Extracto
Antecedentes
FoxM1 ha informado a ser importante en la iniciación y progresión de diversos tumores. Sin embargo, si FoxM1 tiene ninguna indicación para el pronóstico en pacientes con cáncer no microcítico de pulmón de células no queda claro.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, la expresión FoxM1 en las células tumorales se examinó por primera vez por inmunohistoquímica en 175 muestras de NSCLC, cuyo resultado mostró que FoxM1 sobreexpresión se asoció significativamente con el consumo de tabaco positiva (P = 0,001), la diferenciación de tejidos más pobre (P = 0,0052), etapa superior TNM (P & lt; 0,0001), metástasis a los ganglios linfáticos (P & lt; 0,0001), estadio tumoral avanzado (P & lt; 0,0001), y un peor pronóstico (P & lt; 0,0001). El análisis multivariante mostró que la expresión FoxM1 aumenta el riesgo de muerte (razón de riesgo, 1.899; IC del 95%, 1,016-3,551). Por otra parte, por varios
in vitro y Hoteles en
in vivo
experimentos, se demostró que desmontables dirigida de la expresión FoxM1 podría inhibir las capacidades migratorias e invasivas de las células NSCLC, mientras que la expresión forzada de FoxM1 podría aumentado la invasión y la migración de células de NSCLC. Por último, encontramos que uno de los mecanismos celulares por los cuales FoxM1 promueve la metástasis del tumor es a través de la inducción de programa de transición epitelio-mesenquimal (EMT).
Conclusiones
Estos resultados sugieren que la sobreexpresión FoxM1 en los tejidos tumorales se asocia significativamente con el mal pronóstico de los pacientes con CPNM mediante la promoción de la metástasis tumoral
Visto:. Xu N, Jia D, W Chen, Wang H, Liu F, Ge H, et al. (2013) FoxM1 se asocia con mal pronóstico de células no pequeñas cáncer de pulmón Los pacientes mediante la promoción de la metástasis tumoral. PLoS ONE 8 (3): e59412. doi: 10.1371 /journal.pone.0059412
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Agosto, 2012; Aceptado: 14 Febrero 2013; Publicado: 25 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los principales proyecto disciplina académica Shanghai, número de proyecto B115 y el proyecto nacional de china "985" (fase III). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo durante varios años. El mal pronóstico del cáncer de pulmón debido principalmente a pequeños síntomas en una etapa temprana y cuando se diagnostica, las células tumorales siempre han hecho metástasis a otros órganos [1]. Transición epitelio-mesenquimal (EMT) es importante en la metástasis de las células tumorales y que se caracteriza por la disolución de las uniones intercelulares a través de la internalización y la baja regulación de diversas proteínas presentes en las uniones estrechas, como zonula occludens (ZO) -1, y uniones adherentes, tales como e-cadherina [2], [3].
caja forkhead M1 (FoxM1), un miembro de la familia Fox de factores de transcripción, ha demostrado ser esencial para la progresión del ciclo celular y es un importante regulador del ciclo celular que controla la transición de G1 a la fase S, así como la entrada y la finalización de la mitosis [4],. Se ha informado de que se sobre-expresan en una variedad de tumores, incluyendo cánceres de pulmón, de hígado y de mama [8], [9], [10], [11], [12], [13], y ha desempeñado un importante papel en el desarrollo y la progresión de diversos tumores malignos [11], [14], [15], [16]. Recientemente, se informó de FoxM1 para conducir la fibrosis hepática y la metástasis en HCC [17], y ha sido bien documentado que la vía de hedgehog de señalización se activó en el NSCLC, y varias moléculas implicadas en esta vía, incluyendo PTCH1, SMO, GLI1, se observó que se correlaciona con múltiples parámetros de pronóstico del NSCLC. En particular, se observaron también estas moléculas que se correlaciona con el aumento de la expresión de FoxM1 [18]. Sin embargo, si FoxM1 podría ejercer un efecto directo sobre el pronóstico de los pacientes con NSCLC que queda por esclarecer. Yang y sus colegas informaron recientemente que la sobreexpresión FoxM1 correlacionada con la baja supervivencia de los pacientes mediante inmunohistoquímica análisis de 69 casos de carcinoma de células escamosas muestras [19]. Sin embargo, el papel pronóstico de la expresión FoxM1 en otros tipos de NSCLC no se ha determinado. Liu et al. encontró que el estado de la expresión de FoxM1 en el CPNM es un factor pronóstico independiente y se correlaciona negativamente con el pronóstico., pero su estudio no encontró ninguna relación entre la expresión FoxM1 y otros parámetros clínicos críticos [20]. Mientras tanto, todos los estudios anteriormente no demostraron los mecanismos subyacentes potenciales. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que FoxM1 promovido
in vitro
capacidad metastásica del cáncer de pulmón de células pequeñas [21]. En el estudio actual, nuestro objetivo es determinar el valor pronóstico de la sobreexpresión FoxM1 en NSCLC y además explorar el mecanismo por el cual FoxM1 podría contribuir a la metástasis del NSCLC.
