Extracto
La administración oral de células tumorales induce una respuesta inmune hipo-conocido como tolerancia oral. Hemos demostrado anteriormente que la tolerancia oral a un cáncer es el antígeno específico de tumor, no de reacción cruzada y confiere una ventaja de crecimiento del tumor. Hemos investigado la utilización de células T reguladoras de agotamiento (Treg) en la tolerancia oral a un cáncer y su capacidad de controlar el crecimiento del tumor. ratones Balb /c fueron gavage alimenta el tejido tumoral se homogeneiza - JBS fibrosarcoma (para inducir la tolerancia oral a un cáncer), o PBS como control. El crecimiento de los tumores subcutáneos JBS se midieron; extirpa tejido esplénico y citometría de flujo utilizado para cuantificar y comparar Tregs sistémicos y las poblaciones de células T efectoras (teff). Antes de después de la alimentación y /o tumor, los ratones se les administró por vía intraperitoneal anti-CD25, para inactivar Tregs sistémica, o dado de anticuerpos de isotipo como control. Los ratones que fueron tolerizados oralmente antes de la inducción de tumor subcutáneo, muestra niveles significativamente más altos sistémicos Treg (14% vs 6%) y más rápidas tasas de crecimiento del tumor que en los controles (p & lt; 0,05). La regresión completa de los tumores sólo se observaron después de la inactivación de Treg y en todos los grupos - esto no fue inhibida por la alimentación del tumor. Las tasas de curación para la inactivación de Treg eran un 60% durante tolerización, el 75% durante el crecimiento del tumor y el 100% durante la inactivación tanto para tolerización y el crecimiento tumoral. El agotamiento de células T reguladoras dio lugar a un aumento del número de células de teff. agotamiento Treg post-tolerización y la inducción post-tumor condujo a la regresión completa de los tumores en ratones portadores de tumores. La administración oral de tejido tumoral, confiere una ventaja de crecimiento del tumor y se acompaña de un aumento en los niveles de Treg sistémicos. La administración de anti-CD25 Ab disminuyó el número de Treg y causó un aumento en Teffs. tolerancia oral más notable inhibición de las células Treg se sobrepuso estableció con la consiguiente regresión del tumor, especialmente relevante para los cánceres de intestino anterior en que es probable que ser inducido por el derramamiento de tejido del tumor en el intestino tolerancia oral
Visto:. Whelan MC, Casey G , Larkin JO, Guinn Ba, O'Sullivan GC, Tangney M (2014) Tolerancia Oral a cáncer puede ser abrogada por la inhibición de las células T Regulador. PLoS ONE 9 (5): e97602. doi: 10.1371 /journal.pone.0097602
Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncológico, Instituto Nacional del Cáncer IRCCS, Italia |
Recibido: 14 Noviembre 2013; Aceptado: 22 de abril de 2014; Publicado: 15 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Whelan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado a través de una beca de investigación de GOS y MT de investigación del cáncer de Irlanda (CRI06OSUG). MW fue financiada por una beca de la Real Colegio de Cirujanos de Edimburgo y el Real Colegio de Cirujanos de Irlanda. Los autores también reconocen el apoyo del Centro de Investigación del Cáncer Cork. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Incluso teniendo en cuenta tumoral comparable etapas del pronóstico de los pacientes que sufren de cáncer esofágico y gástrico permanece consistente y significativamente más pobres que para los pacientes con cáncer del tracto gastrointestinal distal, a pesar de los avances en las terapias de diagnóstico, quirúrgicos y adyuvantes [1], [ ,,,0],2]. Entre las muchas variables que determinan las tasas de crecimiento del tumor y pronósticos, las diferencias en la capacidad de respuesta inmune tumor es probable que existan entre intestino anterior y otros tipos de cáncer. El procesamiento de antígenos de la dieta (AGS) por el sistema inmune de la mucosa en el tracto gastro-intestinal conduce a una específica inmune hipo-respuesta de tolerancia oral denominado sistémica Ag [3]. Es probable que Ags tumorales derivadas de tejido tumoral arrojar en el intestino por cánceres del intestino anterior sería procesado por los tejidos intestinales asociados linfoides (GALT), que se encuentra predominantemente en el tracto gastrointestinal proximal, de una forma que recuerda a Ags ingeridos por el sistema inmune de la mucosa , creando así un tumor Ag tolerancia inmune específica. Hemos informado anteriormente de que administrar por vía oral tejido tumoral fresco induce una tolerancia inmune específica de tumor Ag no reactividad cruzada con la consiguiente ventaja de crecimiento para el cáncer [4].
