Extracto
La activación de la vía /β-catenina se ha observado en al menos 1 /3 de carcinomas hepatocelulares (HCC), y un número significativo de estos tienen mutaciones en el gen β-catenina. Por lo tanto, la inhibición efectiva de esta vía podría proporcionar un nuevo método para tratar el HCC. El propuesto de este estudio era determinar si FH535, que se había demostrado que bloquear la vía β-catenina, podría inhibir la activación de β-catenina de los genes diana e inhibir la proliferación de cáncer de hígado Stem Cells (LCSC) y líneas celulares de HCC. El uso de β-catenina genes informador sensible, nuestros datos indican que FH535 puede inhibir la activación del gen diana por endógena y exógena expresada β-catenina, incluyendo la forma constitutivamente activa de β-catenina que contiene una mutación Serine37Alanine. Nuestros datos también indican que la proliferación de líneas LCSC y HCC es inhibida por FH535 de una manera dependiente de la dosis, y que esto se correlaciona con una disminución en el porcentaje de células en fase S. Por último, también muestran que la expresión de los dos objetivos bien caracterizados de β-catenina, ciclina D1 y survivina, se reduce en FH535. Tomados en conjunto, estos datos indican que FH535 tiene valor terapéutico potencial en el tratamiento de cáncer de hígado. Es importante destacar que estos resultados sugieren que esta terapia puede ser eficaz en varios niveles de focalización tanto CHC y LCSC
Visto:. Gedaly R, R Galuppo, diario MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) Orientación de la Wnt /β-catenina vía de señalización en las células madre del cáncer de hígado y las líneas celulares de carcinoma hepatocelular con FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10.1371 /journal.pone.0099272
Editor: Zhiyuan Gong, Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 30 Octubre, 2013; Aceptado: 12-may de 2014; Publicado: 18 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Gedaly et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta publicación fue apoyada por la beca número UL1RR033173 [TL1 RR033172, KL2 RR033171] en el Centro Nacional de Recursos de investigación (CNRR), DK074816 (BTS), financiado por la Oficina del director de los Institutos nacionales de Salud (NIH), y apoyado por el NIH Roadmap para la Investigación médica. Esta investigación también fue apoyada por la citometría de flujo y clasificación de células de recursos compartidos de la Universidad de Kentucky Centro de Cáncer Markey (P30CA177558). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de la CNRR y los NIH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC), el cáncer de hígado más común, es el quinto cáncer más común y la tercera causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1] - [2]. El alarmante aumento de la incidencia de CHC en Europa y América del Norte en los últimos años se relaciona principalmente con la infección por virus de la hepatitis C, aunque otros factores como el consumo excesivo de alcohol y la obesidad también contribuyen a este aumento [3]. La etiología del CHC es complejo e implica numerosas alteraciones genéticas y epigenéticas y la interrupción de las diversas vías de señalización, incluyendo el /β-catenina vía, Ras /Raf /MAPK, PI3K /Akt /mTOR, HGF /c-MET, IGF, VEGF y vías de PDGF. Entre ellas, la vía /β-catenina es considerado uno de los más difíciles de inhibir [4]. En la actualidad, algunos agentes químicos destinados a la vía Wnt /β-catenina, o bajo investigación [5].