Resultados
Características y necesidades de los pacientes entre FoxM1 Expresión y características clínico
las características clínico-patológicas de los pacientes se resumen en la Tabla S1. Las duraciones totales de seguimiento varió de 1 a 84 meses (mediana, 42 meses). Para investigar si el aumento de la expresión de FoxM1 se asoció con diversos factores pronósticos, los pacientes se clasificaron en dos grupos en función de la tinción inmunohistoquímica para FoxM1 (Figura 1A, a-d): expresión negativa /débil y fuerte expresión. Como se muestra en la Tabla S2, aquellos pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos (Figura 1A, e) tenían una expresión significativamente mayor de FoxM1 comparación con los pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos (Figura 1A, f) (P & lt; 0,0001). Mientras tanto, la expresión FoxM1 más fuerte se correlacionó con la condición de fumador positiva (P = 0,001), más pobre diferenciación (P = 0,0209), estadio tumoral avanzado (P & lt; 0,0001) y estadios TNM más altos (P & lt; 0,0001), mientras que no se observó ninguna diferencia sustancial en de los pacientes de edad, sexo y la histología en el momento de diagnóstico entre los niveles alto y bajo de FoxM1
(a) los resultados representativos de tinción FoxM1 en los tejidos tumorales de NSCLC analizadas por inmunohistoquímica (a, negativo;. b, débil; c, moderada; d, intensa, respectivamente). Los resultados representativos de FoxM1 niveles de expresión entre los ganglios linfáticos positivos (e) y negativo de los ganglios linfáticos (f) (a-f, izquierda, de aumento: x 100; a la derecha, de aumento: x 400). análisis (B) La supervivencia global para todos los pacientes (a), los pacientes con estadio I /II (b) y los pacientes con fase III /IV (c) de acuerdo con los resultados del análisis de inmunohistoquímica. Se utilizó la prueba de log-rank para probar las dos distribuciones de supervivencia. P & lt; 0,05 se considera que tienen significación estadística
Expresión FoxM1 positivamente correlacionado con la progresión tumoral y supervivencia de los pobres de células no pequeñas
En primer lugar, se utilizó el análisis de supervivencia global del cáncer de pulmón pacientes. para examinar la correlación entre la expresión FoxM1 y pronóstico. El pronóstico de los pacientes con un tumor expresión fuerte de FoxM1 fue significativamente inferior a la de los pacientes con una expresión FoxM1 tumoral negativo o débil (P & lt; 0,0001) (Figure1B, a). En otros análisis, expresión FoxM1 se asoció con una peor supervivencia para los pacientes con estadio I /cáncer II (P = 0,049) (Figura 1B, b) y para los pacientes con estadio III /IV de cáncer (p = 0,095) (Figura 1B, c) , aunque el resultado de la etapa III /IV no alcanzó la significación. Un análisis univariado mostró que el estadio del tumor (P & lt; 0,0001), los ganglios linfáticos (P & lt; 0,0001), el estadio TNM (P & lt; 0,0001) y la expresión FoxM1 (P & lt; 0,0001), cada predijeron un pronóstico significativamente peor en pacientes con CPNM (Tabla 1 ). El pronóstico clínico fue, sin embargo, no se asoció con la edad, el sexo, el tabaquismo, la histología y la diferenciación.
