Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer, y alrededor del 85% de los casos son no pequeñas cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Es importante destacar que, el reciente avance en la investigación del cáncer sugiere que la alteración de la bioenergética celular de cáncer puede proporcionar una manera eficaz de dichas células objetivo con cáncer avanzado que han adquirido mutaciones en múltiples reguladores celulares. Este estudio tiene como objetivo identificar las alteraciones bioenergéticas en células de cáncer de pulmón mediante la medición y comparación de las actividades metabólicas clave en un par de líneas de células que representan a las células normales y NSCLC desarrollados a partir de un mismo paciente directamente. Se encontró que las tasas de consumo de oxígeno y la biosíntesis del grupo hemo se intensificaron en las células NSCLC. Además, las células de NSCLC exhibidos aumentaron sustancialmente los niveles en una matriz de proteínas que promueven la síntesis del grupo hemo, la absorción y la función. Estas proteínas incluyen la enzima limitante de la velocidad de biosíntesis de hemo ALAS, proteínas transportadoras y HRG1 HCP1 que están implicados en la absorción de heme, y varios tipos de hemoproteínas-utilización de oxígeno tales como citoglobina y las llamativas citocromos. Varios tipos de xenoinjertos de tumores humanos también muestran aumento de los niveles de tales proteínas. Además, hemos encontrado que la reducción de la biosíntesis de hemo y la absorción, como la reducción de la respiración mitocondrial, reduce efectivamente el consumo de oxígeno, la proliferación de células de cáncer, la migración y la formación de colonias. En contraste, la reducción de la degradación del hemo no tiene un efecto sobre las células de cáncer de pulmón. Estos resultados muestran que el aumento de flujo de hemo y la función son una característica clave de las células de NSCLC. Además, el aumento de generación y suministro de hemo y hemoproteínas-utilización de oxígeno en las células cancerosas dará lugar a consumo de oxígeno y la intensificación de la producción de energía celular por la respiración mitocondrial, lo que alimentar la proliferación celular y la progresión del cáncer. Los resultados muestran que la inhibición de hemo y la función respiratoria puede detener eficazmente la progresión de las células de cáncer de pulmón. Por lo tanto, la comprensión de la función del hemo puede repercutir positivamente sobre la investigación en la biología del cáncer de pulmón y la terapéutica
Visto:. Hooda J, D Cadinu, Alam MM, Shah A, Cao TM, Sullivan LA, et al. (2013) Mayor rendimiento en hemo y mitocondrial respiración Promover la progresión de las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (5): e63402. doi: 10.1371 /journal.pone.0063402
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2013; Aceptado: March 31, 2013; Publicado: 21 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Hooda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Cecil H. e Ida fondos verdes (LZ) y la subvención del NCI SPORE P50CA70907 (RB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células tumorales tienen una mayor demanda de nutrientes que proporcionan energía celular y bloques de construcción metabólicos. El aumento de la demanda metabólica en las células tumorales a menudo acompaña a la alteración del metabolismo. En la década de 1920, Otto Warburg demostró que las células tumorales metabolizar la glucosa y generan lactato a niveles más altos a pesar de la presencia de oxígeno suficiente, un fenómeno llamado el efecto Warburg [1], [2]. Estudios más recientes han descubierto los eventos moleculares que subyacen a muchas alteraciones metabólicas en las células del cáncer [3] - [5]. Por ejemplo, Anastasiou et al. [5] mostró recientemente que la enzima piruvato quinasa M2 (PKM2), que es la piruvato quinasa predominante que se encuentra en las células cancerosas, es crucial para el mantenimiento de la homeostasis redox celular. Además, estudios recientes sugieren que las enzimas metabólicas pueden actuar como supresores de tumores (por ejemplo, fumarato hidratasa y succinato deshidrogenasa), o oncogenes (por ejemplo, mutante isocitrato deshidrogenasa 1 y 2) [6] - [8]. Estos estudios recientes confirman que el metabolismo alterado es de hecho una característica del cáncer, y sugirieron que los cambios en el metabolismo en las células cancerosas son mucho más complejos que los que se sugirió inicialmente.