La activación de la vía /β-catenina vía canónica de Wnt implica la unión de las proteínas Wnt a los receptores celulares de superficie y Frizzled LRP5 /6 co-receptores. En ausencia de proteínas Wnt, gran parte del celular β-catenina está obligado a E-cadherina en la membrana celular. Citosólico β-catenina es constitutivamente fosforilados en residuos de serina específicos por un complejo enzimático que incluye poliposis adenomatosa coli (APC), Axin, y las quinasas glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK-3β) y la caseína quinasa I, marcándolo para su mediada por ubiquitina proteólisis. En estas condiciones, el TCF /LEF factores de transcripción se une a sus elementos de reconocimiento de ADN afines junto con miembros de la familia de Groucho co-represores, asegurando el silenciamiento transcripcional de los genes diana β-catenina. El acoplamiento de las proteínas Wnt con el receptor Frizzled activa la proteína Dishevelled, dando como resultado la disociación del complejo destructiva citosólica y la inhibición de GSK-3β. Esto conduce a la estabilización y acumulación de citoplásmica β-catenina, que a continuación, entra en el núcleo, se une proteínas TCF /LEF y conduce a la disociación subsiguiente de groucho co-represores, el reclutamiento de la p300 coactivator y la activación de los genes diana β-catenina [ ,,,0],6] - [9]. Muchos de los objetivos de β-catenina, incluyendo ciclina D1, c-myc y survivina, promover la progresión del ciclo celular y inhibir la apoptosis [10] - [12]. De acuerdo con estos datos, activación de la vía /β-catenina Wnt se observa en una variedad de cánceres, incluyendo HCC. la activación aberrante de la vía /β-catenina Wnt se ha observado en al menos un tercio de HCC, y aproximadamente el 20% de los HCC tienen mutaciones en el gen de la β-catenina. Más de 50% de los tumores de HCC mostrar acumulación nuclear de β-catenina que indica que otros factores pueden estar implicados como la metilación aberrante de la APC supresores de tumores y E-cadherina, la inactivación de la caseína quinasa y GSK-3β, o aumento de la secreción de aleantes Wnt [4] - [5].
Hay un creciente interés en el papel de las células madre del cáncer de hígado (LCSC) en la tumorigénesis, la progresión tumoral, invasión y metástasis. La teoría de la célula madre de cáncer sugiere que un tumor se compone de una población heterogénea de células que forman una jerarquía celulares distintos. Estudios recientes han proporcionado pruebas convincentes de que existen estas células en tumores sólidos de muchos tipos, incluyendo, cerebro, mama, colorrectal, el hígado, el páncreas y los cánceres de próstata. En 2006, dos grupos diferentes aislados una subpoblación CD133 + a partir de líneas celulares de HCC y se describen más alta de proliferación y el potencial tumorigénico, en consonancia con propiedades de células madre. CD44 también se ha encontrado como un marcador importante usado en combinación con otros marcadores de células madre para definir mejor el fenotipo de superficie de LCSC. Se ha demostrado que las células CD133 + y CD90 + co-expresión de CD44 + son más agresivos que los que expresan CD133 o CD90 sola [13] - [14]
Los agentes químicos utilizados para apuntar vía /β-catenina Wnt. están en los niveles de membrana, citosol y factor de transcripción [5]. El agente molecular pequeña FH535 es un inhibidor dual de peroxisoma proliferador activado del receptor (PPAR) y β-catenina /TCF /LEF. FH535 se ha demostrado que inhibe la proliferación de HCC y líneas de células de hepatoblastoma y su especificidad en la inhibición de la actividad de β-catenina /TCF /LEF se ilustra en la línea celular de hepatoblastoma HepG2 [15].
El objetivo de este estudio fue para determinar si FH535 puede inhibir la activación de genes β-catenina-regulada por β-catenina endógena y ectópica expresó en las líneas celulares de HCC Huh7, Hep3B y PLC y células madre de cáncer de hígado (LCSC). La especificidad de FH535 en la inhibición de β-catenina a través de la activación de TCF /LEF se ensayó en informador de luciferasa dual transfectadas en LCSC y en células de HCC. Se ensayó la proliferación, ciclo celular, y otros centrado en los genes y las proteínas.
Materiales y Métodos
2.1 Cell Cultura y
La línea celular de carcinoma hepatocelular Huh7 [16] fue un regalo de El Dr. Guangxiang Luo (Universidad de Alabama - Birmingham). Las líneas celulares de HCC Hep3B y PLC se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Hep3B y el PLC, ambos expresan el antígeno de superficie del VHB, y Huh7 expresan el antígeno de la hepatitis delta. El Hep3B es p53 negativo, el PLC ha reducido la expresión de p53, y Huh7 se ha incrementado el nivel de proteína p53 [17] - [18]. Estas líneas celulares se cultivaron en Medio Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina y penicilina /estreptomicina. Las células madre del cáncer de hígado (LCSC; Catálogo#36116-43, CelProgen, San Pedro, CA, EE.UU.) se expandieron hasta y usado dentro de los 4 primeros pasos en CelProgen medio de crecimiento completo con un 10% de SFB en la matriz extracelular (ECM matraces recubiertos) (CelProgen). La citometría de flujo perfil y tumorigenicidad de la LCSC se muestran en las figuras S1 y S2. Otras líneas de células se cultivaron en productos de plástico estándar sin recubrimiento ECM. Las células fueron cultivadas en Nuaire incubadora (Plymouth, MI, EE.UU.) a 37 ° C con 5% de CO
2.