El mecanismo de tolerancia a Ags ingerido puede atribuirse a o bien la supresión activa o la inducción de la deleción clonal /anergia [5]. células T clonadas de ratones tolerizados se han atribuido a un subconjunto único de la CD4
+ población, la célula Th3 [6]. En los ratones transgénicos de receptor de células T (TCR), hubo un aumento en las células CD4
+ CD25
+ células en respuesta a la administración oral Ag. Se encontró que estas células T reguladoras para expresar CTLA-4 y Foxp3 y tener una función supresora
in vitro
. CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ células T reguladoras desempeñan un papel en la prevención del desarrollo de enfermedades autoinmunes y tienen una propiedad dual ya que tanto anérgicos y células supresoras. De manera significativa, se ha demostrado que la eliminación de esta población puede inducir la actividad inmune anti-tumor [7] - [10]. En sistemas experimentales, a medida que crecen los tumores, hay un incremento numérico de células T reguladoras en el infiltrado inmune con la consiguiente supresión local de las respuestas inmunes anti-tumorales. Anticuerpo (Ab) mediada eliminación de estas células T reguladoras pueden desenmascara la reactividad inmunológica del tumor natural y esta estrategia se ha demostrado potenciar la destrucción inmunoterapéutico de cánceres experimentales [10] - [12].
Hemos investigado los efectos de la vía oral tolerancia al tumor JBS sobre las tasas de crecimiento del tumor y del tamaño de las subpoblaciones de linfocitos en el ratón Balb /C. Específicamente hemos examinado si la inducción de tolerancia oral a tumores fue Treg dependiente - y si Treg inactivación podría derogar la tolerancia oral e inhibir el crecimiento del tumor
Materiales y Métodos
Cell Tissue Cultura
.
El fibrosarcoma murino JBS [13] se cultivó en matraces de cultivo de tejidos a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2, en DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium -Sigma-Aldrich, Dublín, Irlanda). Los medios de cultivo de tejidos se complementaron con suero de ternera donante hierro-complementado 10%, 50 mg /ml de gentamicina, 300 mg /ml de L-glutamina, y 10 mM HEPES (ácido sulfónico 1-Piperazineethane, 4- (2-hidroxietil) sal monosódica ), pH 7,4. Se utilizaron procedimientos estándar para la tripsinización, centrifugación y resuspensión de las células [13]. el recuento de células viables se llevaron a cabo mediante el uso de tripán azul tipo Exclusión (Sigma, Irlanda).
Declaración de Ética
Todos los experimentos murinos fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Cork (AERR#2010 /003). El estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones establecidas por el Departamento de Niños de Irlanda y de la Salud.
Inducción del tumor
Los ratones se obtuvieron de Harlan Laboratories (Oxfordshire, Inglaterra). Ellos se mantuvieron a una temperatura ambiente constante (22 ° C) con un ciclo de luz natural del día /noche en una colonia de animales convencionales. Se proporcionaron alimentos estándar de laboratorio y agua
ad libitum
. Antes de los experimentos, los ratones se les concedía un período de adaptación de 14 días. ratones Balb /C de ambos sexos y atímicos macho Balb /C HsdOla: ratones nu-MF1 en buenas condiciones, con un peso 16-22 g a las 6-8 semanas de edad, fueron incluidos en los experimentos. Para la inducción de tumor JBS, 2 × 10
6 células tumorales, suspendidas en DMEM 200 l, se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de los ratones. Con este volumen de inóculo y la ubicación había poco extravasación sitio de la punción de la suspensión celular y el crecimiento y la forma del tumor fue consistente.
