Extracto
receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la familia de receptores nucleares de factores de transcripción. Tras la unión a andrógenos, AR se vuelve transcripcionalmente activo para regular la expresión de genes diana que albergan elementos de respuesta a andrógenos (ARE) en sus promotores y /o potenciadores. AR es esencial para el crecimiento y supervivencia de células de cáncer de próstata y por lo tanto es un objetivo para la corriente y de próxima generación modalidades terapéuticas contra el cáncer de próstata. las redes de interacción proteína-proteína Fisiopatológicamente relevantes que supongan AR son, sin embargo, poco conocidos. En este estudio, hemos identificado la proteína fusionada /translocado en liposarcoma (FUS /TLS) como una proteína que interactúa con AR por la co-inmunoprecipitación de proteínas endógenas en las células de cáncer de próstata humano LNCaP. La respuesta hormonal de la expresión de FUS en las células LNCaP se demostró para asemejarse a la de otros AR co-activadores. FUS muestra una fuerte capacidad intrínseca de transactivación en células de cáncer de próstata cuando atado a promotores basales utilizando el sistema de GAL4. experimentos de inmunoprecipitación de cromatina mostraron que FUS fue reclutado para ARE III de la región potenciadora de la
PSA
gen. Los datos de los enfoques "knock-down" sobreexpresión ectópica y demostraron que la actividad transcripcional de AR fue reforzada por FUS. El agotamiento de FUS reduce la proliferación andrógeno-dependientes de las células LNCaP. Por lo tanto, el FUS es una novela co-activador de AR en células de cáncer de próstata
Visto:. Haile S, Lal A, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS es un co-activador del receptor de andrógenos en Las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10.1371 /journal.pone.0024197
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2011; Aceptado: August 2, 2011; Publicado: 1 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Haile et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud de subvención RP-79308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción se requiere
receptor de andrógenos (AR) para la supervivencia y el crecimiento de células de cáncer de próstata. De acuerdo con ello, el cáncer de próstata avanzado puede ser tratada con terapias de ablación de andrógenos. Desafortunadamente, estos tratamientos fallan y, finalmente, la enfermedad se vuelve, el cáncer de próstata resistente a la castración letal (CRPC). El mecanismo más amplio apoyo subyacente CRPC implica AR. Se requiere que el dominio amino-terminal (NTD) de AR para tanto la actividad dependiente de ligando y el ligando-independiente del receptor (para una revisión ver [1]). Por lo tanto, los esfuerzos actuales para desarrollar fármacos más efectivos contra la CRPC se centran en el bloqueo más eficaz de la síntesis de andrógenos, antiandrógenos que se unen competitivamente la AR dominio de unión a ligando (LBD) con mucha mayor afinidad [2], y los inhibidores de la AR NTD [3 ]. Los continuos esfuerzos para desarrollar fármacos se beneficiarían de una mejor comprensión de las redes de interacción proteína-proteína que participa en la AR. Con este fin, se empleó un enfoque proteómico y nuevos compañeros de interacción AR endógenos identificados en las células del cáncer de próstata que incluyen miembros de un grupo de proteínas llamadas FET /TET. Esta familia de proteínas incluye: fusionados en sarcoma (FUS) /translocado en liposarcoma (TLS), proteína de Ewig sarcoma (EWS), y el factor de unión a TATA asociados a la proteína, TAF15
FET proteínas exhiben diversas funciones, entre ellas. la modulación de la transcripción, empalme, la propagación de células y la reparación del ADN. FET proteínas tienen dominios similares de activación transcripcional (ETA) en su motivo de defectos del tubo neural y el ARN reconocimiento (RRM) y repeticiones de la RGG tripéptido en su extremo carboxilo [4], [5]. El TAD de proteínas FET contiene motivo XYXXQ rica, siendo X un pequeño aminoácido (Gly, Ala, Ser o Pro) [6]. Este motivo también se comparte con el proto-oncogénica SYT, el humano del receptor nuclear coactivador SYT-proteína de interacción /co-activador Activador (SIP /COAA), y SWI /SNF /BAF250 [6]. FET defectos del tubo neural, incluyendo el TADS potentes, se fusionan a los dominios de unión a ADN (DBDs) de varios factores de transcripción en una subclase de sarcomas y otros tipos de cáncer [5], que conduce a la hiperactivación del correspondiente actividad transcripcional. Nuevas evidencias sugieren que las proteínas FET, nativa de longitud completa se unen y activan las funciones de los factores de transcripción específicos, en parte, mediante la contratación de co-factores tales como CBP /p300 [4] - [5].