2.2 Productos químicos
FH535, XAV939 y LiCl fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Metil-
3H-timidina (2 Ci /mM) era de MP Biomedicals (Costa Mesa, CA, EE.UU.). Los X-Treme Gene 9 y Turbofect reactivos de transfección fueron de Roche (Indianápolis, IN, EE.UU.) y Thermo Scientific (Waltham, MA, EE.UU.), respectivamente. El kit de análisis del ciclo celular a base de yoduro de propidio era de GenScript (Piscataway, NJ, EE.UU.). Todos los demás productos químicos fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
2.3 Los plásmidos
El gen reportero de la luciferasa TOPflash, que contiene 3 copias de un sitio /LEF unión TCF y indicador de luciferasa FOPFLASH, idéntica a TOPflash excepto los sitios de TCF /LEF se han mutado, se compraron de Addgene (Cambridge, MA, EE.UU.) [19]. El vector de luciferasa Renilla PRL fue de Promega (Madison, WI, EE.UU.). Los vectores de expresión de tipo salvaje β-catenina y βCatS37A fueron proporcionados por S. Byers [20] y E3-pGL3, que contiene ratón de alfa-fetoproteína promotor de E3 fusiona al promotor pGL3, se describió anteriormente [21].
2.4
3H-timidina ensayo de incorporación de
Este ensayo se realizó como se describió previamente por nuestro método publicado y por otros investigadores [22] - [24]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 1,000-5000 células /pocillo en 0,2 ml de DMEM + 10% FBS y se trataron por duplicado con diferentes concentraciones de FH535 para 72 h. Las células se pulsaron con
3H-timidina a 1 Ci /pocillo durante 4 h. Alternativamente, las células se cultivaron a 2500 células /pocillo en 0,1 ml de medio durante 24 h, seguido de la adición simultánea de FH535 (0-15 mM) y
3H-timidina (1 Ci /pocillo) a un volumen final de 0,2 ml /pocillo., seguido de incubación durante 18 horas. En ambas situaciones, al final de la incubación, las células se lavaron y se fijaron en 0,3 ml de ácido tricloroacético al 10% (TCA) durante 12 min. Después de la aspiración de TCA, las células se lisaron en NaOH 0,2 M /0,2% de SDS durante 40 min.
incorporación de 3H-timidina se midió por recuento de centelleo en un Packard Analizador de Centelleo (Covina, CA, EE.UU.). No se realizó el ensayo de MTT para la proliferación celular para comparar con
3H-timidina porque no hay reacción de color entre FH535 y el reactivo de ensayo de MTT (bromuro de tiazolilo azul tetrazolio). La concentración de FH535 para provocar una inhibición del 50% de las células cultivadas (IC
50) se determinó por el siguiente método. datos sin fármaco se utilizó como 100% en el eje Y, y de esta se determinó una inhibición del 50% en el eje Y. Desde el punto de valor del 50%, dibujamos una línea paralela al eje X (eje de concentración de fármaco) para identificar el punto de cruz en la curva de concentración. Desde el punto de cruce dibujamos una línea paralela al eje Y, y encontrar el punto de cruce en el eje X. Este punto de intersección en el eje X es el IC
50 puntos. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces.