Además, se aplicó un modelo de riesgos proporcionales de Cox para estimar el efecto de la expresión FoxM1 en la supervivencia. La razón de riesgo en bruto (HR) de FoxM1 fuerte expresión en comparación con FoxM1 expresión negativa o débil era 1,899 (IC del 95%, 1,016-3,551; p & lt; 0,05), lo que indica que un fuerte estado de FoxM1 aumenta el riesgo de cáncer de pulmón muerte relacionada en casi dos veces mayor que la del estado negativo o débil FoxM1. Con el análisis multivariable, la expresión FoxM1, metástasis de ganglios linfáticos y la edad se asociaron significativamente con la supervivencia (Tabla 2). Estos hallazgos sugieren que FoxM1 parece ser un predictor independiente y significativa de la supervivencia más pobre.
Precipitación selectiva de FoxM1 inhibe la expresión
in vitro
metastásicas potenciales de células de NSCLC
los resultados anteriores revelaron que la alta expresión FoxM1 se asocia con un mal pronóstico de los pacientes con CPNM, pero los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que FoxM1 podría mediar la proliferación de líneas celulares de SCLC, que pueden estar asociados con el estadio del tumor avanzado [21]. Pero los papeles de expresión FoxM1 en la migración celular y la invasión NSCLC son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, para saber si FoxM1 media pronóstico en el cáncer de pulmón a través de la promoción de la metástasis, se aplicó la transducción-lentivirus para reducir la expresión FoxM1 sobre la capacidad migratoria e invasiva de las células H1299 y PC-9 (Figura 2 A y B). Los resultados sugieren que la interrupción de la expresión FoxM1 podría inhibir significativamente las capacidades migratorias y invasivos de células de NSCLC por ensayo de migración de trans-pozo (Figura 2C y D). Por otra parte, también se encontró que en diferentes dos líneas celulares, desmontables de expresión FoxM1 podría inhibir significativamente la tasa de proliferación a las 48 y 72 horas (Figura S1A), y la sobreexpresión de FoxM1 promovió la proliferación del tumor después de 72 horas en ratones desnudos (Figura S1B), todos los cuales fueron consistentes con nuestros resultados anteriores.
(a, B) La detección de caída lentivirus mediada por FoxM1 en células PC-9 y H1299 por WB y Q-PCR, respectivamente. (C, D) Un resultado representativo de los ensayos de migración trans-así para los efectos de FoxM1 en el
in vitro
capacidades migratorias e invasivas de PC-9 y las células H1299. Los resultados se muestran como la media ± SD, *
p
. & Lt; 0,05
expresión forzada de FoxM1 aumentado el
in vitro
y
In Habilidades vivo
metastásica de las células de NSCLC
Para demostrar aún más el papel en el CPNM metástasis, que sobreexpresa de forma estable expresión FoxM1 en líneas celulares H292 (Figura 3 a y B) y PC-9. En primer lugar, mediante el uso de ensayos de Trans-así, hemos demostrado que la sobreexpresión de FoxM1 podría aumentar significativamente los potenciales migratorias e invasivas de las células NSCLC (Figura 3C y D). Para confirmar aún más el papel de FoxM1 en la metástasis del cáncer de pulmón de células no pequeñas, hemos desarrollado un modelo de ratón mediante inyección en vena de cola de PC-9 FoxM1 sobreexpresan (PC-9-FoxM1) y el control de las células (PC-9-Vector) . Cinco semanas después de la inoculación de células, los ratones se sacrificaron para obtener los pulmones (Figura 4A), y controlados por imágenes de fluorescencia, los resultados de los cuales mostraron que las células PC-9-FOXM1 muestran señales de fluorescencia mucho más fuerte en los pulmones que la de las células control ( Figura 4B). Además, el estudio histológico mostró que el número de nódulos metastásicos en los pulmones de grupo sobreexpresión FoxM1 fue significativamente mayor que los del grupo de control (Figura 4C y D). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que FoxM1 juega un papel importante en la metástasis de tumores de NSCLC.