Estudios recientes ilustran que el flujo glucolítico mejorada en células de cáncer no depende de consumo de oxígeno disminuida o la respiración mitocondrial [9] - [11]. Por ejemplo, dos estudios separados [12], [13] demostraron que la respiración mitocondrial se amplifica en células de cáncer de mama humano. Otro estudio mostró que las células cancerosas pueden mantener la fosforilación oxidativa en una disminución, pero todavía tasa sustancial incluso a nivel de oxígeno% 1 [14]. Estos resultados ponen de manifiesto que la respiración mitocondrial y la función son cruciales para el metabolismo de las células cancerosas y la bioenergética. En particular, el hemo es un factor central en la función mitocondrial y el metabolismo del oxígeno [15], [16]. Hemo juega un papel crítico en prácticamente todos los procesos implicados en el metabolismo del oxígeno. Heme sirve como un grupo prostético de la hemoglobina, la mioglobina y otros globinas que el transporte o tienda de oxígeno, en los complejos mitocondriales de la cadena respiratoria, en citocromo oxigenasas P450s y otros que utilizan oxígeno para la biosíntesis y la degradación de las reacciones, y en otras enzimas que utilizan o desintoxican oxígeno tal como peroxidasas y catalasas [15], [17]. Del mismo modo, la biosíntesis de hemo requiere oxígeno como sustrato, aunque la Km de las enzimas de biosíntesis de hemo para oxígeno es muy baja [18]. Por lo tanto, hemo y el oxígeno están estrechamente vinculados y son interdependientes.
A continuación se investiga la función del hemo y las mitocondrias en el desarrollo del cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los EE.UU. y en todo el mundo, y aproximadamente el 85% de los casos son el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [19], [20]. La mayoría de los pacientes han avanzado a nivel local en estadio III /IV de tumores en el momento de la presentación [21]. Explotación de vulnerabilidades metabólicos puede proporcionar estrategias alternativas eficaces para combatir la progresión del cáncer de pulmón. Por lo tanto, hemos caracterizado y comparado con el metabolismo del oxígeno y la función del hemo en HBEC30KT y HCC4017 células [22], [23]. Este par de líneas celulares representan las células normales HBEC no maligno (HBEC30KT) y NSCLC (HCC4017) desarrollados a partir de un mismo paciente. Se comparó el metabolismo y perfiles moleculares de este par emparejado de líneas de células cultivadas bajo condiciones idénticas. Estábamos interesados en determinar si y en qué medida el metabolismo del oxígeno y los niveles de hemo se alteran y si estas alteraciones contribuyen al mantenimiento y la proliferación de células de cáncer de pulmón. Nuestros datos indican que el consumo de oxígeno y la síntesis de heme se intensifican de forma significativa en las células de cáncer de pulmón, en comparación con las células normales. Además, los niveles de las proteínas implicadas en la síntesis de hemo intracelular y la absorción se incrementa sustancialmente en células de cáncer de pulmón. Además, los niveles de hemoproteínas-utilización de oxígeno, tales como cytoglobin, se incrementaron dramáticamente en las células cancerosas. La inhibición de heme o de la función mitocondrial suprime preferentemente el consumo de oxígeno, la proliferación de células de cáncer, la formación de colonias y la migración. Estos resultados muestran que la síntesis de hemo y hemoproteínas en cáncer de pulmón de células resulta en el consumo de oxígeno y la intensificación de la respiración mitocondrial que el desarrollo de células de cáncer de combustible.
Materiales y Métodos
Mantenimiento de pulmón de células, tratamiento y mejora de la célula Conde
HBEC30KT y líneas celulares HCC4017 que representan las células normales y NSCLC [22], [23] fueron proporcionados por el laboratorio del Dr. John Minna (UTSW) como un regalo. Fueron desarrollados a partir del mismo paciente y se mantuvieron en ACL4 suplementado con FBS al 2% por debajo del 5% de CO
2 a 37 ° C [23]. Para el tratamiento con el inhibidor de la síntesis de heme, acetona succinil, las células se cultivaron en medio que contenía suero de hemo-agotado. suero agotado Heme se preparó como se describe anteriormente [24]. Para medir el efecto de reactivos sobre la proliferación de células de pulmón, las células se sembraron en placa de 48 pocillos a una densidad de 10
3 células /pocillo. Después de cultivar durante 24 h, las células se trataron con acetona succinil 0,5 mM o con 10 mM carbonil cianuro 3-clorofenilhidrazona (CCCP). Cada tratamiento post 24 h, el número de células vivas se contó usando tinción con azul tripán y un hemocitómetro.