AR y FUS se encuentran en el mismo complejo de proteínas
LNCaP [7] recapitula características importantes del cáncer de próstata, incluyendo la expresión tanto del antígeno prostático específico (PSA) y AR, así como la sensibilidad a andrógenos. Para nuestra pantalla inicial, se utilizó lisados nucleares de células LNCaP que fueron tratados con el andrógeno sintético R1881 (10 nM) durante 3 hrs. Los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-AR y las muestras se sometieron a multidimensional tecnología de identificación de proteínas (MudPIT) [8]. análisis de espectrometría de masas identificado FUS, que pertenece a la familia de FET de las proteínas que interactúan con AR (Figura 1 A, Figura S1, S2 Figura y la Tabla 1). Co-inmunoprecipitación (co-IP) experimentos seguidos de interacción validado análisis de transferencia Western entre AR y FUS (Figura 1B). AR co-inmunoprecipitó (co-IP) con FUS, mientras que la inmunoprecipitación con el control de isotipo IgG no tiró hacia abajo AR o FUS. Reverse co-IP con anti-AR seguido por análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-FUS también mostró que AR interactuó con FUS (Figura 1C). De acuerdo con informes anteriores, el tratamiento con R1881 niveles mejorados de proteína de AR.
In vivo
asociación de FUS con AR se confirmó usando extractos de xenoinjertos de LNCaP que se cultivaron en ratones antes o después de la castración (Figura 1D). Junto apoyan estos datos que asociado AR y FUS en el mismo complejo en células de cáncer de próstata.
Identificación
(A) de FUS como una proteína de AR-interactuando por co-immunopreciptation (Co-IP) seguido de espectrometría de masas ( SRA). Espectros MS /MS de m /z 1660,77 (de 831,39, 2 +) de FUS y otros dos que se muestran en material suplementario fueron asignados de forma inequívoca la secuencia identificada LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR, y TGQPMINLYTDR, respectivamente. (B) La validación de la interacción AR-FUS usando Co-IP seguida por Western blot. células LNCaP en cultivo se indujeron con 10 nM R1881 durante 6 horas y los lisados enteros se utilizaron para IP con el anticuerpo anti-FUS seguido por análisis de transferencia Western anti-AR (WB). (C) IP inversa con anti-AR seguido por WB con el anticuerpo anti-FUS. (D) IP de complejos endógenos de AR y FUS de xenoinjertos de LNCaP subcutáneos. Los tumores fueron cosechadas de los ratones intactos (I), 10 días después de la castración (C10) o 30 días después de la castración (C30). Los lisados de estos tumores se usaron individualmente para IP con el anticuerpo anti-AR seguido de WB con anticuerpos indicados.
Localización subcelular de FUS en las células cancerosas de la próstata
proteínas FET puede ser localizado de forma divergente en el núcleo y /o citoplasma [5], [9]. microscopía de inmunofluorescencia usando anticuerpos dirigidos contra proteínas endógenas se realizó en las células LNCaP. FUS se localizó exclusivamente en el núcleo (Figura 2A). FUS parecía estar localizada en motas distintas dentro del núcleo (Figura 2A, B). La heterogeneidad en la distribución de sub-nuclear de FUS entre la población de células se observó (Figura 2A, B). tinción dual mostró co-localización de AR con FUS (Figura 2B) en las células LNCaP que fueron tratadas con 10 nM R1881 durante 3 horas. el coeficiente de Pearson se acercó a 0,8 en algunas células dentro de las regiones específicas de los núcleos.
(A) Localización nuclear de FUS en las células LNCaP. Las células se trataron con R1881 (10 nM) durante 3 hrs. inmunofluorescencia confocal se realizó usando anticuerpo anti-FUS (verde) y las células se contratiñeron con DAPI (azul). (B) La colocalización de AR y FUS. tinción dual muestra co-localización de AR (rojo) con FUS (verde) en células LNCaP tratadas con 10 nM R1881 durante 3 horas. La inserción en el panel de la derecha representa la celda designada con (*) después de la compuerta umbral para eliminar el punto brillante verde central.