(A, B) La detección de la sobreexpresión lentivirus mediada por FoxM1 en células PC-9 y H292 y por WB q-PCR, respectivamente. (C, D) Un resultado representativo de los ensayos de migración trans-así para los efectos de FoxM1 en el
in vitro
capacidades migratorias e invasivas de PC-9 y H292. Los resultados se muestran como la media ± SD, *
p
. & Lt; 0,05
(A, B) Inspección visual y análisis de imágenes de fluorescencia de pulmón nódulos metastásicos en dos grupos ( PC-9-Vector y PC-9-FoxM1) de modelos de ratones por inyección en la vena caudal de las células tumorales, respectivamente. (C) Los efectos de
FoxM1
en el
in vivo
capacidades metastásicas de células PC-9 en modelos de xenoinjertos de ratones desnudos (n = 6) tal como se determina mediante el examen de los pulmones del ratón para microscópica nódulos. Los resultados representativos de examen histológico de los pulmones del ratón para nódulos metastásicos (izquierda). El número de noudels metástasis pulmonares en los dos grupos de modelos de ratón (derecha). Los resultados se muestran como la media ± SD, *
p
. & Lt; 0,05
FoxM1 inducida por la transición epitelio-mesenquimal de las células NSCLC y muestras de tejido tumoral
Hemos observado además células con alta expresión de FoxM1, que se encontró que tenían cambios fenotípicos que recuerdan de la EMT. Como se muestra en la Figura 5A, se observaron claras diferencias morfológicas entre la línea celular H292-FoxM1 y su línea celular H292-vector paterno en cultivo celular. Considerando H292 células son poligonales y crecen en racimos, las células H292-FOXM1 son alargados y en forma de huso, y crecen en un patrón de dispersión de confluencia. Para explorar más a fondo los mecanismos asociados con el aumento del potencial de metástasis, hemos probado algunos factores esenciales asociados a la EMT, que promueve la metástasis en carcinomas. Se encontró que las células H292-FoxM1 expresan bajos niveles de ARNm y proteínas de E-cadherina y ZO-1, mientras que los niveles más altos obtenidos ARNm y proteínas de los marcadores mesenquimales, como la vimentina y N-cadherina (Figura 5B y C). Slug es un represor de la transcripción, que es potente inductor de EMT. Hemos observado una mayor expresión de Slug en las células FoxM1-sobreexpresión (Figura 5D). Nuestras observaciones sugieren que FoxM1 induce metástasis a través de EMT
(A) Imágenes de contraste de fase representativos de la H292-vectores y células H292-FoxM1. (Ampliación: 200 ×). (B) análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión relativa de los marcadores de EMT como se indica. GAPDH se utilizó como control de carga. Los datos se expresan como media ± S.D., *
p
. & Lt; 0,05. (C) la expresión relativa de los marcadores de EMT como se indica, se determinó por inmunotransferencia (izquierda), y los resultados de los cuales era más cuantificada (derecha). β-actina sirvió como control de carga. (D) La expresión relativa de Slug como se indica fue determinada por inmunotransferencia (izquierda), y los resultados de los cuales fue cuantificado aún más (a la derecha). β-actina sirvió como control de carga.
Para demostrar aún más la relación entre FoxM1 de expresión y de EMT marcadores, la tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo para la E-cadherina, vimentina y Slug en muestras de tumores. En las muestras de cáncer de pulmón humano, el aumento de la vimentina y expresión babosa y la disminución de la expresión de E-cadherina se encontraron en los grupos con alta expresión de FoxM1, mientras que la disminución de la vimentina y la expresión de Slug y el aumento de la expresión de E-cadherina en los grupos con baja expresión FoxM1 (Figura 6A) . Además, hemos establecido modelos de tumores sólidos subcutáneos. Después de 4 semanas de la inyección de células PC-9-vector PC-9-FoxM1 y, se recogieron los tumores sólidos, incrustado en paraffarin y se tiñeron para los marcadores de EMT. Como se muestra en la Figura 6B, en comparación con tumores derivados de células PC-9-vector, los tumores derivados de células PC-9-FOXM1 reveladas aumento de la expresión de vimentina y Slug y disminución de la expresión de E-cadherina (Figura 6B). Nuestras observaciones en los cambios morfológicos y moleculares sugieren que la sobreexpresión FoxM1 induce un fenotipo similar a la EMT a través de la regulación de Slug en las células NSCLC
.
