la apoptosis y /o senescencia de las células de HIF-1-deficientes, por lo tanto, un fenotipo más sensible a la quimioterapia.
Discusión
La factor de transcripción HIF-1α se ha establecido como importante mediador de la quimiorresistencia hipoxia mediada [6] - [8], [17], [18], [20]. Aquí, identificamos HIF-1α como un poderoso determinante de la quimiosensibilidad en células de cáncer gástrico en condiciones de normoxia. Mediante la aplicación de un sistema de siRNA basado en lentivirus que muestran una mayor significativamente 5-FU y cisplatino toxicidad en células de cáncer gástrico HIF-1a-deficiente. Los datos disponibles sobre el papel de HIF-1α para la quimiosensibilidad de las células cancerosas en condiciones de normoxia son contradictorios. Mientras que las células de fibrosarcoma HIF-1a-deficiente (HT1080) que aparecen mejora de forma significativa la sensibilidad hacia etopósido en aire ambiente, el cáncer de colon (HCT116) y hepatoma (Hepa-1) no lo hicieron las células [6]. Unruh
et al.
Reportado una mayor susceptibilidad de fibroblastos embrionarios murinos HIF-1a deficientes a carboplatino o etopósido en condiciones de normoxia, así como las condiciones de hipoxia [8]. Con respecto al cáncer gástrico, el aumento de eficacia de 5-FU y vincristina se demostró bajo normoxia
in vitro
[18]. Y en línea con nuestros resultados, ambos estudios concluyeron un papel fundamental para la HIF-1α en la mediación de la quimio-resistencia en condiciones de normoxia. Curiosamente, un estudio reciente de Japón demostró menor eficacia de la quimioterapia basada en 5-FU en HIF-1α-expresión de los adenocarcinomas gástricos humanos, el fortalecimiento de la percepción de HIF-1 como un factor fundamental en la determinación de la quimio-resistencia cáncer gástrico [31].
control de la progresión del cáncer por la quimioterapia se basa al menos en parte en la inducción de la senescencia celular. Recientemente, se demostró la pérdida de HIF-1α para causar la senescencia prematura de fibroblastos embrionarios murinos inmortalizadas en condiciones de normoxia [32]. Nuestros datos actuales sugieren que HIF-1α guarda de manera similar células de cáncer gástrico contra la senescencia inducida por quimioterapia en condiciones de normoxia. Esto constituye el primer informe de la senescencia inducida por quimioterapia elevado a través de la inactivación funcional de HIF-1α en una línea celular de cáncer humana establecida. En las células de HIF-1a-deficientes, se observó también mejoramos la inducción de apoptosis en respuesta a 5-FU. Estudios anteriores informaron de una reactivación del factor proapoptótico de la subasta [6], o un cambio en el equilibrio de los miembros de la familia Bcl-2 pro y antiapoptóticas para tener en cuenta el aumento de las tasas de apoptosis después de la inactivación de HIF-1α en células de cáncer gástrico tratados con fármaco [ ,,,0],. 18]
Nuestro estudio identifica un nuevo mecanismo, mediante el cual HIF-1α contrarresta la quimioterapia inducida por la senescencia y la apoptosis: presentamos evidencia concluyente de la capacidad de HIF-1α para suprimir la inducción del gen supresor tumoral p53 en respuesta a 5-FU en condiciones de normoxia. P53 es un destino de la célula fundamental determinante debido a su papel en la regulación de la progresión del ciclo celular y la apoptosis en respuesta al estrés celular y constituye el gen más comúnmente mutado en los cánceres humanos [33]. Una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos, se mostró a estabilizar p53 y, por el contrario, la pérdida de p53 constituye un mecanismo principio de la resistencia del cáncer a la quimioterapia [33], [34]. La interacción de p53 y HIF-1α ha sido objeto de debates desde hace mucho tiempo como los dos informes positivos y negativos se han publicado [35]. trabajo Sin embargo, la totalidad publicó anteriormente centrado en p53-HIF-1a-interacciones en condiciones hipóxicas (o incluso anóxica) condiciones. A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestros experimentos, por primera vez proporcionan evidencia de la supresión de la actividad de p53 por HIF-1α en condiciones de normoxia. Como consecuencia de la regulación al alza de p53 en células de HIF-1a-deficiente, hemos observado cambios en los efectores que están vinculados a la detención del ciclo celular característica irreversible de senescencia, por ejemplo estabilización de p21 y hypophosphorylation de PRB. Diferente de nuestra observación, el trabajo reciente sobre la quimio-resistencia hacia etopósido en fibroblastos embrionarios murinos inmortalizadas HIF-1α-deficientes no observó una inducción de p21 [36]. Además, HIF-1α estabiliza p21 y p27, así como llevó a hypophosphorylation de PRB durante la detención del crecimiento inducido por hipoxia de los fibroblastos embrionarios murinos inmortalizadas y esplénica linfocitos B primarios [37]. Estos resultados contrastantes son muy probablemente explican por los tipos de células investigadas: Mientras Goda
et al
. caracterizado una respuesta fisiológica a la hipoxia en tipos de células no transformadas, se analizó la respuesta a grave daño del ADN en líneas celulares de cáncer establecidas.
Mientras que p53 se demostró repetidamente para contrarrestar la función NF-kappa B [38], [39 ], nuestros datos actuales indican un papel para el supresor de tumores en la regulación de la activación de NF-kB HIF-1α-dependiente. Además de p53, NF-kB ha surgido como un segundo determinante, en el centro de la resistencia a los agentes quimioterapéuticos [40]. Varios estudios diferentes han establecido enlaces funcionales entre NF-kappa B y HIF-1α, a pesar de que de forma variable colocan HIF-1α, ya sea aguas arriba de NF-kappa B, o viceversa. Por ejemplo, la estabilización de la hipoxia inducida de HIF-1α en células del músculo liso está bajo control transcripcional de NF-kappa B [41]. Del mismo modo, los resultados obtenidos a partir de ratones knockout IKK-beta condicionales confirmaron el papel fundamental de NF-kappa B en el control basal y la expresión inducida por hipoxia de HIF-1α
in vivo
[42]. Por el contrario, la expresión del gen de la subunidad p65 de NF-kB se demostró para ser controlado por HIF-1α en el contexto de la apoptosis por hipoxia suprimida de neutrófilos [43]. Nuestro hallazgo de marcada reducción de la actividad de NF-kB en las células de HIF-1a deficientes tras el tratamiento con 5-FU, por tanto, está en sintonía con este último informe. Curiosamente, también se observó reducción significativa de unión de las subunidades de NF-kB en las células HIF-1α deficientes después de la estimulación con TNFa, un inductor bien establecido de la actividad de NF-kappa B [44] ADN. Esto plantea la pregunta pertinente en qué condiciones fisiológicas y fisiopatológicas HIF-1α es capaz de regular la activación de NF-kB. HIF-1α y NF-kappa B comparten crucial importancia para varios procesos tales como la inflamación, la destrucción microbiana y la tumorigénesis. La naturaleza molecular exacta, así como la jerarquía de su interacción es más probable por células y dependiente del contexto y no se puede generalizar.
En el presente estudio hemos sido capaces de identificar ROS como un punto de intersección HIF 1a con la respuesta al estrés celular mediada por p53 a la quimioterapia. Intracelular de ROS son conocidos como potentes inductores de p53 y participar en la activación de p53 por fármacos quimioterapéuticos [45]. Las mitocondrias representan la principal fuente de ROS intracelulares [46], y HIF-1α probable contrarresta la producción de ROS en el nivel mitocondrial a través de múltiples mecanismos, incluyendo la inhibición de la biogénesis mitocondrial y de piruvato yendo y viniendo en la mitocondria, la reducción de la actividad mitocondrial debido a una mejor utilización de la glucólisis y la activación de la autofagia mitocondrial [29], [30], [47], [48]. Anteriormente, hemos establecido un vínculo funcional entre la reducción controlada-HIF-1α de ROS y la independencia de anclaje de células de cáncer gástrico [22], que implican a HIF-1α en la patogénesis del cáncer gástrico en ausencia de hipoxia. Ahora nos encontramos con que la capacitiy de HIF-1α para restringir la producción de ROS de células de cáncer gástrico también confiere resistencia a los agentes quimioterapéuticos que funcionan a través de la activación de p53 (Figura 6E). Curiosamente, también se han reportado efectos crecientes sobre la resistencia a la terapia a través de la modulación de p53 y ROS para HIF-2α [49]. Las isoformas HIF-alfa 1 y 2 muestran una amplia superposición de los objetivos de HIF putativos y la unión a elementos de respuesta de hipoxia y la asignación definitiva de los efectos de la hipoxia inducida a cualquiera isoforma no siempre es realizable [50]. Bertout
et al.
Demostrado que la inhibición de HIF-2α aumenta la apoptosis inducida por la radiación a través de la acumulación de ROS y el posterior aumento de la actividad de p53 [49]. Además, Roberts
et al.
Demostró que la resistencia contra la quimioterapia está mediada en parte por la supresión mediada por HIF-2α de p53 en células de carcinoma de células renales [51]. Por lo tanto, las observaciones reportadas la presente justifican las investigaciones sobre el papel potencial de HIF-2α, una tarea que se encuentra actualmente en curso en nuestro laboratorio.
En vista de la necesidad clínica para identificar predictores de respuesta para las opciones de tratamiento disponibles, nuestra