FUS tiene una actividad intrínseca de transactivación en células de cáncer de próstata
La TADs de proteínas FET pueden conferir robusto transactivación transcripcional en algunos tumores [4] - [5], pero esto no se ha explorado en las células de cáncer de próstata. Aquí, se empleó el ensayo de transactivación de GAL4 para explorar si la actividad de transactivación podría atribuirse a FUS en células de cáncer de próstata. construcciones quiméricas que albergan de longitud completa o fragmentos de FUS (el mismo) fusionados a la Gal4-DBD se utilizaron para este ensayo (Figura 3A). células de cáncer de próstata PC3, desprovistos de AR funcional, fueron co-transfectadas con cada una de las construcciones de fusión de Gal4, y un gen reportero que contiene los sitios de unión mínimas Gal4-(p5 × Gal4UAS-TATA-luciferasa). GAL4-DBD solo se utilizó como control negativo y tenía actividad mínima (Figura 3B). Por el contrario, Gal4-FUS actividad de la luciferasa inducida significativamente (Figura 3B) que era consistente con que tiene actividad de transactivación intrínseca. Para comenzar a delinear qué dominio (s) dan cuenta de esta capacidad intrínseca de transactivación, se emplearon dos construcciones. La primera constructo tenía el dominio de transactivación NTD (FUS-N) y la otra contenía el RRM carboxilo terminal y RGGs (FUS-C) (Figura 3A). Ambos fragmentos muestran las actividades que fueron comparables a larga duración FUS (Figura 3B). Para evaluar la dependencia del contexto promotor de estas actividades, se empleó un indicador diferente que contiene los sitios de unión de GAL4 mínimos y un elemento TATA, que se yuxtaponen en el promotor E1a. Similar, aunque generalmente más alta, no se observó capacidad de transactivación en el contexto de este promotor como en el promotor mínimo (Figura 3C). capacidad de transactivación fuerte de las fusiones GAL4-FUS también se demostró en células LNCaP (Figura 3D).
(A) constructos quiméricos de longitud completa FUS, N o C fragmentos de FUS fusionados a la Gal4 DBD . TAD = dominio de transactivación; motivo RRM = reconocimiento de ARN; RGG = repeticiones de un tripéptido que contiene arginina y dos glicinas. (B) la actividad de transactivación de FUS en las células de cáncer de próstata PC3. PC 3-células en placas de 6 pocillos fueron co-transfectadas con 50 a 100 ng de Gal4 quimera, y 1 ug del gen informador pFR-LUC, que contiene sitios de unión de GAL4 y un elemento TATA. GAL4 DBD solo sirvió como control negativo. 2 ug PGL2 plásmido vacío ha sido añadido a todas las mezclas de ADN. (C) como en (B), pero el plásmido informador contenían sitios y elemento TATA yuxtapuestos en promotor E1a Gal4 vinculante. (D) Como en (B), pero con LNCaP en lugar de las células PC-3. Columnas = media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, n = 3.
FUS promueve la actividad transcripcional de AR en células de cáncer de próstata
Después de haber demostrado una capacidad de transactivación del FUS que era independiente del promotor en células de cáncer de próstata como se describió anteriormente, el próximo evaluó la participación de FUS específicamente en la actividad transcripcional AR en genes diana. Se emplearon dos diferentes siRNAs dirigidos regiones independientes del ARNm cognado para agotar los niveles de FUS. AR actividad se midió en las células LNCaP cotransfectadas utilizando el PSA (6,1 kb) reportera -luciferase construcción génica. Este reportero contiene las regiones promotoras PSA y potenciador de albergar varias AREs que confieren la inducción por andrógenos [10] - [11] de una manera dependiente de AR [12] - [13]. En relación con el control, R1881 inducción de la actividad luciferasa se redujo significativamente en el agotamiento de FUS sin reducir los niveles de AR (Figura 4A). Para corroborar estos resultados con un enfoque sobre-expresión, co-transfectadas con el vector de expresión de AR, el plásmido informador ARR3-tk-LUC, y diversas cantidades de un plásmido que permite la expresión de FUS marcada con His en células HEK293. El reportero ARR3-tk-Luc contiene seis áreas, y es altamente inducible por andrógenos. La sobreexpresión de FUS aumentó AR actividad transcripcional medida como actividad de luciferasa de ARR3-tk-LUC de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B, paneles superior e intermedias). Su-FUS no alteró significativamente la actividad transcripcional en la PRL-TK-LUC, que contiene únicamente la timidina quinasa (tk) del promotor basal (Figura 4B, panel inferior).