(A) La expresión relativa de E-cadherina, vimentina y como se indica Slug se determinado por tinción inmunohistoquímica en muestras de tumores humanos con un alto (arriba) y (abajo) expresión FoxM1 baja. (B) La expresión relativa de E-cadherina, vimentina y Slug como se indica, se determinó por tinción inmunohistoquímica en tumores ratones desnudos derivados de células PC-9-vector (arriba) y las células PC-9-FOXM1 (abajo).
Discusión
en este estudio, se evaluaron los niveles de expresión de FoxM1 utilizando tinción IHC en una cohorte de 175 pacientes con CPNM china y por la primera vez demostraron que la expresión elevada de FoxM1 se correlacionó con varios clinicopatológica factores y predijo un pronóstico desfavorable en pacientes con CPNM, incluyendo SCC y AC. Por otra parte, se encontró que la desregulación de la expresión FoxM1 se asoció significativamente con mayores capacidades metastásicas a través de la inducción de la EMT.
Teniendo en cuenta el papel de FoxM1 en el crecimiento de células tumorales, algunos estudios han evaluado la posibilidad de expresión FoxM1 como biomarcador para predecir el resultado clínico de los pacientes con CPNM. Yang et al encontró que FoxM1 relacionado con factores clínicos y desempeña un papel fundamental en el pronóstico en 69 pacientes con SCC, sin incluir AC. y Liu et al demuestran que FoxM1 podría ser un factor independiente de pronóstico en 68 pacientes con CPNM, incluyendo 37 CA y 19 SCC, pero la relación entre la expresión FoxM1 y otros clinicoparameters se probó sin relación. Estos resultados paradójicos pueden debido a sus diferentes población de estudio, el tamaño pequeño de la muestra y variada calidad de los datos clínicos. En nuestro estudio, hemos encontrado que la expresión de FoxM1 muestra tumoral se asoció positivamente con varios parámetros clínico, tales como el estadio TNM, el estadio tumoral y la metástasis de los ganglios linfáticos. Por otra parte, una mayor expresión FoxM1 se correlaciona con un mal pronóstico de los pacientes con CPNM. Estos resultados indicaron que FoxM1 estaba relacionado con la progresión del NSCLC y pronóstico. Sin embargo, los mecanismos que subyace necesita ser explorado más.
La metástasis implica una serie de pasos complejos [22], incluyendo la disminución de la adherencia, aumento de la motilidad, la unión celular, disolución de la matriz, y la migración [23]. Durante la progresión tumoral, las células cancerosas sufren cambios dramáticos en la organización del citoesqueleto de adoptar fenotipo invasivo y, finalmente, metástasis a otros órganos. EMT es un proceso clave en la metástasis del tumor [24], [25], [26], lo que asociado con la expresión reducida de la superficie celular de E-cadherina, el aumento de N-cadherina [27], [28] y la expresión alterada de varios cito -skeletal proteínas, que juegan un papel significativo hacia la actividad migratoria de las células tumorales [29].
Nuestros datos revelaron que la inhibición de FoxM1 pudo reprimir la capacidad metastásica, mientras que hasta reguladas nivel de expresión de FoxM1 en el cáncer de pulmón las células mejoran las propiedades migratorias e invasivas in vitro e in vivo. Los niveles de E-cadherina, ZO-1 estaban elevados y vimentina, N-cadherina se redujeron con mayor expresión FoxM1. También, FoxM1 regula la expresión de Slug, que es el inductor de EMT. Estos resultados sugieren que FoxM1 se asoció con el pronóstico mediante la promoción de la metástasis de las células tumorales a través de la inducción de EMT. Hyun JP et al. también demostró que en HCC, FoxM1 podría activar la vía de la Akt-Snail1 e involucrar en transición EMT [17]. Por otra parte, hay algunos otros estudios indicaron que MMPs han surgido como factores centrales tanto en el crecimiento local y metástasis a distancia en tumores [30], [31], y FoxM1 también podría regular MMPs promover OSCLC metástasis. Tomados en conjunto, FoxM1 puede desempeñar varias funciones importantes en las células tumorales. Su papel en la vía completa en relación con metástasis valores de las partes examen más detenido.