alimentación por sonda nasogástrica
Tras la inoculación subcutánea de 2 × 10
6 células tumorales JBS en ratones Balb /C, los tumores desarrollados y se les permitió alcanzar un tamaño de 1-2 cm
3, en el que etapa se sacrificaron los animales y se extrajeron sus tumores. Los tumores se homogeneizaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Sigma, Irlanda) usando un homogeneizador FastPrep FP120 (Thermo Electron Corp., Inglaterra). El homogeneizado se lavó extensamente por centrifugación con PBS para eliminar los residuos. Cuando el sobrenadante era macroscópicamente claro el homogeneizado se resuspendió en PBS a una concentración final de 0,2 g (peso húmedo) por ml. Este se dividió en alícuotas y se congeló hasta su uso. El control PBS también se dividió en alícuotas y se congelaron. El uso de una aguja de alimentación con punta de Fr-acero-bola 18 unida a una jeringa de 1 ml, animales anestesiados fueron un-gavage introdujeron 200 l de recién descongelado homogeneizado JBS tumor (40 mg de tumor) o PBS. Los animales fueron alimentados diariamente durante 14 días. La cantidad de alimento y de la duración de la lactancia corresponden a los utilizados en los estudios publicados anteriormente por nuestro grupo y se basan en una revisión de la literatura, en particular en lo que se refiere a los estudios que examinaron la tolerancia a Ags celulares [4], [14] - [17] . El día 15, los animales recibieron una inoculación subcutánea de células tumorales (2 x 10
6 células) y se monitorizaron para el desarrollo de tumores diaria.
tumor Monitoreo
Los tumores se midieron cada 48 horas utilizando un calibre digital. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula estándar
v =
ab
2π /6 y el crecimiento tumoral se construyeron curvas. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente en los casos en que el tumor alcanzó 1,5 cm
3 de diámetro. En el primer experimento, los ratones fueron alimentados con Ag tumor o PBS, y se prepararon de crecimiento y las curvas de supervivencia. En el segundo experimento, las células T reguladoras sistémicos o bien fueron inactivados de forma permanente (denominado empobrecido) utilizando anti-CD25 Ab (clon PC61- Bio-Express, New Hampshire, EE.UU.), agotado temporalmente durante la alimentación única o no agotado. En los ratones experimento final fueron alimentados durante 14 días y posteriormente aleatorizados para recibir anti-CD25 Ab o un control Ab conjugado con anti-peroxidasa de rábano picante (HPRN), Bio-Express, EE.UU. para supervisar el efecto sobre el crecimiento del tumor sc.
Análisis de citometría de flujo
tampón de lisis ACK eritrocitos (0,15 M NH
4Cl, 10 mM de KHCO
3, 0,1 mM Na
2EDTA, pH 7,4 con HCl) se preparó usando reactivos adquiridos de Sigma-Aldrich, Irlanda. La solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,2 micras y se almacenó a 4 ° C. tampón de tinción FACS se preparó a partir de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS de Dulbecco) comprado a Sigma junto con, albúmina de suero bovino (BSA), azida de sodio y suero de ternero fetal. Los bazos y tejido tumoral se retiraron y se desmenuzaron por separado en 70 micras filtro de células de nylon (BD Biosciences, UK). Se recogieron Estas suspensiones de células, se lavaron en medio de cultivo, se sedimentaron a 300 g durante 10 min a 4 ° C y luego se trataron con eritrocitos ACK tampón de lisis durante 3 minutos después de lo cual se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón de tinción FACS. el número de células viables se determinaron mediante una prueba estándar de exclusión de azul de tripano. Las células se diluyeron a continuación hasta una concentración de aproximadamente 2 a 4 × 10
6 por ml de tampón de tinción y 100 l añadido por tubo Falcon (Becton Dickinson). Las suspensiones celulares y reactivos se mantuvieron a 4 ° C durante la preparación.
Cell Surface análisis de marcadores
ficoeritrina-Cy5 (PE-Cy5) anticuerpos conjugados contra CD25 murino y CD3, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con anticuerpos contra CD25 murino, CD3, CD4 y CD8 y el kit de tinción de foxp3 anti-ratón de PE se compraron de eBioscience, Insight Biotechnology, Inglaterra. PE murino anti CD4 y CD3 se adquirieron de Serotec, Oxford, Inglaterra. controles de tinción de isotipo conjugado a un fluorocromo (FITC-IgG, PE-IgG2a y PE-Cy5 IgG control de isotipo) se adquirieron de eBioscience. No conjugada anti-CD16 murino /CD32 (Fcy III /II) monoclonal Ab (Fc bloquea Ab receptor) se adquirió de Serotec.
A fin de minimizar no específica Ab unión, anti-CD16 /CD32 de bloqueo del receptor de Fc Ab se diluyó a 0,01 mg /l en tampón de tinción, a 20 l por pocillo y se incubaron a 4 ° C durante 20 min. anticuerpos conjugados con fluorocromo a marcadores de superficie celular también se diluyeron según las instrucciones del fabricante y se añadieron a cada muestra sin el retiro del Ab Fc bloqueante. Las células se incubaron en la oscuridad a 4 ° C durante 45 min y después se lavaron dos veces en tampón de tinción 250 l antes de la resuspensión en tampón de tinción 500 l para su análisis inmediato o una solución de fijación de 0,5% de paraformaldehído en PBS de Dulbecco. El análisis se realizó dentro de las 48 horas usando un FACSCaliber citómetro de flujo (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) y se analizó mediante el acompañamiento CELLQuest (BD Biosciences) programa de computadora.
En Vivo
Administración Ab
Como se dijo anteriormente, anti-CD25 Ab (PC61) y el control Ab (control de isotipo IgG de rata-hrpN) se administraron intra-peritonealy a una dosis de 1 mg /kg en un volumen total de 200 ul de PBS . El momento de la dosis depende de la protocolo experimental pero cuando dos dosis fueron a ser administrado se les dio cuatro días aparte (Fig. 1). Esto dio lugar a más del 95% de inactivación de células T reguladoras según lo determinado por citometría de flujo.
ratones Los experimentos iniciales implicados que fueron agotados de células T reguladoras para la duración del experimento y fueron referidos como están agotando de forma permanente. Para los experimentos que implican el agotamiento durante tolerización, Treg agotamiento sólo se produjo durante la alimentación del tumor y no cuando se indujeron tumores. El protocolo final (agotamiento posterior tolerización) necesaria tolerancia oral a establecerse antes de la depleción de Treg.
Análisis estadístico
Las diferencias entre los grupos individuales se sometieron a pruebas de Student de dos colas
t-test
para valores pareados. Las diferencias con un
valor de p
inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Administración oral de tumor de tejido confiere una ventaja de crecimiento específico del tumor
Tenemos mostrado anteriormente que los tumores subcutáneos tienen una tasa de crecimiento más rápido en los ratones que fueron alimentados con tumor antes de la inducción del tumor, en comparación con los ratones que fueron alimentados con PBS o un tumor alternativa (CARB o CT26) [4], [13]. También hemos demostrado que la curva de crecimiento del tumor en ratones Balb /C se aproxima a la curva de crecimiento de tumor subcutáneo en ratones desnudos atímicos, que carecen de células T funcionales y estos ratones fueron utilizados como un control incompetente inmune [13]. En este estudio, usando el mismo protocolo de alimentación, se validó que nuestro régimen de alimentación tumor resultó en una tasa de crecimiento del tumor subcutáneo consistente y significativamente mayor en los ratones Balb /C frente a grupos de control. tumores subcutáneos en los grupos alimentados con JBS tumor apareció anterior (día 5 frente a día 6/7) y crecieron significativamente más rápido (p & lt; 0,05) (Fig. 2) en varios puntos temporales
Las curvas de crecimiento de los tumores de JBS. en ratones después de la alimentación por sonda durante 14 días consecutivos con homogeneizado de tumor JBS o con PBS. JBS tumores crecieron significativamente más rápido en los ratones por vía oral tolerizados con JBS. Cada punto representa el volumen medio del tumor de un grupo de seis ratones. La diferencia fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los días 8, 9, 12 y amp; 14 como se indica por un asterisco en el gráfico.
análisis de citometría de flujo de linfocitos en respuesta a la ingestión de tumores
Después de 14 días de tumor oral o la administración de PBS, se analizaron las poblaciones de linfocitos esplénicos . Hubo un aumento significativo de CD4
+ CD25
+ células (p & lt; 0,022) después de la administración del tumor frente PBS. Además hubo un aumento significativo observado en CD25
+ /
Foxp3
+ expresión que sigue compuerta en el CD3
+ CD4
+ la población de linfocitos (p & lt; 0,019) (Fig . 3). No hubo un aumento significativo en el número total de células CD3
+ CD4
+ o CD3
+ CD25
+ células. Tampoco hubo ningún aumento significativo en los CD8
+ CD25
+ teff poblaciones sub-grupo siguiendo el horario de alimentación del tumor. No hubo diferencia observable en el número o proporción de las poblaciones de linfocitos entre aquellos ratones que fueron alimentados con PBS y los que no alimentados a la alimentación forzada durante este periodo (datos no mostrados).
(a) Las gráficas de puntos muestran el número de células T reguladoras en sangre periférica en PBS (I-IV) o JBS (V-, viii) los ratones alimentados. Tregs fueron teñidas utilizando CD3, CD4, CD25 y
foxp3
anticuerpos conjugados con fluorocromos y controles de isotipo y se analizaron en el citómetro de flujo. Las células fueron cerrada en el CD3
+ y CD4
+ (II y VI) y controles de isotipo (I y V) y las posteriores representaciones gráficas de puntos fueron adquiridos a través de esta puerta de CD25
+ y
Foxp3
+ (IV y VIII) y controles (isotipo III y VII). Hubo un aumento significativo de CD4
+ CD25
+ células (p & lt; 0,022) después de la administración del tumor frente PBS. Además hubo un aumento significativo observado en CD25
+ /
Foxp3
+ expresión que sigue compuerta en el CD3
+ CD4
+ la población de linfocitos (p & lt; 0,019). (B) Gráfico que representa los valores de porcentaje medio de los números de Treg menos los controles de isotipo dentro de la población de linfocitos periférica total de ratones alimentados JBS o PBS. Hubo significativamente más células T reguladoras en el bazo de los ratones que fueron alimentados con tumor homogeneizada durante 14 días que los alimentados con PBS solo (p & lt; 0,002; n = 6) guía empresas
El aumento de la tarifa de crecimiento del tumor está asociado con el. la actividad de las células t reguladoras
Hemos demostrado anteriormente que nuestro protocolo de administración de anti-CD25 Ab facilita 90% de inactivación de CD25
+ células durante un período de 14 días [8]. Los ratones fueron aleatorizados para recibir anti-CD25 Ab en el comienzo de la programación de la alimentación de 14 días, y de nuevo al final de la alimentación (referidos como permanente agotamiento) o Ab en el momento de iniciar la alimentación (denominadas como el agotamiento durante tolerización) o control Ab, o ningún Ab (Fig. 1).
las curvas de crecimiento del tumor subcutáneo resultantes mostraron que la ventaja del crecimiento tumoral observado previamente después de la alimentación estuvo ausente en los ratones sometidos a la depleción durante el programa de tolerización, con tiempo para la aparición del tumor y la tasa de crecimiento del tumor similar a los ratones alimentados con PBS, lo que indica la necesidad de células T reguladoras en el momento de la alimentación de tumor para la inducción de la tolerancia oral (Fig. 4a). Como se ve en la Fig. 4b, los tumores en los ratones que recibieron anti-CD25 Ab finalmente una regresión por completo, tanto en el agotamiento durante tolerización y grupos de agotamiento permanentes. Nosotros, y otros, han informado previamente el hallazgo de que anti-CD25 administración antes de la inducción del tumor induce la regresión completa del tumor [8].
(a) No hubo diferencia significativa entre las tasas de crecimiento de tumores entre los ratones alimentados tumorales ( temporal o permanente) y los ratones de control. Los ratones que no recibieron el agotamiento anti-CD25 Ab mostraron significativamente diferentes tasas de crecimiento del tumor en los días 14, 18 y 22 dependiendo de si habían sido alimentados tumor y solución salina (p & lt; 0,05). Cada punto de datos representa los valores medios del tumor durante 10 ratones. (B) Curva de supervivencia de ratones que eran de forma permanente, de manera temporal o no agotado durante la inducción de la tolerancia oral. Los ratones que fueron agotamiento permanente se curaron 100% de su tumor subcutáneo y permanecieron libres de enfermedad a los 100 días. El 75% de los que se agota temporalmente mientras tumores alimentados fueron curados, mientras que el 66% de los que se agota y se alimenta PBS curó temporalmente. No hubo diferencia significativa entre estos grupos. Todos los ratones que recibieron el control de isotipo Ab sucumbieron a la carga tumoral (n = 10).
Los cambios en subpoblaciones de linfocitos observado en respuesta al agotamiento de las células T reguladoras en forma permanente o durante tolerización
en varios puntos de tiempo, los ratones de cada grupo fueron sacrificados y sus bazos se analizaron para CD4 sistémica
+ CD25
+ Treg y CD8
+ CD25
+ número de teff. Tumor feeding aumentó significativamente los números de Treg sistémicas frente a PBS grupos alimentados, y esta diferencia también se observa en anti-CD25 Ab ratones administrado (figura 5a.) (P & lt; 0,01). Sorprendentemente, no se encontró una reducción en el número total Treg en anti-; mientras que hubo un número significativamente más bajos de células T reguladoras en los grupos que recibieron anti-CD25 Ab que los que recibieron el control Ab (Fig. 5b) (0,05 p & lt) PBS alimentados CD25 Ab, los ratones alimentados con el tumor.
(a) Las células se tiñeron para CD3, CD4 y CD25. Las células fueron inicialmente cerrada en CD3 y CD4 posteriormente en
+ CD25
+. Tregs esplénicos se analizaron a partir de ratones que habían sido tratados con el anticuerpo (i) control de isotipo seguido por la alimentación PBS; (Ii) agota temporalmente con el anticuerpo anti-CD25 pero PBS alimentado (iii) agotamiento permanente con el anticuerpo anti-CD25 y PBS alimentado; (Iv) tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo y tumor alimentado, (v) agota temporalmente con anti-CD25 pero tumor alimentado o (vi) agotamiento permanente y tumor alimentado. se muestran gráficos de puntos representativos de los grupos pertinentes, se analizaron tres ratones de cada grupo de tratamiento; (B) Gráfico que representa los datos de la media de los gráficos de puntos en (a). Hay una diferencia significativa entre los ratones que fueron alimentados con tumor o PBS alimentados y permanentemente empobrecido con anti-CD25 (p & lt; 0,01), el agotamiento durante tolerización mientras PBS o JBS alimentado (p & lt; 0,001), Control de Ab, tumor alimentado versus control Ab , PBS alimentado (p & lt; 0,01). Hubo una diferencia significativa entre los ratones que fueron tratados con el control Ab o PBS alimentados y los que fueron tratados con anti-CD25 Ab en cualquier momento y PBS alimentado, (p & lt; 0,05). No hubo diferencia significativa en las células T reguladoras entre cualquiera de aquellos ratones que fueron alimentados con tumores en todos los grupos de tratamiento.
También examinó el efecto de la tolerancia oral y anti-CD25 Ab en la población efectora de linfocitos activados sistémico , a saber, el CD8
+ CD25
+ células. Hubo un aumento en el número de células de teff que se agotaron de forma permanente y tumor alimentado en comparación con todos los otros grupos (Fig. 6) y este valor se acercaba significado.
(a) El bazo de los ratones en cada grupo de tratamiento se tiñeron para determinar CD3
+ /CD8
+ y CD3
+ /CD25
+ números. Los grupos fueron los siguientes (i) alimentado tumor pero no agotamiento de anticuerpo; (Ii) PBS alimentado y no agotamiento de anticuerpo; (Iii) PBS alimentado y anti-CD25 tratada y (iv) tumor alimentado, anti-CD25 tratada. CD8
+ y CD25
+ se examinaron desde dentro del CD3
+ población. Cada experimento se realizó por triplicado; (B) Gráfico que representa los cambios en los números siguientes de teff alimentación del tumor y los agotamientos Ab. Los datos acumulados a partir de gráficos de puntos representados en (a) (n = 3).
Alimentación Anti-CD25 Ab terapia post-tumor supera la tolerancia oral inducida
Para determinar si anti- terapia CD25 Ab puede abrogar una ventaja de crecimiento tumor establecido, los ratones que habían completado el horario de alimentación tumor por vía oral se dividieron aleatoriamente en grupos para recibir anti-CD25 Ab Ab versus control o ningún Ab (PBS solo). La administración de anti-CD25 Ab inmediatamente después de la alimentación tumor, eliminado el observado previamente ventaja de crecimiento tumoral (Fig. 7a). Este se encontró que era significativa en comparación con los otros grupos (p & lt; 0,03). Los datos de supervivencia demostraron que 100% de los ratones que recibieron anti-CD25 Ab fueron curados, una tasa de curación equivalente al grupo de ratones no alimentados tumor y posteriormente tratado con anti-CD25 Ab (Fig. 7b).
( a) Los ratones fueron alimentados con tumor o PBS y se asignaron al azar para recibir anti-CD25 Ab, control de isotipo Ab o PBS. Aquellos que recibió anti-CD25 Ab tenían velocidad de crecimiento tumoral más lento en comparación con los otros grupos. La diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre los que estaban tumor o alimentado PBS se mantuvo en el control de isotipo Ab y no hay grupos AB en ciertos puntos de tiempo (p & lt; 0,05); (B) Los ratones que fueron tolerizados al antígeno tumoral a través de la administración oral de tumor fueron tratados posteriormente con tratamiento anti-CD25 agotamiento de Treg y se curó de su tumor restante tumor subcutáneo libre durante al menos 100 días.
números Treg en ratones curados
El tratamiento Ab anti-CD25 no tuvo efectos a largo plazo sobre el número de Treg. Los ratones curados de sus tumores a través de la administración de anti-CD25 se estudiaron 30 días más tarde y en los números de Treg similares a los animales no tratados previamente con independencia de si eran de los grupos de control por vía oral o tolerizados (Fig. 8).
Ciento treinta días después de haber sido el tratamiento con el anticuerpo anti-CD25, los ratones fueron sacrificados y sus bazos se tiñeron para CD4
+ CD25
+ células T reguladoras. No hubo diferencias significativas observadas en el porcentaje de CD4
+ CD25
+ células entre aquellos ratones que habían curado de su tumor o ratones no tratados (n = 3 por grupo).
discusión
la mayoría de los pacientes que desarrollan cáncer del tracto gastrointestinal superior de la matriz como consecuencia directa de su enfermedad. Incluso para aquellos con tumores clínicamente localizados, que son sometidos a cirugía curativa, las tasas de recaída de cinco años son por lo general por encima de sesenta por ciento [18]. En el momento de la cirugía, la mayoría de estos pacientes tienen micrometástasis en diversos tejidos que indican diseminación hematógena del cáncer en una etapa temprana del desarrollo del tumor. Esto deja a los pacientes en un estado de enfermedad mínima tratamiento post-quirúrgico. Una terapia que podría facilitar el sistema inmunológico para identificar los Ag tumorales sistémicamente sería ideal, si no para borrar toda la carga de la enfermedad, por lo menos para crear un estado de latencia del tumor [19], [20].
Hemos demostrado previamente que el crecimiento de la línea celular débilmente inmunogénica JBS en el flanco de ratones competente inmune condujo a un aumento en el número de células Treg en el ambiente del tumor, pero no sistémicamente [8]. En este estudio hemos modelado la presencia de fragmentos de tumor en el intestino a la situación clínica por alimentación por sonda nasogástrica de células JBS a ratones. Es de esperar que estos fragmentos para ser procesados por el GALT y daría lugar a una hipo-sistémico de respuesta a los Ag tumorales [13]. Hemos demostrado por primera vez que las células CD4
+ CD25
+ Tregs se incrementan sistémicamente en respuesta a la administración oral de todo tumor (JBS). Además, hemos demostrado que la inducción de tolerancia oral a un tumor confiere una ventaja de crecimiento a la cáncer.
ratones cuyos Tregs fueron agotadas por el tratamiento anti-CD25, independientemente de tumor o alimentación PBS, demostrado la regresión de tumores y cura a largo plazo. No hubo diferencias en las tasas de respuesta entre los grupos tumorales alimentado y de control que indica que la inhibición Treg supera eficazmente las tolerancias y el crecimiento tumoral influencias orales combinados. Es probable que los primeros inducción de células T reguladoras en el nivel sistémico, logrado en este estudio de alimentación tumor, es responsable de la ventaja de crecimiento tumoral observada. Es de interés que no había diferencias en el número de CD8
+ células T entre cualquiera de los grupos lo que sugiere que una reducción en Teffs no se produce con la inducción de tolerancia oral. También es probable que la tolerancia oral y respuestas tempranas Treg no inhibieron la sensibilización inmune al tumor pero la función efectora inhibido ya que no había diferencias en el momento o integridad de la regresión del tumor después del tratamiento Ab entre el tumor alimentados tolerizados o el grupo de control PBS de ratones. Hubo una diferencia significativa en el número total de células CD4
+ CD25
+ células T reguladoras en los ratones que recibieron anti-CD25 Ab y eran alimentados grupos tumorales alimentado y la solución salina de control. Esto también se observó en los grupos que se agotaron temporalmente. Sin embargo, sorprendentemente, no hubo una disminución significativa en las células T reguladoras observada entre los grupos que fueron alimentados con tumor y recibieron una pauta de administración de anti-CD25 Ab Ab o control de isotipo. Una posible explicación de esto puede ser debido al análisis de los números de Treg usando CD4
+ CD25
+ sólo en esta etapa del proceso experimental a diferencia de la CD4 más específica
+ CD25
+
Foxp3
+. Ninguna reducción significativa de células T reguladoras puede, de hecho implicar el protocolo experimental y el calendario para el examen de las células T reguladoras y la dosis de anti-CD25Ab, que fue elegido sobre la base de nuestros conocimientos previos de que el agotamiento máximo Treg era dentro de los 7 días de la administración del Ab. La dosis de Ab utilizado en este estudio asegura una reducción del 90% en el número de Treg en ratones no tratados previamente. El aumento general del número de Treg en respuesta a la alimentación no fue tomada en consideración con una mayor dosis de Ab. A pesar de esto, no se observaron diferencias funcionales entre las diferentes dosis de anti-CD25 Ab en las curvas de crecimiento resultantes, lo que sugiere CD4
+ CD25 células
+ Treg están involucrados en la respuesta de células T que confiere la ventaja de crecimiento del tumor después de la alimentación. Esto puede ser debido al hecho de que el efecto de eliminar o inactivar funcionalmente Tregs con agotamientos Ab durante el desarrollo de la tolerancia oral es suficiente para permitir la formación parcial del sistema inmune y el desarrollo de respuestas citotóxicas anti-tumorales. Curiosamente, había más curas visto en los grupos que recibieron anti-CD25 Ab en el momento de alimentar solamente y tumor alimentado (75%) que en los que recibieron Ab en el momento de la alimentación y alimentados PBS (60%). Puede ser que Ag carga con la alimentación y la posterior inactivación de células T reguladoras que da lugar a un aumento del número de teff puede haber ocurrido y resultados similares se han demostrado en otra parte [21].
En la clínica, los pacientes con GALT presentes con un ya sistema inmune oralmente tolerizados, y queda por determinar si la tolerancia oral puede ser superado después de crecimiento del tumor se ha establecido. En los estudios de tolerancia, se ha demostrado que la transferencia adoptiva de células T reguladoras en modelos murinos puede superar enfermedad mediada inmune [5]. En este estudio, hemos examinado si la eliminación de células T reguladoras puede permitir el desarrollo de una respuesta de células T citotóxicas a un tumor subcutáneo. Después de la alimentación de tumor y el establecimiento de la tolerancia oral, un solo programa de dosificación de anti-CD25 Ab elimina la ventaja de crecimiento del tumor que normalmente se observa en ausencia de tratamiento anti-CD25 Ab. Por otra parte, la administración de anti-CD25 Ab llevó a curas en todos los ratones que albergan tumores subcutáneos. Hemos demostrado que incluso una tolerancia oral establecido a un tumor Ag, y el crecimiento del tumor agresivo resultante y supervivencia más pobre, puede ser superado por la terapia de la atenuación de Treg. Este resultado sugiere que el cáncer del tracto gastrointestinal superior serían susceptibles a las terapias que tratan de inactivar la actividad de células Treg establecido. También es importante tener en cuenta que la terapia anti-CD25 Ab no afectó a las poblaciones Treg sistémicos en ratones tratados después de la terapia, en comparación con los ratones no tratados previamente. Esto es importante ya que limita la posibilidad de que la terapia anti-CD25 Ab de enfermedades autoinmunes podría eliminar Tregs completamente o permanentemente
Los resultados de este estudio sugieren un mecanismo de tolerancia -. Una supresión mediada por células T de una antitumoral respuesta inmune. La identidad de la Ag (s) tumoral aún no se ha establecido; Sin embargo, este estudio confirma y amplía las observaciones de los informes anteriores en los que se demostró la alimentación del tumor Ags a poner en peligro la citotoxicidad antitumoral y por lo tanto apoya la hipótesis de que el tumor Ags que se derramó en el tracto gastrointestinal superior y procesada por el sistema inmunitario de la mucosa puede dar lugar a abajo