(A) El agotamiento de los correlatos FUS con una disminución de la actividad de AR. Los niveles de FUS se redujeron en células LNCaP utilizando siRNAs dirigidos a dos regiones diferentes de los respectivos ARNm y posteriormente se transfectaron con 1 ug de plásmido para PSA (6.1) -luciferase. 2 ug p-LUC plásmido vacío ha sido añadido a todas las mezclas de siRNA /ADN. Las cantidades son por pocillo en una placa de 6 pocillos. Las células fueron tratadas con 10 nM R1881 durante 24 horas. Western blot de las muestras correspondientes muestran niveles de FUS, AR, y la actina. (B) La expresión ectópica de FUS aumenta la actividad de AR. 293FT células en una placa de 48 pocillos se transfectaron con 15 ng del plásmido de expresión de AR, 620 ng de plásmido reportero ARR3-tk-luciferasa, 62 ng de plásmido de luciferasa de Renilla y se indican cantidades de plásmido de expresión de Su-FUS. Las actividades de luciferasa se normalizaron con los de la luciferasa de Renilla que contiene el promotor mínimo de conocimientos tradicionales. Los valores por encima de cada barra representan negro plegable inducción por R1881 después de la normalización (panel superior). Western blot de las muestras correspondientes muestran niveles de FUS, AR, y la actina (panel central). UT: las células no transfectadas. la actividad de luciferasa de Renilla de las mismas muestras se normalizaron a la proteína total sirvió como control de especificidad (panel inferior). Columnas = media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, n = 3.
Para determinar si FUS aumenta la expresión de genes endógenos, los niveles de proteína y ARNm de los genes regulada por andrógenos conocidos se midieron al lado.
PSA
mRNA y mRNA de otros cinco genes andrógeno-inducible se redujeron significativamente en el agotamiento de FUS (Figura 5A).
TMPRSS2
ARNm se redujo en sólo uno de los siRNAs, y el gen andrógeno-reprimido,
CAMK2N1
no se vio afectada por cualquiera de los siRNAs (datos no mostrados). Consistente con niveles reducidos de mRNA, los niveles de proteína PSA se redujeron significativamente en células LNCaP en el agotamiento de FUS (Figura 5B). Para determinar si FUS fue reclutado para ADN con la AR en respuesta a los andrógenos, se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayo. La inmunoprecipitación de proteínas de ADN reticulados utilizando un anticuerpo para FUS seguido de la amplificación del ARE III de la
PSA
gen FUS reveló que fue reclutado para este SON (Figura 5C). En conjunto, estos datos sugieren que FUS aumenta la actividad de AR, al menos en algunos genes diana, de acuerdo con la función de transactivación fuerte intrínseca atribuida a FUS (Fig. 3).
niveles (A) de ARNm de genes de andrógenos regulado. siRNA mediada por el agotamiento de FUS disminuye ARNm cognado para PSA y varios otros genes diana AR. QRT-PCR se utilizó para medir los niveles de mRNA. Los valores representan las relaciones de las señales de GAPDH normalizado a las derivadas de las células LNCaP transfectadas de manera simulada. Las células fueron tratadas durante 24 horas siguientes siRNA transfección. (B) los niveles de proteína PSA. células LNCaP fueron tratados durante 8 horas con 10 nM de R1881 o vehículo siguientes siRNA transfección y Western Blot se realizó para medir los niveles de PSA. (C) FUS es reclutado a la potenciadoras III de la
PSA
gen. células LNCaP se trataron con 10 nM R1881 durante 6 horas. Chip fue posteriormente aplicado y el ADN diana se amplificó por qPCR. Los valores representan la proporción de las señales de ChIP anti-FUS a la de control de isotipo IgG. Columnas = media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, n = 3.
El agotamiento de FUS reduce la proliferación de células LNCaP
AR es esencial para el crecimiento de células LNCaP [14]. Para evaluar si la disminución de la actividad de AR en el agotamiento de FUS daría lugar a disminución de la proliferación, se realizó el análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo. Como era de esperar, R1881 (0,1 nM) aumentó la población de células en fase S (datos no mostrados) que se redujo en ~ 30% en el agotamiento de FUS (Figura 6A). Digno de mención, los datos se obtiene a partir de la transfección transitoria de siARN resultante en el agotamiento relativamente ineficiente de FUS (Figura 6B). Estos datos implican una función pro-crecimiento de FUS sobre la proliferación dependiente de andrógenos, que es coherente con el aumento de la actividad transcripcional de AR.
(A) de flujo de la cuantificación por citometría de células en fase S. células LNCaP siRNA transfectadas se trataron con 0,1 nM R1881 durante 48 horas. Las células se marcaron con BrdU, se tiñeron con anticuerpo anti-BrdU conjugado con FITC y DAPI, y se sometieron a citometría de flujo. El gráfico de la derecha representa la cuantificación de células en fase S como una proporción de los respectivos controles. * P & lt; 0,05, n = 3. (B) Niveles de proteína FUS en las células tratadas con FUS siRNA. Western blot de los niveles de FUS y control de carga actina correspondientes a las muestras cuyo ciclo celular perfil se representa en (A).
Hormona-respuesta de la expresión de FUS
La expresión de algunos AR co-activadores de los receptores de esteroides, tales como co-activadores (SRC) es modulada por los andrógenos y /o AR [15] - [17] como parte de lo que parece ser una red de mecanismos de alimentación hacia adelante y de realimentación. expresión FUS, en el mRNA (Figura 7A, panel superior) y los niveles de proteína (Figura 7A, panel central), fue reprimida
in vitro
en células LNCaP después del tratamiento de 48 horas con 10 nM R1881. El tratamiento de células LNCaP con 0,1 nM R1881 para el período de tiempo equivalente (48 horas), sin embargo, tuvo efectos insignificantes sobre la expresión de la expresión de FUS (Figura 7A, panel inferior). Se empleó inmunohistoquímica para evaluar la expresión del gen FUS en xenoinjertos de LNCaP. Las muestras tumorales se prepararon a partir de ratones (no castrados) y castrados intactos (10 días después de la castración). Consistente con los
in vitro
datos en con 10 nM R1881, la castración resultó en el aumento de expresión de FUS (Figura 7B).
(a) los niveles de ARNm de FUS en respuesta al tratamiento de andrógenos. Panel superior: la expresión FUS se midió mediante qRT-PCR en las células LNCaP tratadas con 10 nM R1881 para los puntos de tiempo indicados. El panel medio: análisis de transferencia Western de los niveles de FUS, PSA y proteínas actina en los puntos de tiempo indicados. Panel inferior: análisis de transferencia Western de niveles de proteína FUS en las células LNCaP que fueron tratadas con 10 nM frente a 0,1 nM durante 48 hrs. Las barras de error = media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, n = 3. niveles (B) FUS en respuesta a la condición hormonal
in vivo
. xenoinjertos LNCaP recogidas de ratones (no castrados) y castrados intactas (10 días después de la castración) fueron teñidas con proteínas FUS y AR. niveles (C) FUS en el cáncer de próstata clínico en comparación con el tejido benigno correspondiente. Los niveles de ARNm FUS en muestras clínicas de carcinoma de próstata en comparación con el tejido prostático normal fueron re-analizados a partir de conjuntos de datos previamente obtenidos utilizando Oncomine. Las barras negras indican los estudios en los FUS se sobreexpresa en el cáncer de manera significativa en comparación con el tejido benigno. * P & lt;. 0,05
FUS expresión tiende a ser mayor en el carcinoma de próstata en comparación con el tejido benigno
Para determinar si la expresión de FUS se ve alterado en el cáncer de relación con el tejido benigno de la próstata, Oncomine análisis de la base de datos se realizó mediante siete cohortes clínicas diferentes. La expresión de FUS se elevó en el carcinoma de próstata en comparación con los tejidos benignos utilizando datos de tres estudios (Figura 7C). Sin embargo, en cuatro estudios adicionales de tamaño comparable, no hubo diferencia significativa entre los niveles de mRNA FUS en el carcinoma de próstata en comparación con los niveles en tejido prostático benigno.
Discusión
AR es esencial para todas las fases de la progresión del cáncer de próstata incluyendo la etapa terminal de CRPC. Por debajo de esta función de AR es una interacción dinámica con varios co-activadores y co-represores. El alcance de la interacción proteína-proteína patofisiológicamente relevante que incluya AR en células de cáncer de próstata es, sin embargo, no se conoce completamente. Aquí, se muestra por primera vez que el FUS interactuó con AR de forma endógena en células de cáncer de próstata y además reveló lo siguiente: (1) FUS tenía la capacidad de transactivación intrínseca en células de cáncer de próstata; (2) FUS mejorado la transcripción mediada por AR; (3) el agotamiento de FUS redujo los niveles de expresión de genes inducidos por andrógenos; (4) FUS fue reclutado para ARE en respuesta a los andrógenos; (5) reducción de los niveles de FUS proliferación inducida por andrógenos limitada; (6) niveles de FUS fueron alterados por el estado de andrógenos
in vitro
y
in vivo
; y (7) niveles de FUS fueron elevados en muestras clínicas de cáncer de próstata.
Los dominios de unión al ADN (DBD), los receptores de esteroides muestran alta homología de secuencia (por ejemplo, AR DBD tiene el 77% y el 57% de similitud de secuencia con los de receptor de glucocorticoides y receptores de estrógeno, respectivamente), y puede interactuar con muchos de los mismos coactivators. El uso de proteínas recombinantes, FUS se ha demostrado que interactúan con los DBDs de retinoide X, el estrógeno, la tiroides, y los receptores de glucocorticoides, pero no fue examinado AR [18]. La unión del FUS de DBD de otros receptores hormonales no interferir con las actividades de unión al ADN, aunque el papel de FUS en sus actividades de la transcripción no fue evaluado [18].
A continuación, se demuestra que el FUS alberga fuertes dominios de transactivación que eran funcionales en células de cáncer de próstata. La región C-terminal que contiene los motivos RRM y RGG de EWS puede suprimir la capacidad de transactivación de la NTD en derivadas de riñón de conejo RK-13 células [19]. En contraste, se observó aquí ninguna función de supresión de la región C-terminal al comparar de longitud completa FUS al 1-273 fragmento FUS que carece de la RRM C-terminal y motivos RGG. Por otra parte, el FUS 274-526 que contiene los motivos RRM y RGG, pero no la TAD, muestra una fuerte capacidad de transactivación. estructura-función de los datos de relaciones similares con FUS se había informado anteriormente utilizando las embrionarias de riñón 293 células humanas [20]. Por lo tanto, hay dominios de transactivación funcionales en FUS distintos de los que se encuentran en su NTD al menos en el cáncer de próstata y de células 293. Las discrepancias en la literatura entre FUS y EWS dominios de transactivación puede ser específico de células o reflejar la divergencia de dominio (45% de identidad; 64% de similitud) [5] entre EWS (a 699 aa largo de proteína) y FUS (a 526 aa largo de proteína).
expresión de diversos co-reguladores de AR es sensible a los andrógenos tal vez como parte de los mecanismos de retroalimentación [15] - [17]. La expresión de FUS es sensible al estado de la hormona en células de cáncer de próstata. En los niveles fisiológicos de los andrógenos, se informó de la expresión de FUS a reducirse significativamente en células LNCaP tratadas por 48-96 horas con 10 nM mibolerona [21] como también se muestra aquí con 10 nM R1881 (Fig. 7A). Sin embargo, una menor concentración de andrógenos, 0,1 nM R1881, no alteró significativamente los niveles de FUS
in vitro
, y
in vivo
niveles de castración de andrógenos se asociaron con mayores niveles de FUS. Este perfil de expresión similar a la de AR co-activadores previamente caracterizadas que son modestamente reprimidos por los andrógenos [15] - [16]. Curiosamente, la represión de estos co-activadores por los andrógenos es con una cinética más lenta parecida a la de la expresión de andrógenos sensible de FUS. Análisis de los niveles de mRNA FUS en varias líneas celulares de cáncer de próstata y no próstata no reveló diferencias sistemáticas (Fig S3). Consistente con esto, Oncomine minería de datos de microarrays de muestras clínicas de diversos tipos de tumores sólidos no mostró significativa hacia arriba o hacia abajo los niveles de FUS-regulación en los tumores de próstata en relación con otros tipos de tumores (Fig S4). Por el contrario, la comparación de los datos de ARNm de benigna frente a tejidos adenocarcinoma de próstata reveló hasta la regulación de FUS en tres estudios independientes y ninguna diferencia significativa en otros cuatro. Ningún estudio mostró una disminución significativa de la expresión de FUS en el adenocarcinoma de próstata en comparación con tejido benigno.
AR se requiere la actividad transcripcional para el mantenimiento y crecimiento de la próstata que forma el fundamento para las terapias de ablación de andrógenos para el cáncer de próstata. Consistente con FUS ser un coactivador de AR y su agotamiento reducir AR actividad transcripcional y el crecimiento dependiente de andrógenos como se muestra aquí, entre los fenotipos prominentes en FUS - /- ratones es la esterilidad masculina, y los órganos reproductores masculinos más pequeños con aparente involución de algunos de estos estructuras [22]. Estos fenotipos son una reminiscencia de AR - /- ratones, o más refinada dominio- y tipo de células específicas
AR
genes interrupciones [23] - [24]. Por lo tanto, es posible que el agotamiento de FUS disminuye AR actividad transcripcional en estos tejidos clásicos dependientes de andrógenos de acuerdo con los datos presentados aquí. Estos datos están en contraste con un informe anterior que FUS sobreexpresión en células LNCaP, utilizando un sistema inducible por tetraciclina y posterior tratamiento con 10 nM mibolerona durante cuatro días, conduce a la aparición de sub-G1 /células apoptóticas [21]. Curiosamente, no se detectaron células apoptóticas sub-G1 /en ausencia de andrógenos, con o sin FUS sobreexpresión [21]. Por lo tanto, en esos estudios FUS sobreexpresión dio lugar a un efecto y cambios pro-apoptótica andrógeno-inducible de la expresión de proteínas del ciclo celular [21].
En general, aunque se necesitan más estudios para establecer el papel de FUS en la próstata progresión de la enfermedad del cáncer, este estudio reveló que: 1) FUS interactúa con AR; y 2) FUS aumenta la actividad transcripcional de AR.
Materiales y Métodos
Los plásmidos, cultivo celular y transfecciones
plásmidos de expresión de FUS [20], p5 × Gal4UAS-TATA -luciferase [12], y el vector de expresión AR, ARO, [25] se han descrito anteriormente. PFR-LUC se obtuvo de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.. AR plásmido reportero, PSA (6,1 kb) -luciferase contiene las regiones de promotor /potenciador del gen PSA y fue proporcionado por el Dr. J.-T. Hsieh (Universidad de Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-tk-LUC contiene tres copias de la región de respuesta a andrógenos de la rata
probasina
gen fusionado a la timidina quinasa basal (TK), el promotor [26].
células LNCaP, obtenido de Dr. Leland WK Chung (Instituto Samuel Oschin Comprehensive Cancer, CA, EE.UU.), se cultivaron en RPMI que contenía 5% de suero bovino fetal (FBS) y se utilizaron en el paso 39 a 50. células HEK293 se mantuvieron en DMEM que contiene 10% de FBS. A menos que se indique lo contrario, las células fueron incubadas en medios de comunicación libres, libres de suero de rojo fenol durante 24-48 horas antes del tratamiento con las concentraciones indicadas de R1881. La transfección de células LNCaP se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para los experimentos con siRNAs o lipofectamina (Invitrogen) para todos los otros como por las instrucciones del fabricante en 0,2-0,4% y 0,5% (v /v), respectivamente. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7; HSC.RNAI.N001170634.11.8) y el control de siRNAs (Invitrogen) se utilizaron a concentraciones de 10-50 nm. células HEK293 se transfectaron usando Lipofectamine 2000 en 0,4% v /v. Las cantidades exactas de los plásmidos por transfección se indican en la Figura leyendas.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total se preparó usando el kit RNeasy mini (Invitrogen). El ARN total (0,5 g) fue inverso-transcrito a través de oligo-dT cebado usando el kit Superscript III (Invitrogen). PCR se realizó usando cebadores específicos del gen en presencia de SYBR Green Supermix (Invitrogen) usando el tiempo real de la máquina PCR ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El protocolo de termociclado fue el siguiente: a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 30 seg. los valores Ct (ciclo umbral número) se convirtieron en el sentido de la expresión de los valores con relación a
GAPDH
niveles de acuerdo con el método Pfaffl. cebadores FUS [5] y se han descrito previamente todos los otros cebadores [27] - [28]
inmunofluorescencia
Las células se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 1% en PBS durante 30 min. . Las células se permeabilizaron en 0,1% Triton X-100 en PBS dos veces por 5 min. Después de bloquear durante 30 minutos en 2% de BSA en PBS que contenía 0,1% Trition X-100, las muestras se incubaron con los anticuerpos indicados (1:50) en tampón de bloqueo durante 1 hr. Las células se lavaron con tampón de bloqueo 4 veces y se incubaron con IgG FITC o rodamina conjugado secundario apropiado (1:100) en tampón de bloqueo durante 45 min. Después de 4 lavados con PBS que contiene 0,1%, se añadió solución de montaje que contiene DAPI-Trition X-100. Los portaobjetos se visualizaron mediante el uso de Fluoview microscopio confocal (Olympus, Markham, ON, Canadá).
Co-inmunoprecipitación de la cromatina y el ensayo de inmunoprecipitación
células LNCaP (2-3 × 10
6) se sembraron en 15 platos cm con RPMI que contiene FBS al 5%. Después de 24 horas, se cambió el medio en suero y fenol RPMI libre de rojo y se incubaron las células durante 24 horas adicionales. Las células se trataron posteriormente con R1881 (10 nM) o su vehículo (etanol) durante 6 horas. Las células fueron lavadas con PBS antes de la cosecha y luego se lisaron con 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 7,8, NaCl 140 mM, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,5% Nonidet P-40) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, Mississauga, ON, Canadá). Los lisados se pasaron a través de 27-G agujas cinco veces y fueron posteriormente pre-limpiado con /G perlas de agarosa con proteína A (5% v /v) y una mezcla de ratón y conejo IgG (2 mg /ml cada uno) durante 1 hora. El sobrenadante resultante se incubó con los anticuerpos específicos indicados incluyendo AR 441, AR C19, y FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU.) a una concentración de 1-2 mg /ml durante 16-24 horas. /G cuentas de agarosa Proteína A (5% v /v) se añadieron posteriormente y la mezcla se incubó durante 3 horas adicionales. Las perlas se lavaron con 1 ml de tampón de lisis cinco veces y luego se volvieron a suspender en 40 a 80 l de tampón de muestra SDS estándar.
ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina se realizó tal como se describe [27]. Brevemente, las células se trataron con R1881 (10 nM) o vehículo durante 6 horas y posteriormente se fijaron con formaldehído para reticular la cromatina. Después de la sonicación para cizallar la cromatina /ADN, los lisados se prepararon y se inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados. ADN diana se midió por PCR en tiempo real usando el tiempo real de la máquina PCR ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los valores se normalizaron en contra de señales del correspondiente control de IgG.
Western blot
Las muestras se cargaron en un 10% a base de glicina Tris /geles de poliacrilamida-SDS analiza. Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) de acuerdo con protocolos estándar utilizando Tris /tampón de transferencia a base de glicina en el sistema submarino de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá). Las transferencias se sondearon con los anticuerpos siguientes: AR PG21 (1:1000) (Upstate Biotechnology, Waltham, MA, EE.UU.); AR 441 (1:500), o FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz de Biotecnología Inc).
Ensayo de proliferación
células LNCaP (5 × 10
5) en 10