En resumen, nuestros resultados sugieren que FoxM1 regulación puede tener efecto sobre el pronóstico y la progresión NSCLC. Hemos demostrado que la sobreexpresión FoxM1 se relaciona con disminución de la supervivencia global y la rápida progresión del tumor en pacientes con CPNM. Por otra parte, la sobreexpresión de FoxM1 podría aumentar las capacidades migratorias e invasivas de las células NSCLC. Estos resultados sugieren que la expresión FoxM1 es crítica para la invasividad de las células de NSCLC malignos, y este efecto fue al menos, en parte a través de la transición mechenmychal epithelial-. Por lo tanto, nuestra observación hace FoxM1 un objetivo atractivo de la terapia del cáncer de pulmón, y podría ser utilizado como un biomarcador para predecir el pronóstico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
a los humanos involucrados en esta investigación, dado su consentimiento informado por escrito de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Ética Médica y el Comité de ensayo humano clínico en el Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan ha aprobado este estudio, así como el procedimiento de consentimiento (Permiso Número: 2011-221). Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Fudan Comité de Cuidado de Animales, Shanghai, China (Número de Permiso: SYXK: 2008 hasta 0039). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Pacientes y muestras tumorales
Un total de 232 pacientes con CPNM histológicamente confirmados fueron reclutados consecutivamente entre enero de 2005 y febrero de 2008 para el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas cáncer (NSCLC) en el hospital de Zhongshan, la Universidad de Fudan. Cuatro pacientes fueron excluidos si previamente recibieron radioterapia y /o quimioterapia. La radiografía de tórax y la tomografía computarizada se llevaron a cabo para todos los pacientes antes de la operación. Hay 142 pacientes fueron sometidos a resección quirúrgica curativa. La quimioterapia con un régimen basado en cisplatino se aplicó para la mayoría de los pacientes en etapa alta (incluyendo IIIB y IV) o con alto riesgo de recidiva y metástasis de acuerdo con la pauta de tratamiento para el NSCLC en el momento quirúrgico. Para este estudio, 53 pacientes fueron excluidos del análisis, incluyendo 38 pacientes con mala calidad y /o cantidad de muestras de tejido, 11 pacientes con datos clínicos incompletos y 4 pacientes murieron de otras causas originalmente fueron excluidos de nuestro análisis. Por último, se incluyeron un total de 175 pacientes en este estudio (Tabla S1). Se incluyeron un total de 122 hombres y 53 mujeres, incluyendo 97 fumadores y 78 no fumadores, con edades comprendidas entre 30 y 77 años, de los cuales 89 eran menores de 55 años de edad. Había 76 en estadio I, 23 en estadio II, 51 en estadio III y IV etapa 25 enfermedades, incluyendo 91 pacientes sin metástasis ganglionar y 84patients con metástasis en los ganglios linfáticos. Hubo 36 pacientes con tumor de la etapa 1, 75 en estadio 2, 25 con las etapas 3 y 39 con la etapa 4 y 118 pacientes con adenocarcinoma (AC), mientras que el 57 con carcinoma de células escamosas (SCC). En términos de diferenciación, hubo 93 pacientes con diferenciación bien y moderadamente y 82 con la diferenciación mal. Un total de 74 pacientes estaban vivos al final del seguimiento, 101 pacientes murieron de cáncer de pulmón, y los pacientes murieron de otras causas o perdidos durante el seguimiento fueron excluidos del estudio.
Información para Clinicopathological cada paciente, incluyendo el género, la edad, el tabaquismo, el estadio del tumor, estado ganglionar, estadio TNM, el grado histológico y la supervivencia global, se obtuvo de forma retrospectiva de las historias clínicas y los informes patológicos. El tiempo de supervivencia se define como la duración de la fecha de diagnóstico de la fecha de la muerte o el final del seguimiento. El estado TNM se determinó de acuerdo con el sistema de estadificación edición 7ª para el NSCLC [32].