2,5 transitorios transfecciones y ensayos de luciferasa duales
Para las transfecciones, Huh7, PLC y LCSC se sembraron a 3 × 10
5 células /pocillo en 1 ml de medio de cultivo en placas de 12 pocillos; después de 24 h, las células fueron co-transfectadas con vectores TOPflash /PRL (relación de ADN 10:1) o vectores FOPFLASH /PRL (relación de ADN 10:1) usando Gen X-tremo 9 (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) de reactivo de transfección siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 6 h, el medio se aspiró y se añadieron las células con 1 ml de medios de cultivo que contienen diferentes concentraciones de FH535, DMSO solo (vehículo), LiCl y /o 10 mM. En todos los casos, la concentración final de DMSO fue de 0,08%. La cantidad de DMSO vehículo se mantuvo constante en los tratamientos con fármacos y la concentración final de DMSO en cada tratamiento era el mismo y fue diseñado para menos de 0,1%. Después de 36 h, ensayos de luciferasa duales se realizaron con el Sistema Dual de ensayo de luciferasa Promega (Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La actividad de luciferasa se midió en el Lumat LB 9507 luminómetro (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, EE.UU.). Brevemente, las células se lavaron una vez con PBS estéril, y se lisaron en 1 x tampón de lisis (Promega) (0,25 ml /pocillo) durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadieron diez l de lisado celular bruto (preparado según el Protocolo de Promega) a 50 l de sustrato Larii ensayo de luciferasa en un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) para medir la actividad de luciferasa de luciérnaga, seguido de adición de 50 l de sustrato Stop and Glo para medir la actividad de la luciferasa de Renilla. Se utilizó la actividad de la luciferasa de Renilla medido a normalizar la actividad luciferasa de luciérnaga medido.
Para los co-transfecciones con vectores de expresión de β-catenina, se sembraron las células a 1 × 10
5 células /pocillo en 24 pocillos platos. Las células se transfectaron con 340 ng de luciferasa del plásmido reportero, 170 ng de β-catenina plásmido de expresión, y 10 ng pRL /pocillo usando el reactivo de transfección Turbofect (Pittsburg, PA, EE.UU.). Después de 5-6 h, se añadió FH535 (o vehículo de control DMSO). Después de un adicional de 36 h, se prepararon extractos de células (preparado de acuerdo con el protocolo de Promega) y se utilizó inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C. Todas las transfecciones se realizaron por duplicado y se repitieron al menos dos veces. Los ensayos de luciferasa se realizaron con extractos de células usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La actividad de luciferasa se midió por duplicado.
ciclo
2.6 de la célula de análisis
p>
2.7 RT-PCR y análisis de Western
RT-PCR.
Las células fueron cultivadas en DMEM + 10% FBS en platos de cultivo de tejidos de 100 mm hasta confluencia ~ 70% y después se trataron con DMSO solo o concentraciones crecientes de FH535 en DMSO para 38 h. Para el análisis de ARN, se recogieron las células y se preparó ADNc como se describe [21]. PCR cuantitativa se llevó a cabo con SYBR verde utilizando el ciclador Bio-Rad MyiQ térmico con los siguientes cebadores: survivina (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG y GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), ciclina D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA y TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), y β2-microglobulina (B2M: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG y TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).
Western Blot.
células Huh7 (5 × 10
5) se cultivaron en DMEM + FBS al 10% en placas de cultivo de tejidos de 100 mm durante 72 h. Después del cambio de medio fresco, las células se trataron con 0, 2,5, 5, y 10 mM de FH535 para 38 h. DMSO (& lt; 0,1%) se utilizaron como control del vehículo. Las concentraciones de proteínas en los extractos celulares se analizaron con el kit de ensayo de proteína BCA micro acuerdo con el protocolo del proveedor (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Los anticuerpos específicos se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). densidad banda Western Blot se ensayó con el software ImageJ NIH (Bethesda, Maryland, EE.UU.), y normalizado por β-actina. Todos los otros procedimientos se realizaron como se describe anteriormente [25].
2.8 estadístico El análisis
Todos los análisis se realizaron utilizando el software SPSS versión 20 (International Business Machines Corporation, Endicott, Nueva York, EE.UU.) . Los datos se presentan como media ± SE. ANOVA de un factor seguido de la corrección de Tukey se utilizó para la comparación de medias. El nivel de significación estadística se estableció en
p
. & Lt; 0,05
Resultados
3.1 FH535 inhibe la activación transcripcional mediada por la de tipo salvaje y constitutivamente activa β-catenina
FH535 se ha demostrado que bloquear la señalización a través endógeno β-catenina en varias líneas celulares, incluyendo la línea celular de hepatoblastoma HepG2 [15]. Para explorar más a fondo este reglamento y para probar si FH535 podría bloquear ectópico β-catenina, co-transfecciones con vectores de expresión de β-catenina y el vector informador de luciferasa TCF4 dependiente TOPflash se lleva a cabo en las líneas celulares de HCC humanos Huh7 y Hep 3B (Fig. 1 ). En ambas líneas celulares, co-transfectadas de tipo salvaje vector de expresión de β-catenina aumento de la actividad de la luciferasa de TOPFLASH casi 15 veces en comparación con las células co-transfectadas con el control de vector vacío (E.V.). Este aumento β-catenina dependiente fue inhibida por FH535 de una manera dependiente de la dosis. β-catenina es a menudo mutados en varios tipos de cáncer, incluyendo HCC. Una mutación natural cambia la serina en la posición 37; esta forma alterada de β-catenina es resistente a la degradación por el complejo APC y por lo tanto tiene una mayor estabilidad. Para probar si esta forma de forma activada de β-catenina también podría ser bloqueada por FH535, un vector de expresión para βCatS37A, en la que la serina en la posición 37 se ha cambiado a una alanina, fue co-transfectadas con TOPFLASH. Como era de esperar, la transactivación mediada por βCatS37A de TOPFLASH fue significativamente mayor que la transactivación por de tipo salvaje β-catenina. Sin embargo, en ambas líneas celulares, la transactivación mediada por βCatS37A se inhibió significativamente por FH535. Como controles, las células fueron co-transfectadas con FOPFLASH, que es idéntica a TOPflash la excepción de que los sitios de TCF4 se han mutado y por lo tanto ya no responde a ß-catenina; FOPFLASH no se activó por de tipo salvaje β-catenina o βCatS37A como se muestra en la Figura 1.
Huh7 (Panel A) y Hep3B células (Panel B) de HCC fueron transfectadas con los genes informadores de luciferasa TOPFLASH (paneles de la izquierda) , que contiene tres sitios de unión a TVC, o E3-pGL3 (paneles de la derecha), que contiene el E3 elemento potenciador AFP que tiene un sitio de TCF altamente conservada. Las células fueron adicionalmente co-transfectadas con un vector de expresión que no contenía inserto (control de vector vacío, E.V.), de tipo salvaje β-catenina (β-catenina), o una forma constitutivamente activa de β-catenina (βcatS37A). Renilla luciferasa se utiliza para controlar las variaciones en la eficiencia de transfección. Seis horas después de la adición de ADN, las células se trataron con DMSO solo (sin tratamiento) o cantidades crecientes de FH535. Después de 48 horas, se determinaron los niveles de luciferasa; luciferasa de luciérnaga se normalizó a Renilla. En ambas líneas celulares, FH535 inhibe la activación de β-catenina que dependen de los genes diana. *
P Hotel & lt; 0,05. El experimento se realizó dos veces con resultados similares.
TOPflash contiene tres motivos de unión consenso TCF4 que confieren la capacidad de respuesta de ß-catenina. Para probar si FH535 también podría bloquear la transactivación mediada por β-catenina de un motivo TCF4 en el contexto de una región reguladora natural, co-transfecciones se realizaron con E3-pGL3. E3 es un fragmento de ~340 pb que contiene la alfa-fetoproteína (AFP) elemento potenciador E3, uno de los tres potenciadores que controlan la expresión hepática del gen de AFP de ratón. E3 contiene sitios de unión para múltiples factores, entre ellos Foxa /HNF6, C /EBP, los receptores nucleares huérfanos, y TCF4 [26] - [27]. Recientemente, hemos mostrado que este potenciador está regulada por ß-catenina en las células y ratones transgénicos [21]. E3-pGL3 se transactivated por β-catenina y en mayor medida por βCatS37A (Fig. 1). Sin embargo, este transactivación por tanto de tipo salvaje y formas S37A de β-catenina fue bloqueado por FH535 de una manera dependiente de la dosis.
3,2 FH535 inhibe la β-catenina mediada por la activación transcripcional en LCSC
estudios anteriores han demostrado que la señalización de β-catenina es elevado en las células EpCAM positivas con propiedades LCSC [28]. Hemos descrito previamente que CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC agresiva formar tumores cuando un pequeño número de estas células se inyectan en ratones nude [29]. Para probar la capacidad de los FH535 para inhibir la β-catenina en estos LCSCs, las transfecciones transitorias se realizaron con TOPFLASH. Como controles, TOPflash también se transfectó en las líneas celulares de HCC Huh7 y PLC (Fig. 2). En las tres poblaciones, las células no tratadas exhibieron niveles de luciferasa bajo. Cuando se tratan con el inhibidor de GSK-3β LiCl, lo que conduce a la activación de β-catenina endógena [30], la actividad de TOPFLASH aumentó dramáticamente. FH535 bloqueado eficazmente la activación mediada por LiCl de TOPFLASH en una forma dependiente de la dosis. Curiosamente, esta inhibición era más robusto en LCSC que en cualquiera de las líneas celulares de HCC. Como control, también se llevaron a cabo transfecciones con FOPFLASH, que ya no es sensible a la ß-catenina. Como era de esperar, la actividad luciferasa en células transfectadas con FOPFLASH no fue ni aumentó ni LiCl inhibido por FH535.
LCSC células (panel izquierdo), Huh7 (panel central) y HPLC (panel derecho) fueron co-transfectadas con TOPflash o genes informadores de luciferasa FOPFLASH junto con la luciferasa de Renilla. Después de 6 horas, las células se dejaron sin tratar (sin tratamiento) o tratados con LiCl solo o LiCl con cantidades crecientes de FH535. LiCl es un activador conocido de la β-catenina. Después de un 36 horas adicionales, se recogieron las células y se determinaron los niveles de luciferasa; luciferasa de luciérnaga se normalizó a Renilla. TOPflash actividad fue altamente inducida en las tres poblaciones de células; esta activación fue inhibida por FH535. El FOPFLASH control negativo mostró una respuesta mínima a LiCl o FH535. la inhibición TOPflash por FH535 era más robusto en LCSC que en cualquiera de las líneas celulares de HCC. *
P Hotel & lt; 0,003,#P & lt; 0,001. El experimento se realizó dos veces con resultados similares.
3,3 FH535 inhibe la proliferación de líneas celulares de HCC y LCSC
Numerosos estudios han demostrado que la β-catenina desempeña un papel importante en la proliferación durante la normalidad desarrollo y en la transformación celular en muchos tejidos, incluyendo el hígado. el desarrollo del hígado se deteriora en ausencia de β-catenina, y las mutaciones que activan la vía de β-catenina se encuentra en aproximadamente un tercio de HCC [4] - [5]. Además, el crecimiento de las células madre progenitoras de adultos hepáticas (células ovales) puede inhibirse mediante el bloqueo de la vía de β-catenina. Dado que nuestros datos indicaban que FH535 puede bloquear la activación transcripcional mediada por β-catenina, también a prueba si la proliferación de líneas celulares de HCC y LCSC se vio afectada por este compuesto. LCSC se cultivaron en presencia de 10% o 1% de suero y con entre 5 mM y 30 FH535 M durante 72 horas, y la proliferación celular se controló por
incorporación de 3H-timidina (Figs. 3A y 3B, respectivamente). Disminución de la proliferación con cantidades crecientes de FH535, con una reducción más dramático se observa en las células cultivadas en presencia de suero inferior; la concentración de FH535 para provocar una inhibición del 50% de las células cultivadas (IC
50) fue 13,8 mM para las células cultivadas en 10% de suero y 5,1 M para las células cultivadas en 1% de suero. Esta inhibición fue más potente que la observada con XAV939 (IC
50 = 55 mM), que inhibe tankirasa, estabilizando así la axina y la promoción de la degradación de β-catenina (Fig. 3C) [31]. FH535 proliferación también bloqueada de células de HCC en concentraciones que eran similares a la observada con LCSC (IC
50 de 10,9 mu M, 9,25 M y 6,6 M para Huh7, PLC y Hep3B, respectivamente; Fig.3D). Para confirmar que FH535 de hecho inhibe la proliferación celular y no dio lugar a un aumento de la muerte celular, se añadieron FH535 y
3H-timidina al mismo tiempo a las células Huh7, que fueron cultivadas durante 18 h. En este escenario, se observó una inhibición significativa de la proliferación a 2,5, 5, 10 y 15 mM de tratamiento FH535, en comparación con el control (p & lt; 0,05, n = 6), con FH535 en 15 M causando una inhibición del 41% (Figura S3 ). Estos datos indican que FH535 está inhibiendo la proliferación de células en lugar de aumentar la muerte celular.
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos en 0,2 ml de medios de comunicación como se describe a continuación durante 72 horas, seguido por la adición de
3H -timidina en 1 Ci /pocillo durante 4 horas. Incorporación de
3H-timidina se determinó por recuento de centelleo. En los paneles A, B y D, la concentración final de DMSO en cada pocillo fue de 0,05%; en el panel C, la concentración final de DMSO en cada pocillo fue 0,1%. (
Un
) LCSCs se sembraron a 1000 células /pocillo en DMEM con 10% FBS junto con DMSO solo o con cantidades crecientes de FH535. (
B Opiniones). LCSCs se sembraron a 5000 células /pocillo en DMEM con 1% de FBS con DMSO solo o con concentraciones crecientes de FH535. (
C
). LCSCs se sembraron en DMEM con 10% FBS a 1000 células /pocillo con DMSO solo o concentraciones crecientes de XAV939. (
D
). células Huh7, Hep3B y PLC se sembraron en DMEM con 10% FBS en 1000, 2500 y 5000 células /pocillo, respectivamente, con DMSO solo o concentraciones crecientes de FH535.
P ¿Cuáles son los valores para todas las tres líneas de células tratadas con FH535 son comparados con los controles. El experimento se realizó dos veces con resultados similares.
induce 3.4 FH535 detención del ciclo celular en la línea celular de carcinoma hepatocelular Huh7 y en LCSC
La capacidad de FH535 para inhibir la proliferación celular nos llevó a investigar la distribución del ciclo celular después del tratamiento. células Huh7 se sincronizaron por el crecimiento en 0,1% de FBS durante 24 horas y después se cultivaron en presencia de 10% de FBS y con no FH535 o FH535 a 7,5 M y 15 mM. Después de 24 horas, se recogieron las células y el contenido de ADN se analizó por tinción con yoduro de propidio. En presencia de FH535, hubo un aumento estadísticamente significativo en el número de células en G0 /G1 y una correspondiente disminución en el porcentaje de células en fase S en comparación con las células cultivadas en ausencia de FH535 (Fig. 4A). El número de células en G2 no se alteró significativamente por FH535. Además, no había ningún pico sub-G1 detectado por citometría de flujo, lo que indica que no se FH535 promoción de la apoptosis en las concentraciones que se uso (véase la figura S4). También hicimos el análisis del ciclo celular en LCSC después del tratamiento FH535 FH535 y encontramos a los 15 M causadas significativamente detención en la fase G1 en LCSC (P = 0,012). FH535 también redujo significativamente la fase G2 /M en el LCSC después de 24 h de 7,5 M y 15 M tratamiento FH535 (P = 0,038 y P & lt; 0,001, respectivamente), no se observó inhibición de la fase S significativa en LCSC (p = 0,446) (Fig. 4B.). Nuestros datos son similares a los resultados publicados anteriormente y refleja la regulación β-catenina de ciclo celular es diferente en diferentes tipos de células [32] - [33]. reguladores del ciclo celular (ciclinas, CDK y reguladores) pueden variar en diferentes tipos de células, lo que podría dar lugar a diferentes respuestas después del tratamiento FH535. Esto puede vale la pena explorar en nuestro estudio futuro.
A. células Huh7 se cultivaron en DMEM + 10% de FBS durante 24 h. Las células se lavaron con DMEM libre de suero 3 veces, después se cultivaron en DMEM + 0,1% de FBS durante 24 h para la sincronización celular. Las células fueron cultivadas en DMEM + 10% FBS, junto con diferentes concentraciones de FH535 para 24 h. Se recogieron las células y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo de GenScript (Piscataway, NJ, EE.UU.). El tratamiento con FH535 aumentó el porcentaje de células en G1 y la disminución del porcentaje de células en fase S. El experimento se realizó dos veces con resultados similares. células B. LCSC se cultivaron en medio de cultivo CelProgen LCSC completa para 24 h. Después, las células se lavaron con medio libre de suero CelProgen 3 veces y se cultivaron en Medio CelProgen + 0,1% de FBS durante 24 h para la sincronización de las células. Después las células se volvieron a CelProgen medio completo + 10% FBS con diferentes concentraciones de FH535 para 24 h. del ciclo celular se ensayó como por Huh7 se ha descrito anteriormente.
3.5 Expresión de los genes diana β-catenina ciclina D1 y survivina es inhibida por FH535
controles
ß-catenina de proliferación celular y la supervivencia por la regulación de la expresión de numerosos genes objetivos. Dos objetivos bien establecidos son los genes que codifican la survivina (BIRC5) y ciclina D1 (CCND1). La survivina es una proteína anti-apoptótica que también regula la progresión a través de la mitosis [34]; Ciclina D1 controla la proliferación mediante la activación de la G1 quinasas CDK4 y CDK6 [35]. Survivina y ciclina D1 transcripción son regulados a través de elementos TVC en sus regiones promotoras [36]. Para probar si FH535 inhibe la expresión de estos dos genes diana β-catenina, en tiempo real RT-PCR se realizó con células LCSC y HCC que fueron tratadas con cantidades crecientes de FH535. los niveles de ciclina D1 y de ARNm de survivina se redujeron en FH535 en las tres poblaciones de células de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5). Para confirmar que esta reducción en los niveles de mRNA también condujo a disminuir los niveles de proteína, el oeste de análisis se realizó utilizando extractos de células enteras a partir de células Huh7. Ambos niveles de proteína ciclina D1 y Survivin se redujeron de una manera dependiente de la dosis, con la mayor reducción se ve en la presencia de 10 mM FH535 (Fig. 6.). El análisis densitométrico indicó que FH535 a los 5 y 10 mM inhibieron Ciclina D1 28% y 64%, respectivamente; FH535 a los 5 y 10 mM inhibió sobrevivir 24% y 48% respectivamente (Fig. 6).
LCSCs, las células Huh7 y Hep 3B se trataron con DMSO solo o concentraciones crecientes de FH535 para 38-PCR en tiempo para la expresión de ciclina D1 (Panel A) o survivina (Panel B). En ambos casos, los niveles de mRNA se representaron gráficamente con respecto a ß
2-microglobulina. El experimento se realizó dos veces con resultados similares.
células Huh7 fueron tratadas con DMSO solo o cantidades crecientes de FH535 para 38-PAGE, y se transfirieron para el análisis de Western con anticuerpos contra la ciclina D1, survivina, y β -actina. La parte superior de la muestra la imagen de transferencia Western; El gráfico inferior muestra el análisis densitométrico de los datos occidentales. Este análisis densitométrico indicó que FH535 a 5 y 10 mM inhibieron la ciclina D1 niveles de proteína 28% y 64% respectivamente; FH535 a los 5 y 10 mM inhibe los niveles de proteína survivina 24% y 48%, respectivamente. El experimento se realizó dos veces con resultados similares.
Discusión
En los últimos años, numerosas vías de señalización han sido implicados en la carcinogénesis hepática. La vía de β-catenina es esencial en las células madre de auto-renovación y mantenimiento de las propiedades de células madre. La alteración de este equilibrio resultados en ambos cambios genéticos y epigenéticos, que se encuentra en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon y carcinoma hepatocelular [4]. En este estudio, hemos utilizado FH535 como un inhibidor de la vía de β-catenina. Este compuesto se ha utilizado previamente para inhibir la expresión de β-catenina en las células de colon y pulmón, así como en las células de hepatoblastoma y HCC [15]. En este informe, los autores concluyeron que FH535 era tóxico para un número de líneas celulares, incluyendo Huh7.