Medición del consumo de glucosa, el consumo de oxígeno y heme síntesis
Para medir el consumo de glucosa en las células, (~ 90% de confluencia) se incubaron durante 24 horas con medio fresco. nivel de glucosa en el medio de cultivo se midió usando el kit de ensayo de glucosa (GO) (Sigma). El consumo de oxígeno se midió, como se describe anteriormente [25]. Brevemente, las células con aproximadamente 80% de confluencia se trataron con tripsina y se resuspendieron en medio fresco, saturada de aire. Para cada medición, 10
6 células (en 350 l) se introdujeron en la cámara de un sistema de Oxygraph (Hansatech Instruments), con un electrodo de tipo Clark colocado en la parte inferior de la cámara respiratoria. Durante las mediciones, la cámara fue termostatizada a 37 ° C por un baño de agua circulante. Una barra de agitador electromagnético se utilizó para mezclar los contenidos de la cámara. tasa de síntesis de hemo se midió como se describe [24]. Brevemente, las células se trataron con 0,5 acetona succinil mM, o 10 CCCP mu M durante 48 h, y se incubaron con 0,3 Ci de [4-
14C] ácido 5-aminolevulínico (PerkinElmer Life y Analytical Sciences) durante 24 h. El hemo se extrajo de estas células mediante el uso de ácido clorhídrico en acetona y éter dietílico, y se midió la cantidad de hemo radiomarcado, como se describe [26]. La incorporación de radiactividad en el hemo extraído permite la medición de la biosíntesis de hemo. La cantidad de hemo radiomarcado se midió por recuento de centelleo.
-PCR en tiempo real cuantificación y detección de ADN mitocondrial
Los cebadores de oligonucleótidos para la medición de los niveles de transcripción de genes fueron diseñados utilizando el programa Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). β-actina se utilizó como control para la cuantificación relativa de transcritos. ARN total fue extraído de las células no tratadas o tratadas con 0,5 acetona succinil mM en un medio de hemo-agotado utilizando reactivo TRIzol (Invitrogen). RNA se purificó utilizando el kit RNeasy (Qiagen). La transcripción inversa y la PCR se realizaron en un solo paso utilizando el LightCycler RNA Maestro SYBR Green I Kit (Roche Applied Science), de acuerdo con el protocolo del fabricante. PCR se realizó usando un Roche LightCycler. Los cálculos se realizaron utilizando el software de Roche LightCycler. Las secuencias de cebadores utilizados para la PCR en tiempo real fueron los siguientes: β-actina: delantero 5'CACAGGGGAGGTGATAGCAT 3 ', 5'-revertir CACGAAGGCTCATCATTCAA -3'. ALAS1: adelante 5'-CACACACCCCAGATGATGAA 3 ', 5'-reversa CCTGCAGAAGTTGCACTCAG -3'. ALAS2: hacia adelante 5'-TGTCACCACCTATGCCTGAG -3 ', 5'-inversa GGCACACAACAAAGCAGAAG -3'
Se midió el contenido de ADNmt y se compara mediante la cuantificación de los niveles del gen 16S rRNA mitocondrial y el gen GAPDH nuclear, por. usando PCR en tiempo real, tal como se describe anteriormente [27]. Las secuencias de cebadores usados fueron como sigue (5'-3 '): GAPDH: TTCAACAGCGACACCCACT hacia adelante, CCAGCCACTACCAGGAAAT inversa. 16S rRNA: CCAAACCCACTCCACCTTAC hacia adelante, TCATCTTTCCCTTGCGGTA inversa. La amplificación por PCR en tiempo real se realizó utilizando el LightCycler DNA Comienzo Acelerado Maestro
PLUS kit SYBR Green I (Roche Applied Science), de acuerdo con el protocolo del fabricante. En tiempo real la amplificación por PCR para cada muestra se realizó en tripletes. Los datos fueron recogidos y analizados utilizando el software LightCycler. Se calculó la relación de mitocondrial (16 rRNA) vs. ADN nuclear (GAPDH).
Preparación de extractos de proteínas, transferencia Western y microscopía de inmunofluorescencia
HBEC30KT y HCC4017 células fueron tratadas, se recogió y se lisaron utilizando el tampón RIPA (Cell Signaling Technology) que contiene el cóctel inhibidor de la proteasa. xenoinjertos de tumor humano se mantuvieron, y lisados de los xenoinjertos de tumores humanos se prepararon como se describe [28]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el kit de ensayo BCA (Thermo Scientific). 50 g de proteínas de cada condición de tratamiento se sometieron a electroforesis en 9% en geles de SDS-poliacrilamida, y luego transferidos a la Immuno-Blot PVDF membrana (Bio-Rad). Las membranas se sondaron con anticuerpos policlonales, seguido por la detección con un kit de transferencia de Western de quimioluminiscencia (Roche Diagnostics). Las señales se detectaron mediante el uso de una estación de imagen Carestream 4000MM Pro, y la cuantificación se realizó utilizando el software de imágenes moleculares Carestream versión 5.0.5.30 (Carestream Health, Inc.). La tinción de inmunofluorescencia se realizó siguiendo los procedimientos establecidos por el fabricante del anticuerpo. imágenes fluorescentes FITC y DAPI fueron capturados utilizando un microscopio de fluorescencia multicanal Zeiss Axio Observer.Z1. Policlonales anti-ALAS1, anti-HRG1, c anti-citocromo, anti-cytoglobin, anti-CYP1B1, anti-Cox-2 y anti-HCP1 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. anticuerpo anti-β-actina monoclonal fue adquirido de Señalización Celular Tecnología.
La formación de colonias y Cell ensayos de migración
Para el ensayo de formación de colonias, se contaron HCC4017 células y se sembraron a una densidad de 1000 células por bien en placas de 6 pocillos. Las células fueron tratadas con o sin acetona succinil 0,5 mM, acetona succinil + hemo (10 mM), 10 mM carbonil cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP), o 10 mM de estaño protoporfirina IX (SnPP). El medio se actualiza cada cuatro días. Después de 10-12 días, las células fueron fijadas en etanol al 70%, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. Las imágenes fueron adquiridas utilizando el HP Scanjet 8270.
Un ensayo cero in vitro se utilizó para examinar el efecto del hemo y la deficiencia de hemo sobre la migración celular HCC4017, como se describe [29]. Brevemente, HCC4017 células fueron tratadas sin o con 0,5 mM de acetona succinilo, acetona succinil + hemo (10 mM), o 10 mM de estaño protoporfirina IX (SnPP) durante 6 días. Luego, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de cultivo en 95% de confluencia. Las monocapas se rascaron con una punta de pipeta estéril 200 l y luego se lavaron varias veces con PBS para eliminar los restos celulares. Las células fueron mantenidas en los medios correspondientes, y la migración de las células se controló usando un microscopio. Imágenes representativas fueron capturadas a lo largo del rasguño en diversos puntos temporales. Cada tratamiento se realizó por triplicado.
Resultados
Las células de NSCLC mostrar las tarifas La intensificación del consumo de oxígeno
medir y comparar las tasas de consumo de glucosa y oxígeno en un par emparejado de las células normales, no maligna del epitelio bronquial (HBEC30KT) y NSCLC (HCC4017) [22], [23]. La Tabla 1 muestra que las tasas de tanto el consumo de glucosa y el oxígeno en HCC4017 células fueron elevados, con la elevación del consumo de oxígeno se aproxima 2,5 veces (Tabla 1). Sin embargo, la proporción de ADN mitocondrial de ADN nuclear, medida como se describe [30], no fue diferente entre las líneas celulares. Estos datos sugieren que, si bien la función mitocondrial no se interrumpa, la respiración mitocondrial se ha mejorado sustancialmente en las células NSCLC.
La Tasa de hemo Biosíntesis y los niveles de expresión de biosíntesis del grupo hemo enzimas se incrementó significativamente en células de cáncer de pulmón
el hemo sirve como un grupo prostético en muchas proteínas y enzimas que transportar, almacenar y utilizar el oxígeno y puede regular directamente muchos de los procesos que intervienen en el metabolismo del oxígeno [15], [16]. Por lo tanto, razonó que el consumo de oxígeno mejorada en células de NSCLC puede ser atribuible a un aumento de los niveles de hemo y hemoproteínas. Para probar esta posibilidad, primero se miden y comparan los niveles de síntesis del grupo hemo en NSCLC y las células normales. Se encontró que la tasa de síntesis de heme fue significativamente mayor en las células de NSCLC HCC4017, en comparación con las células normales HBEC30KT (Figura 1A). El potente inhibidor de la síntesis del grupo hemo, acetona succinil (SA) [24], [31], inhibe la síntesis del grupo hemo en el CPNM y las células normales, como se esperaba. acetona succinil ha demostrado previamente para ser un inhibidor específico y potente de la síntesis de heme en diversas células que van a partir de células HeLa, las células PC12 a células de ratón primario neuronales [32] - [37]. Curiosamente, el CCCP mitocondrias desacoplador (carbonil cianuro meta-clorofenilhidrazona) también redujo la tasa de síntesis de hemo, aunque en menor grado (Figura 1A). CCCP desacopla la fosforilación oxidativa con la generación de ATP en la mitocondria [38]. Debido a que la tasa de consumo de oxígeno es muy alta, en comparación con lo que se necesita para la biosíntesis de hemo (Tabla 1), la cantidad de oxígeno utilizado para la biosíntesis de hemo es insignificante [18].
El epitelial de pulmón HBEC30KT normal (HBEC células NSCLC) y HCC4017 (HCC) se cultivaron, se extrajeron ARN y proteínas. Los niveles de transcripción se detectaron utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR, y los niveles de proteína se detectaron mediante el uso de transferencia Western. (A) Los niveles de biosíntesis de hemo en células normales y NSCLC. (B) El nivel de transcripción de la enzima de biosíntesis del grupo hemo ALAS1 en células normales y NSCLC. (C) El nivel de transcripción de la enzima de biosíntesis del grupo hemo ALAS2 en células normales y NSCLC. (D) El nivel de proteína de la enzima de biosíntesis del grupo hemo ALAS1 en células normales y NSCLC. El nivel de proteína de β-actina en las muestras se utilizó para la normalización. Para el análisis estadístico, los niveles en las células del cáncer se compararon con los niveles en las células normales, mediante el uso de Welch-2 muestra de t-test. *, Valor de p & lt; 0,05; **, P valor. & Lt; 0,005
A continuación, se midió el nivel de expresión de ALAS1 (sintasa ácido 5-aminolevulínico 1), que es la enzima limitante de la velocidad de síntesis del grupo hemo en células nonerythorid, incluyendo células de pulmón [39]. Inicialmente se midieron los niveles de transcripción ALAS1 en NSCLC y células normales usando tiempo real RT-PCR. Figura 1B muestra que el nivel de transcripción del gen ALAS1 no eritroide fue de hecho aumentó en las células cancerosas. Como era de esperar a partir de estudios anteriores [[40], [41] y las referencias en él], inhibición de la actividad ALAS por acetona succinil causados inducción de ALAS1 tanto en el cáncer y las células normales, aunque el alcance de la inducción parece ser mayor en las células cancerosas. El gen ALAS2-eritroide específica no se cree que se expresa en las células pulmonares normales; Sin embargo, los datos proporcionados por el Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) sugirieron que ALAS2 se expresa en el 16% de los tejidos de cáncer de pulmón. Por lo tanto, también medimos el nivel de transcripción ALAS2 en células pulmonares (Figura 1C). De hecho, el nivel de transcripción ALAS2 se incrementó en HCC4017 células en casi cinco veces. Succinil acetona no tuvo un efecto mensurable sobre el nivel ALAS2, como se esperaba, debido a que la expresión de ALAS2, a diferencia de ALAS1, no está regulado por el nivel de hemo [40]. Además, confirmó el aumento de nivel de proteína en el cáncer de ALAS vs. células normales. La Figura 1D muestra que el nivel de proteína ALAS1 fue significativamente mayor en las células cancerosas, y se aumentó aún más por acetona succinil. Esto es consistente con estudios anteriores que muestran que heme puede regular negativamente ALAS1 transcripcionalmente y posttranscriptionally [40], [41]. No fuimos capaces de detectar la proteína ALAS2, quizás debido a su bajo nivel en las células pulmonares. Aunque su nivel de transcripción se detecta en células de cáncer de pulmón, su nivel parece ser significativamente menor en comparación con la de ALAS1.
Los niveles de proteínas hemo captación HCP1 y HRG1 y Hemoproteins oxígeno-utilización se aumenta en las células del cáncer de pulmón
Para determinar aún más la función del grupo hemo en células de NSCLC, se compararon los niveles de dos transportadores de hemo HCP1 (hemo proteína transportadora 1) y HRG1 (hemo gen de respuesta 1) [42], [43]. Se expresan y participan en la absorción de hemo en diversas células no polarizados [43] - [46]. Se encontró que los niveles de HCP1 y HRG1 se incrementaron drásticamente en HCC4017 células, en comparación con las células normales (Figura 2A & amp; 2B). La inhibición de la síntesis del grupo hemo por acetona succinil no afectó significativamente HCP1 y HRG1 niveles, en consonancia con los resultados anteriores en células de mamífero [44].
El epitelial HBEC30KT pulmón normal (HBEC) y células de NSCLC HCC4017 (HCC) se cultivaron y se trató como se indica. Los extractos de proteína se prepararon y los niveles de HCP1 y HRG1 se detectaron por transferencia de Western. El nivel de proteína de β-actina en las muestras se utilizó para la normalización. (A) El nivel de proteína hemo HCP1 transportador en células normales y NSCLC. (B) El nivel de proteína hemo HRG1 transportador en células normales y NSCLC. Para el análisis estadístico, los niveles en las células del cáncer se compararon con los niveles en las células normales, mediante el uso de Welch-2 muestra de t-test. **, Valor de p. & Lt; 0,005
El aumento de hemo proteínas de captación y HCP1 HRG1 puede proporcionar hemo adicional para la producción de las hemoproteínas. Por lo tanto, hemos detectado los niveles de varias hemoproteínas que intervienen en el transporte y utilización del oxígeno. Cytoglobin es un hemoprotein expresado en fibroblastos y es probable que facilita el transporte de oxígeno y la utilización de [47], [48]. En las células epiteliales de pulmón normales, no se detectó cytoglobin, pero se expresó con fuerza en HCC4017 células (Figura 3A). Del mismo modo, los niveles de otras tres hemoproteínas que intervienen en la utilización de oxígeno, el citocromo c, CYP1B1 y COX-2, también se mejoraron significativamente (Figura 3B-3D). Evidentemente, mientras que los niveles de citoglobina y las llamativas citocromo c se redujeron cuando el suministro de hemo intracelular se redujo mediante el cultivo de células en medio de hemo-agotado y por tratamiento con la síntesis del grupo hemo acetona succinil inhibidor, afectado por los niveles de hemo, los niveles de CYP1B1 y Cox-2 no eran. Esto puede ser atribuible a los diferentes mecanismos que gobiernan la regulación de estas proteínas. Tal vez regula heme directamente la expresión de citoglobina y las llamativas citocromo c, mientras que un mecanismo de hemo-independiente contribuye a los mayores niveles de CYP1B1 y COX-2 en células de cáncer. Alternativamente, heme puede regular la expresión de CYP1B1 y Cox-2, pero la concentración de regulación heme puede ser mucho menor que para la expresión de citoglobina y las llamativas citocromo c. Por lo tanto, el nivel más bajo del grupo hemo en células tratadas con acetona succinilo puede reducir los niveles de citoglobina y las llamativas citocromo c, pero no CYP1B1 y Cox-2.
El epiteliales normales HBEC30KT pulmón (HBEC) y NSCLC HCC4017 (HCC) las células fueron cultivadas y tratadas como se indica. Los extractos de proteína se prepararon y los niveles de hemoproteínas se detectaron por transferencia de Western. El nivel de proteína de β-actina se utilizó para la normalización. (A) El nivel de proteína cytoglobin en células normales y NSCLC. (B) El nivel de proteína citocromo c en las células normales y NSCLC. (C) El nivel de proteína CYP1B1 en células normales y NSCLC. (D) El nivel de proteína de la Cox-2 en células normales y NSCLC. Para el análisis estadístico, los niveles en las células del cáncer se compararon con los niveles en las células normales, mediante el uso de Welch-2 muestra de t-test. *, Valor de p & lt; 0,05; **, P valor. & Lt; 0,005
El efecto de la reducción de la oferta hemo intracelular de estas proteínas también puede ser observado mediante tinción de inmunofluorescencia. Por ejemplo, la Figura 4A muestra que ALAS1 exhibió un patrón de localización mitocondrial, en particular cuando su nivel se incrementó en las células tratadas con acetona succinil. Cuando la fluorescencia de fondo era baja en el panel SA (Figura 4A), FITC fluorescencia claramente colocalized con la fluorescencia de MitoTracker, y el patrón mitocondrial era mucho más clara. El patrón en el panel Nada es menos claro, probablemente debido a la fluorescencia de fondo causado por un menor nivel de ALAS1 y la tinción de anticuerpos de fondo. La Figura 4B muestra que el citocromo c exhibió un patrón de localización mitocondrial, pero su nivel se redujo en las células tratadas con acetona succinilo, y su localización mitocondrial también se debilitó. Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia indirecta son consistentes con los resultados de la transferencia Western. En conjunto, estos resultados muestran que el aumento de la síntesis del grupo hemo y la absorción se asocia con una mayor producción de diversos hemoproteínas-utilización de oxígeno en las células cancerosas.
células NSCLC HCC4017 (HCC) se cultivaron en medio regular (ninguno) o en heme- medio agotado que contiene 0,5 mM de acetona succinil (SA). Las células se tiñeron primero con anticuerpos anti-citocromo C anti-ALAS1 o, y luego con FITC-conjugado de cabra anti-conejo anticuerpo secundario, MitoTracker, así como DAPI. FITC, MitoTracker y las imágenes de fluorescencia DAPI fueron capturados y se muestran aquí. La barra de escala indica 10 micras.
Los niveles de la biosíntesis del grupo hemo de la enzima ALAS, hemo proteínas de captación y HCP1 HRG1, y Hemoproteins oxígeno-utilización se incrementan en diversos xenoinjertos de tumor humano
para determinar si el aumento de la enzima limitante de la velocidad de biosíntesis de hemo ALAS, proteínas de captación de heme, y varias hemoproteínas-utilización de oxígeno se produce en tumores de pulmón, se evaluaron los niveles de estas proteínas en cinco xenoinjertos de tumores humanos diferentes (Figura 5). La Figura 5A muestra que en todos los tumores de xenoinjertos, la proteína ALAS1 se expresó en niveles comparables a la de HCC4017 células, pero significativamente mayor que en las células normales HBEC30KT (véase la Figura 1D). Del mismo modo, los niveles de transportadores de hemo HCP1 (Figura 5B) y HRG1 (Figura 5C) fueron elevados en los tumores de xenoinjertos. Los niveles de proteínas, se une al oxígeno que contienen hemo cytoglobin (Figura 5D) y citocromo P450 CYP1B1 (Figura 5E) también se han mejorado en los tumores. Estos resultados muestran que la síntesis de heme mejorada, absorción y la síntesis de hemoproteínas-utilización de oxígeno se producen en diversas células de pulmón y tumores.
lisados de los xenoinjertos de tumores humanos indicados se prepararon, y se detectaron los niveles de las proteínas indicadas mediante transferencia Western. El nivel de proteína de β-actina se utilizó para la normalización. (A) El nivel de proteína en ALAS1 HCC4017 células y en diversos xenoinjertos de tumores humanos. (B) El nivel de proteína en HCP1 HCC4017 células y en diversos xenoinjertos de tumores humanos. (C) El nivel de proteína en HRG1 HCC4017 células y en diversos xenoinjertos de tumores humanos. (D) El nivel de proteína en cytoglobin HCC4017 células y en diversos xenoinjertos de tumores humanos. (E) El nivel de proteína CYP1B1 en células HCC4017 y en diversos xenoinjertos de tumores humanos. Para el análisis estadístico, los niveles en HCC4017 células y tumores se compararon con los niveles en las células normales, mediante el uso de Welch 2 muestra de t-test. *, Valor de p & lt; 0,05; **, P valor. & Lt; 0,005
La reducción de hemo disponibilidad de células de NSCLC Suprime Preferentemente Consumo de Oxígeno
El aumento de la síntesis de las hemoproteínas-utilización de oxígeno probable que puede contribuir a la intensificación del consumo de oxígeno en el cáncer Células. Para probar esta idea, hemos examinado el efecto del ozono hemo en la tasa de consumo de oxígeno en el cáncer de pulmón y las células normales. Se encontró que el consumo de oxígeno en las células de NSCLC se redujo selectivamente cuando las células se cultivaron en medio hemo-empobrecido (véase la Figura 6, HD). En contraste, el agotamiento de heme en el medio no afectó el consumo de oxígeno en las células normales. La inhibición de la síntesis del grupo hemo endógeno por succinil acetona (HD + SA, Figura 6) redujo aún más el consumo de oxígeno en las células cancerosas a un nivel similar al nivel en las células tratadas con el CCCP desacoplador mitocondrial. Succinil acetona tuvo un efecto menor en las células normales, así (Figura 6). Evidentemente, la inhibición de la hemo oxigenasa, la enzima implicada en la degradación del hemo, por protoporfirina de estaño (SnPP, la Figura 6) no afectó preferentemente las células cancerosas. En particular, estos tratamientos tienen los mismos efectos en las células de carcinoma de pulmón A549 (no se muestra). Estos resultados muestran que la amplia oferta de hemo es crucial para mantener el consumo de oxígeno en las células NSCLC a un ritmo mayor que en las células normales. Ellos sugieren fuertemente que la síntesis del grupo hemo mejorada y absorción son necesarios para el aumento del consumo de oxígeno en las células NSCLC
.
El epiteliales normales HBEC30KT pulmón (HBEC) y NSCLC HCC4017 (HCC) las células fueron cultivadas y tratadas en medio normal (Ninguno) , en medio con hemo empobrecido (HD), en medio con hemo agotado y succinil acetona (HD + SA), y en medio con CCCP. Las células se recogieron y las tasas de consumo de oxígeno se detectaron y se representan aquí. Los valores representados eran los promedios de al menos tres experimentos. Para el análisis estadístico, los niveles en las células del cáncer se compararon con los niveles en las células normales, mediante el uso de Welch-2 muestra de t-test. *, Valor de p & lt; 0,05; **, Valor de p. & Lt; 0,005
La inhibición de la síntesis y hemo mitocondrial función suprime fuertemente la proliferación de células NSCLC, la formación de colonias y Migración
Para evaluar el efecto de la inhibición de la síntesis del grupo hemo y la función mitocondrial en la proliferación y función de las células del cáncer, hemos examinado la tasa de crecimiento del cáncer de pulmón, la formación de colonias y la migración. La Figura 7A muestra que la inhibición de la síntesis de heme interrumpió el crecimiento de las células del cáncer de HCC4017 más severamente que las células HBEC30KT normales. Asimismo, el CCCP desacoplador mitocondrial interrumpida HCC4017 crecimiento celular más severamente que las células HBEC30KT (figura 7A). En contraste, la inhibición de la degradación del hemo por SnPP no afectó selectivamente HCC4017 la proliferación celular. Se observaron los mismos efectos cuando medimos HCC4017 la formación de colonias. Como se muestra en la Figura 7B, tanto acetona succinil y CCCP detuvieron completamente la formación de colonias de células de cáncer. La adición de hemo revertido en gran medida el efecto de la inhibición de la síntesis de heme. Como era de esperar, la inhibición de la degradación del hemo por estaño protoporfirina IX (SnPP) no afectó considerablemente la formación de colonias de células de cáncer. Además, se analizó el efecto de la inhibición de la biosíntesis del grupo hemo y la absorción sobre la migración celular HCC4017. la migración de células HCC4017 se inhibió sustancialmente en medio con hemo agotado y con succinil acetona (Figura 7C). La adición de hemo invierte la inhibición de la migración. También se intentó examinar el efecto de derribo de las enzimas biosintéticas hemo en las células de cáncer de pulmón mediante el uso de shRNAs que se utilizaron para derribar la biosíntesis del grupo hemo en células HeLa [33]. Sin embargo, no fuimos capaces de obtener clones que presentan niveles más bajos de la biosíntesis del grupo hemo, probablemente porque las células HCC4017 tienen una mayor demanda de mayores niveles de hemo, la reducción de la biosíntesis del grupo hemo disminuiría su supervivencia. Estos resultados muestran que la inhibición de la disponibilidad y la función heme disminuye significativamente la proliferación de células de cáncer, la formación de colonias, y la migración.
Las células tratadas con acetona succinil también se mantuvieron en medio hemo-agotado. (A) La reducción de la disponibilidad de hemo o función mitocondrial reduce preferentemente la proliferación de células de cáncer de NSCLC. células vivas% se calculó dividiendo el número de células tratadas con el número de células no tratadas (sembró con el mismo número de células). Muestra las tasas relativas de proliferación de las células tratadas (SA o SNPP) frente a las células no tratadas (Ninguno). (B) La reducción de la disponibilidad de hemo o función mitocondrial reduce preferentemente la formación de colonias de células NSCLC. (C) La reducción de la disponibilidad hemo reduce preferencialmente la migración de células de NSCLC.