Immunohischemistry Ensayo
Un anticuerpo contra FoxM1 (Sigma Aldrich Inc., MO, EE.UU.) y un estándar de inmunohistoquímica técnica se utiliza para la detección de la expresión FoxM1 como se describe anteriormente [19], [20]. FoxM1 se observó en citoplasmática o nuclear y citoplásmico de las células. La tinción se evaluó en cinco campos de alta potencia a 200 × magnificación. La puntuación de tinción se clasifican en cuatro grupos como negativo = 0, 1 = débil, moderado = 2 e intenso = 3 [20]. El porcentaje de área teñida positiva se clasifican en cuatro grupos: menos de 25% de células tumorales positivas = 0; 25% a 50% de células tumorales positivas = 1; 50% a 75% de células tumorales positivas = 2; más de 75% de células tumorales positivas = 3. El marcador etiquetado se determinó multiplicando puntuación de intensidad por el porcentaje de área manchada positivo, que anota como 0, 1, 2, 3, 4, 6 y 9. La tinción puntuación se clasifican en dos grupos como débil tinción /negativo (score & lt; 4) y una fuerte tinción (puntuación ≥4). Este umbral se determina determinando visualmente una mancha clara y positiva con el apoyo de los histogramas de la gama de resultados [20], [33], [34]. Se ha introducido una puntuación más alta etiquetado entre las tres secciones de tejido para los análisis estadísticos. Los patólogos que realizaron la evaluación inmunohistoquímica de FoxM1 fueron cegados a los pacientes 'histopatológico y los datos de seguimiento.
epidemiológica y los datos clínicos Colección
Pacientes parámetros y el tabaquismo historia demográfica se obtuvieron a través de -person entrevista en el momento de la visita inicial, el seguimiento en las clínicas o revisión de la historia médica. Un individuo que fumaban más de 100 cigarrillos en la historia se definió como un fumador nunca, de lo contrario como no fumador [35]. La información de seguimiento sobre la muerte y la supervivencia del paciente se actualiza en intervalos de 3 meses a través de la entrevista en el sitio, llamada directa, o revisión de la historia médica. La última consulta de seguimiento en este estudio se llevó a cabo en mayo de 2012.
Líneas celular, cultivo celular y reactivos quimioterapéuticos
El pulmón línea celular de adenocarcinoma humano línea celular de cáncer de PC-9 y de pulmón humano NCI-H292, NCI-H1299 se obtuvieron todos del Instituto celular de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) [36]. Estas células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5% en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone Inc., UT, EE.UU.), 100 U de penicilina /ml, y 100 g /ml de estreptomicina. Las células fueron certificados regularmente como libre de contaminación por micoplasma.
Los experimentos shRNA
El-lentivirus shRNA vector se construyó como se describe anteriormente [37]. Brevemente, FoxM1 y control negativo shRNA se subclonaron en los sitios MluI /ClaI de un vector pLVTHM (Addgene) con los oligonucleótidos siguientes respectivamente: 5'-CGCGTCGGCCGGAACATGACCATC AATTCAAGAGATTGATGGTCATGTTCCGGCTTTTTTCCAT-3 'y 5'-CGATGGAAAAAAGCCGGAACATGACCATCAATCTCTTGAATTGATGGTCATGTTCCGGCCGA-3'for FoxM1, y 5' -CGCGTCGGT AGCGACTAAACACATCAATTCAAGAGATTGATGTGTTTAGTCGCTACTTTTTTCCAT-3 'y 5'-CGATGGAAAAAAGTAGCGACTAAAC-3'for ACATCAATCTCTTGAATTGATGTGTTTAGTCGCTACCGA el control negativo. generación Lenti-virus y la infección de las células H1299 y PC-9 se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Transducción de las células tumorales
plásmido de expresión (EX-Z5438-LV135) y Lenti-Pac ™ HIV Kit de envasado se adquirieron de gene Copoeia Inc. (Gen Copoeia Inc., Guangzhou, china) Transductions de H292 y se realizaron PC-9 células de acuerdo con las instrucciones suministradas por los fabricantes. Los transfectantes estables se confirmaron adicionalmente por RT-PCR e inmunotransferencia sobre la base de su expresión FoxM1.
migración de células tumorales y la invasión ensayos
Ensayos para medir la migración de células tumorales se llevaron a cabo en una cámara de Boyden modificada (Transwell, Corning Costar, MA, EE.UU.) que contiene un filtro de membrana de policarbonato recubierto con gelatina (tamaño de poro 8 micras). Bio-Coat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.), que reconstituye la membrana basal, se utilizó para evaluar la invasión de células. El grado de migración de células tumorales y la invasión se evaluó de acuerdo a los protocolos anteriores [38]. Las células no migradas fueron retirados de la parte superior de la membrana mediante lavado. El recuento de células se realizó por tinción con azul de Coomassie y las células se visualizaron con un microscopio (Leica Inc., Solms, Alemania) posteriormente.
Experimentos con Animales
de cuatro a cinco semanas de edad BALB macho /CA ratones desnudos (adquirida de Shanghai Instituto de Medicina de materiales, Academia de Ciencias de china, Shanghai, china) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). El método utilizado es el mismo que el descrito anteriormente para la generación de modelo de cáncer de mama [39]. las células PC-9-FoxM1 (2 × 10
6 por ratón) que expresan establemente FoxM1 o vector se inyectaron en la vena de la cola de ratones desnudos (n = 6). Cinco semanas más tarde, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los pulmones. Después de eso, estos pulmones se procesaron para examen histológico y monitoreados para potenciales metástasis de tumor de pulmón por imágenes de fluorescencia [40]. Las lesiones metastásicas fueron identificados por las señales de fluorescencia (Night Owl LB 981
En Vivo
Imaging System, Berthold, Alemania) y analizados por el software WinLight32. Para el análisis histológico, los pulmones se recogieron en la necropsia y se fijaron en formalina al 10%. Las muestras fijadas fueron entonces embebidos en parafina, y se obtuvieron tres secciones en serie no secuenciales por animal. Las secciones fueron teñidas con H & amp; E y analizó la presencia de metástasis
Análisis estadístico
Se evaluaron varios factores clínico-patológicos.. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la correlación entre las variables clinicopatológicas y la expresión de FoxM1. Las variables clinicopatológicas y la expresión de FoxM1 se tuvieron en cuenta para el análisis de la supervivencia sobre la base del método de Kaplan-Meier; El análisis multivariado se realizó con el modelo de Cox de riesgos proporcionales de regresión para examinar el efecto pronóstico independiente de FoxM1 sobre la supervivencia mediante el ajuste de los factores de confusión. Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado como significativo en todos los análisis. SPSS 17,0 se utilizó para hacer los análisis estadísticos en este documento.
Apoyo a la Información
Figura S1.
efectos de la expresión alterada FoxM1 en la tasa de proliferación
in vitro
y
in vivo
. (A) la tasa de proliferación de FoxM1 de SPC-A-1 sh-FoxM1 (izquierda) y H1299-sh FoxM1 células (derecha). expresión FoxM1 fue derribado por la infección de virus lenti en SPC-A-1 y células H1299 primera forma estable. las tasas de proliferación de las células en los grupos transfectados con shRNA contra FoxM1 (sh-FoxM1) (línea roja) se redujeron significativamente, en comparación con el control shRNA orientación negativa (sh-NC) (línea azul). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. (B) la tasa de proliferación de los tumores derivados de PC-9-FoxM1cells in vivo. PC-9-vector y las células PC-9-FOXM1 se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. El diámetro del tumor se midió en los puntos de tiempo indicados. tasa de proliferación de los tumores derivados de células PC-9-FoxM1 (línea azul) aumentó de manera significativa, en comparación con la de las células PC-9-vector (línea roja). Los datos se expresan como media ± DE
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059412.s001 gratis (JPG)
Tabla S1. .
Características de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas
doi: 10.1371 /journal.pone.0059412.s002 gratis (DOCX)
Tabla S2.
perfil clínico y la correlación entre las características clínico-patológicos y la expresión de FoxM1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0059412.s003 gratis (DOCX)
Reconocimientos
gracias al Dr. Qun Wang (Departamento de thoracology, Zhongshan hospital) por ayudarnos con el seguimiento de los pacientes y el Dr. Deming Él (Departamento de patología, hospital Zhongshan) para ayudar con la recolección de las muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas.