Extracto
La berberina se ha identificado con efectos anti-proliferativos en varias células cancerosas. Muchos investigadores han estado tratando de dilucidar los mecanismos anticancerígenos de berberina sobre la base de los genes expresados diferencialmente. Sin embargo, los genes diferencialmente empalme alternativos inducidos por la berberina también podrían contribuir a sus acciones farmacológicas y no se ha informado todavía. Por otra parte, el potencial funcional cruzada hablar entre los dos conjuntos de genes merece una mayor exploración. En este estudio, la tecnología de RNA-seq se utilizó para detectar los genes expresados diferencialmente y genes empalmados diferencialmente alternativos en las células de cáncer BEL-7402 inducidos por la berberina. enriquecimiento de análisis funcional indica que estos genes se enriquecieron principalmente en la vía de señalización de p53 y el ciclo celular. Además, se demostró estadísticamente que los dos conjuntos de genes fueron localmente co-enriquecido a lo largo de los cromosomas, estrechamente conectadas entre sí sobre la base de la interacción proteína-proteína y funcionalmente similares en el árbol de ontología de genes. Estos resultados sugirieron que los dos conjuntos de genes regulados por la berberina pueden ser funcionalmente transversal hablado y contribuir conjuntamente a su efecto detención de ciclo celular. Se ha proporcionado nuevas pistas para futuras investigaciones sobre los mecanismos farmacológicos de la berberina, así como los otros fármacos botánicos
Visto:. Sheng Z, Sun Y, Zhu R, N Jiao, Tang K, Cao Z, et al . (2015) Funcional Cruz-Hablando entre los genes expresados diferencialmente y empalmados alternativamente en células de cáncer de hígado humano tratado con berberina. PLoS ONE 10 (11): e0143742. doi: 10.1371 /journal.pone.0143742
Editor: Emanuele Buratti, Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología, ITALIA
Recibido: 14 de mayo de 2015; Aceptado: 9 de noviembre de 2015; Publicado: 25 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Sheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de Investigación y Desarrollo de Tecnología Avanzada Nacional (Programa "863") de China (2012AA020405), y la financiación del Ministerio de Salud (2012ZX10005001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : DASG, genes diferencialmente empalmadas alternativa entre dos muestras; DEG, diferencialmente genes entre dos muestras
Introducción
Splicing alternativo expresada es un proceso estrechamente regulado durante la expresión de genes que pueden producir diferentes formas de una proteína a partir del mismo gen. Por otra parte, se ha demostrado que el empalme alternativo también puede determinar las propiedades de unión, la localización intracelular, la actividad enzimática, estabilidad de la proteína y modificaciones posteriores a la traducción de un gran número de proteínas [1]. En los últimos años, cada vez más los investigadores farmacológicos han encontrado que los fármacos moleculares pequeños podrían ejercer sus efectos farmacológicos no sólo a través de la regulación de los niveles de transcripción de genes, sino también mediante el cambio de gen splicing alternativo [2].
berberina, un cuaternario isoquinolina alcaloide aislado de especies de Berberis [3], tiene un amplio espectro de efectos farmacológicos, tales como anti-microbio, anti-diabetes y anti-inflamación [4]. Clínicamente, se ha utilizado para tratar una variedad de trastornos, incluyendo la enfermedad de las arterias coronarias, diabetes, enfermedad del hígado graso no alcohólico, la hiperlipidemia, el síndrome metabólico, la obesidad y el síndrome de ovario poliquístico (https://www.clinicaltrials.gov/). Recientemente, los estudios de acumulación han encontrado que la berberina también poseía actividad anticancerígena potente, con pocos o mínimos efectos tóxicos no deseados [5, 6]. Por lo tanto, muchos investigadores han estado tratando de dilucidar los mecanismos anticancerígenos de la berberina en base a la expresión diferencial de genes. Por ejemplo, se informa de que la berberina podría inducir la apoptosis en las células HepG2 por vía mitocondrial AMPK mediada por el aumento de la relación de Bax /Bcl-2 [7]. En nuestro estudio anterior, también hemos encontrado que la berberina podría inducir la detención del ciclo celular G1 en las células BEL-7402 parcialmente a través de perturbar la interacción de calmodulina con CaMKII y el bloqueo posterior degradación de la proteína p27. [8]
A pesar de que estos trabajos han proporcionado algunos conocimientos fundamentales sobre el mecanismo contra el cáncer de berberina, splicing alternativo en las células cancerosas después de tratados con berberina no se ha informado todavía. En primer lugar, se ha implicado que muchos medicamentos contra el cáncer podrían inhibir el crecimiento de células de cáncer mediante la alteración de genes splicing alternativo [9-11]. Además, se informa de que la transcripción de genes y empalme alternativa podría ser física y funcionalmente acoplados [12, 13], con lo que contribuyen conjuntamente a las acciones farmacológicas de estos medicamentos. Por lo tanto, es necesario medir simultáneamente los genes expresados diferencialmente (DEGs) y los genes diferencialmente empalmados alternativamente (DASGs) en las células del cáncer después del tratamiento con berberina y examinar sistemáticamente si existe algún tipo de funcionalidad cruzada hablar entre estos dos conjuntos de genes .
En la pregunta se ha mencionado anteriormente, la última secuencia tecnología de próxima generación (ARN-ss) se utilizó para obtener el perfil transcriptónicos de células BEL-7402 después del tratamiento berberina. A continuación, los DEGs y DASGs inducidos por la berberina se detectaron cuidadosamente por un conjunto de herramientas de análisis de secuencias. Por último, la interferencia funcional entre estas DEGs y DASGs se analizó estadísticamente y se discutieron sus posibles contribuciones al efecto anticancerígeno de berberina.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
La línea celular de cáncer de hígado humano establecido (BEL-7402, Cat. No .: TCHu_10) [8, 14, 15] fue comprado a y depositado en el banco de células del Instituto de Bioquímica y Biología celular, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, chino Academia de Ciencias (http://www.cellbank.org.cn/) y proporcionado amablemente por el Dr. Liu Xuan (Shanghai Instituto de Materia Médica, Academia de Ciencias de china, Shanghai, República Popular china). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada 37 ° C que contiene 5% de CO
2 y se cultivaron en medio RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM /L-glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, y estreptomicina 50 mg /mL. En este estudio, hemos agrupado 3 ~ 5 repeticiones biológicos en un experimento RNA-seq para lograr la misma cantidad de contenido total de ARN. Más específicamente, en la sección de cultivo de células, las células de cáncer en 8 ~ 10 placas de Petri diferentes se dividieron en dos grupos iguales. Uno de los grupos fue utilizado como grupo tratado berberina, el otro se utilizó como grupo de control /sin tratar.
aislamiento de ARN
Para la extracción de ARN total, las células se sembraron en placas de 10 cm (Corning, Acton, MA, EE.UU.) en medio completo durante 12 h. Entonces, ([8] pureza ≥ 98%, Tauto Biotech, Shanghai, China, IC50 según la Ref.) Se añadió 50 berberina M y se deja en contacto durante 24 h. Después de eso, se enjuagaron las células en PBS y se lisaron en el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). ADN genómico contaminante residual se elimina de la fracción de ARN total usando el kit Turbo ADN libre (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Se aisló el ARNm a partir de ARN total libre de ADN utilizando el kit de purificación de ARNm Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Por último, para obtener suficiente cantidad de contenido de ARNm para la secuenciación, las muestras de ARN total de cada grupo se agruparon juntos como una muestra colectiva.
Se realizó
secuenciación del transcriptoma
Selección de ARNm, la preparación de la biblioteca y secuenciación por Shanghai Ceneter para Bioinformación Tecnología (SCBIT) en una plataforma de secuenciación de Illumina 2000 HiSeq de acuerdo a las especificaciones del fabricante. En resumen, el ARNm fue seleccionada usando sondas de oligo (dT) y luego fragmentado utilizando cationes divalentes. Los ADNc se sintetizaron usando cebadores aleatorios, modificado y enriquecido para la unión a la célula de flujo Illumina. Hemos secuenciado dos de 60 ciclos de 100 pb × 2 carriles de gama sincronizado, generando ~ 83,1 millones lee.
Leer alineación
secuenciación de bajo nivel Lee se recorta a cabo Ns y regiones de baja calidad (calidad de base promedio marcar en un 5-mer deslizable ventana de menos de 20, es decir, la tasa de error de secuenciación ≤1%). Leer-parejas con al menos 36 pb que queda en cada lectura se mantiene tan limpia lee. calidad de secuenciación se evaluó mediante FastQC [16]. Entonces, limpio lecturas fueron asignadas al genoma de referencia humana (Ensembl GRCh37.66 = hg19) usando alineador Tophat [17] (versión 2.0.6) con los parámetros (r /-cámaras compañero distancia: 70, -g /-max -multihits: 1, -no-cobertura-búsqueda, -no-novela-junc, los otros como por defecto). Las salidas de Tophat se utilizaron como los insumos para HTSeq [18] y AltAnalyze [19] para llevar a cabo la expresión diferencial de genes o el análisis de splicing alternativo, respectivamente.
La expresión génica diferencial análisis
DEGs (expresados diferencialmente genes) se refieren a los genes con cambios significativos en su nivel de expresión. En primer lugar, el número de lecturas asignada a la región genómica de cada gen para cada muestra se estimó con HTSeq [18]. Entonces DESeq [20] se utilizó para evaluar la diferencia en la expresión de genes entre diferentes muestras. Por último, DEGs se filtraron por las siguientes normas:. 1) el valor absoluto de log2 [pliegue de cambio] fue mayor que 1. 2) El valor de p fue inferior a 0,05
diferencialmente gen análisis de splicing alternativo
DASGs (genes diferencialmente empalmadas Alternativa) se refieren a los genes con no o pequeñas variaciones en su nivel de expresión de todo el gen, pero los cambios significativos en su uso de exón, en especial los exones alternativos (Fig 1). El análisis diferencial de empalme se describen las diferencias en el uso del sitio de splicing alternativo entre dos muestras, que es fundamental para los estudios que implican mecanismos de splicing alternativo y su regulación, y capaz de descubrir la diversidad funcional que se perdió por el análisis de la expresión diferencial de genes [21]. Decenas de herramientas y paquetes de software disponibles, como Cuffdiff2 [22], MISO [23], DEXseq [24], DEGseq [25], DiffSplice [26], que empalma la brújula [27], AltAnalyze [19], etc., se llevó conceptualmente diferentes enfoques que podrían identificar corte y empalme diferencial en el nivel de la isoforma /transcripción, el exón, o ambos. Sin embargo, la elección de un enfoque adecuado para un estudio depende del resultado objetivo y esperado experimental. Entre estos enfoques y paquetes, solamente AltAnalyze proporciona una interfaz gráfica de usuario, mientras que el resto se ejecutan en la línea de commend. Además, AltAnalyze proporciona un flujo de trabajo conveniente para extraer los eventos significativos de regulación splicing alternativo y posteriormente investigar las posibles consecuencias biológicas de estos eventos de empalme y los mecanismos correspondientes en el contexto de las interacciones moleculares y sitios de unión [19]. Múltiples algoritmos están disponibles en AltAnalyze para identificar las características individuales (exones) o uniones o cruces recíprocos que son regulados diferencialmente en relación con los cambios de expresión génica. En este trabajo, se realizó el análisis de las características individuales (Índice de empalmes, SI) inmediatamente después de los análisis de unión recíprocos (Análisis de empalme de la isoforma reciprocidad, ASPIRE) [28] en la misma lista de características expresadas, lo que nos permite examinar los exones alternativos previstos por pares de uniones recíprocas, además de los predichos por una sola regulados exones /uniones (ver AltAnalyze-Manual). índice de empalme es una medición de corte y empalme diferencial entre dos muestras. Los exones con valor SI mayor que 1 significa más inclusión del exón en el ARNm madurado durante el proceso de corte y empalme en la muestra tratada en comparación con la muestra de control, mientras que aquellos con valor SI inferior a 1 significa menos inclusión pero más la omisión del exón, y aquellos con valor SI igual a 1 significa que no hay cambio en el uso del exón.
a. La expresión o corte y empalme alternativo del gen DPM1 se mantuvo sin cambios después del tratamiento berberina. B. El patrón de empalme del gen NFKBIA se mantuvo sin cambios después del tratamiento berberina como se indica por el valor del índice de empalme (SI) de cada uno de sus exones. Sin embargo, la expresión del gen NFKBIA se upregulated por más que 2 veces después del tratamiento berberina (p & lt; 0,05) desde cada uno de sus exones se sobreexpresa. C. El patrón de empalme del gen Rlim fue alterada por el tratamiento berberina como se indica por el valor SI del exón 2 (SI & lt; 0,5) dentro de gen Rlim. Pero la expresión de genes Rlim no cambió significativamente después del tratamiento berberina. Expresión relativa, el nivel de expresión relativa del gen o todos sus exones en comparación con la muestra control.
*, DEG;
#, DSAG.
Análisis de corte y empalme alternativo diferencialmente se realizó utilizando AltAnalyze con parámetros por defecto. En primer lugar, había tres criterios de los exones de genes diferencialmente para llevar a cabo el análisis de splicing alternativo: 1) Al menos 5 lee fueron asignadas al exón; 2) la RPKM (lecturas por Kilo-base del modelo de exón por millón asignada lee) el valor del exón era mayor que 0,3; 3) el cambio de expresión del gen correspondiente fue de menos de 2 veces. Entonces, dos algoritmos exón centrada se utilizaron para detectar los exones de corte y empalme alternativos diferencialmente: Índice de empalme (SI) y el Análisis de empalme por Isoforma reciprocidad (ASPIRE) [28]. El valor de la IS para cada exón o unión se calculó de la siguiente manera. Gratis (1)
En el que,
RPKM gratis (
exón
i
) y
RPKM gratis (
gen) fueron el valor de la expresión del exón i-ésimo y el gen respectivamente. En algoritmo de SI, los exones con SI & gt; 2 veces fueron llamados AS-exons_SI. En algoritmo ASPIRES, exones con Delta I & gt; 0,2 fueron llamados AS-exons_ASPIRE. Los detalles de estos dos algoritmos se han descrito en el flujo de trabajo AltAnalyze (http://www.altanalyze.org/). Sólo se superponían AS-exones en ambos algoritmos se eligieron para su posterior análisis funcional. Y los genes que contienen estos exones se llaman genes diferencialmente empalmadas alternativas (DASG).
conjunto de genes funcionales de enriquecimiento de análisis
Gene conjunto de enriquecimiento de análisis se llevaron a cabo para la anotación funcional de los DEGs y DASGs por separado. Funcionales Herramientas de anotación en David Recursos Bioinformática [29] se utilizaron para llevar a cabo estos análisis. Aquellos ontología de genes (GO) [30] términos de procesos biológicos o de Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) [31] vías con un enriquecimiento p-valor inferior a 0,05 (modificado la prueba exacta de Fisher) y se examinaron más de dos genes, enriquecido significativamente funciones para su posterior análisis.
análisis de co-enriquecimiento local a lo largo de secuencias del cromosoma
para probar si los DEGs y DASGs mostraron la distribución de enriquecimiento similares a lo largo de los cromosomas, se realizó un análisis de co-enriquecimiento local. En primer lugar, una puntuación de enriquecimiento (
ES
) se calculó para un conjunto de genes en cada banda cromosómica, que también se muestra como la intensidad de esa región como se muestra en la Figura 2A [32]. determinado conjunto de genes
X
:
{x
1 |,
x
2
,
... x
N
}
, la banda cromosómica
B Opiniones:
{b
1
,
b
2
,
b ...
M
}
, el número de genes en cada banda
g
:
{g
1 |,
g
2
,
g ...
M
}
, a continuación,
ES
puntuación se calculó de la siguiente manera. gratis (2)
A. parcela intensidad global de la posición de enriquecimiento de DEGs y DASGs. Cada celda representa una banda cromosómica y la intensidad de su color es proporcional a la enriquecimiento correspondiente de DEGs o DASGs en esta banda, que se normalizó por tanto la cantidad total de genes en la banda y el número de cualquiera de DEGs o DASGs. Cada columna representa el cromosoma que contiene todas las bandas y el color, ya sea azul o rojo, por delante de la columna distinguir la clase de genes de DEGs y DASGs. B. La trama violín para la puntuación posicional co-enriquecimiento (distancia) entre dos conjuntos de genes. La curva que cubre la región amarilla representa la distribución distancia de dos conjuntos de genes al azar en el mismo tamaño de DEGs y DASGs respectivamente. Una distancia más corta significa una mayor co-enriquecimiento de estos dos conjuntos de genes. La punta de diamante rojo se refiere a la distancia entre DEGs y DASGs
A continuación, un
ES
Resultado de vectores
EX
:.
{ex
1 |,
ex
2
,
... ex
M
}
se tiene para el grupo de genes
X
en todas las bandas en
B Opiniones. Del mismo modo, otro vector
EY
:
{ey
1 |,
ey
2
,
... ey
M
}
se podía obtener por otro conjunto de genes
Y
. Por último, la similitud (
LCE
) entre las dos bandas de color de
X
y
Y
se midió como la distancia euclidiana entre ellos. Gratis (3)
cercanía global en la interacción proteína-proteína (PPI) de la red
Para evaluar la proximidad topológica entre DEGs y DASGs en la red PPI, se utilizó la media longitud del camino más corto entre ellos como la medida. longitud del camino más corto media es un concepto en la topología de red que se define como el número medio de pasos a lo largo de los caminos más cortos para todos los posibles pares de nodos de red, que es una medida de la eficiencia del transporte de información en la red [33]. Esta medida también es aplicable en temas de dos subredes mediante el cálculo de la distancia del camino promedio para todos los posibles pares de nodos de estas dos redes, x e y. (4) En caso de dis (i, j) es la distancia de la trayectoria más corta entre el
i-ésimo
gen del subconjunto X y el gen j del subconjunto y. En este análisis, el fondo de la red fue construida usando el conjunto de datos de PPI de la base de datos en línea de la proteína humana base de datos de referencia (HPRD).
similitud semántica funcional en la ontología de genes (GO)
árbol
En el árbol de ontología de genes, los genes se clasifican en diferentes grupos funcionales nombrados como GO términos en base a los procesos biológicos en los que están involucrados. Basándose en la estructura gráfica de GO, similitud semántica entre dos términos de GO se calculó como se describe en Wang et.al [34] utilizando GOSemSim paquete [35]. Entonces la similitud semántica entre dos conjuntos de genes tales como DEGs y DASGs podría calcularse como el promedio de todos los posibles pares de GO términos que implican genes en estos dos conjuntos de genes. Dados dos listas de términos GO,
ir
1 | y
ir
2
que implican genes en dos conjuntos de genes,
X
y
y
, la similitud semántica
SemSim
se definió como: (5) Donde
N
Ir
es la cantidad total de los términos de GO utiliza para el cálculo de la similitud semántica.
resultados
Resumen de los resultados de RNA-seq para las células BEL-7402 tratados con berberina
todo el perfil transcriptónicos de las células BEL-7402 tratadas con o sin la berberina se evaluó a una resolución de pares de bases a través de la secuenciación del ARN. Después de baja calidad lee (como se menciona en Leer la sección de alineación, Materiales y Métodos), se ha limpiado, aproximadamente 30 millones de lecturas de ~ 41,5 millones de bajo nivel Lee (lee tasa de retención: & gt; 70%, contenido de GC: 45 ~ 46%, la secuencia longitud: 36 ~ 100 pb) fueron asignadas para hacer referencia genoma para cada muestra (Tabla 1). De acuerdo con el "
Normas
,
Las directrices y mejores prácticas para la RNA-Seq
" adoptado por ENCODE [36], esta profundidad secuenciación es bueno para el análisis de expresión diferencial y es aceptable para el análisis de splicing alternativo en el transcriptoma humano.
expresados diferencialmente y, alternativamente, los genes empalmados inducidos por el tratamiento berberina
después de analizada mediante el uso de software de DESeq, resultados de RNA-seq devuelto 343 DEGs en BEL-7402 después de células tratadas con berberina, con 111 hasta reguladas y 232 abajo reguladas (Tabla a en S1 archivo). Curiosamente, la respuesta del proceso biológico de la bacteria (GO: 0009617) fue encontrado para ser enriquecido significativamente hasta reguladas DEGs (Tabla 2), lo cual es consistente con el uso clínico de la berberina como un medicamento antimicrobiano de amplio espectro [3]. Y encontramos los genes relacionados con la regulación positiva de la angiogénesis fueron significativamente las reguladas por la berberina, que da cuenta de la actividad anti-angiogénico de berberina reportado en trabajos previos. [37-39] De acuerdo con la vía de análisis de enriquecimiento KEGG, los DEGs fueron significativamente enriquecido en vía de señalización de p53 (hsa04115) y varias vías relacionadas con el cáncer tales como vía de señalización Jak-STAT (hsa04630), la apoptosis (hsa04210) y las vías en el cáncer ( hsa05200) (Tabla 3). La vía de señalización Jak-STAT de señalización es un importante implicado en la regulación del sistema inmunológico, lo que sugiere la actividad de regulación de la inmunidad de la berberina puede contribuir a su efecto anti-cáncer.
Mientras tanto, alternativa análisis de corte y empalme se llevó a cabo utilizando el software AltAnalyze. Los resultados mostraron que 1083 exones diferencialmente empalmados alternativamente, correspondientes a 867 DASGs (Tabla B en S1 del archivo) se identificaron en células de cáncer BEL-7402 después del tratamiento berberina. Tomado gen Rlim como un ejemplo (figura 1), el nivel de inclusión del exón 2 en el ARNm maduro se cambió significativamente (índice de empalme & lt; 0,5) después del tratamiento berberina, mientras que hubo sólo un pequeño cambio en la totalidad de su nivel de expresión génica. En comparación con Rlim, no había manera espectacular variación (pliegue de cambio & gt; 6) en el nivel de expresión de genes de NFKBIA (como un ejemplo de DEG) pero sin cambios significativos (índice de empalme ≈ 1) en la inclusión de sus exones (Fig 1). Como se muestra en la Tabla 2, los DASGs estaban involucrados en una variedad de procesos biológicos como el ciclo celular (GO: 0007049), organización de los cromosomas (GO: 0051276), el montaje complejo macromolecular (GO: 0065003) y la respuesta celular al estrés (GO: 0.033.554). análisis de la vía de enriquecimiento representado que estas DASGs fueron enriquecidos en PI3K-AKT-mTOR vía de señalización (tiene: 04150) y la regulación del citoesqueleto de actina (tiene: 04810) (Tabla 3), que todos altamente relacionado a los procesos del ciclo celular y la proliferación celular [40 ]. Claramente, estos resultados sugieren que estos DASGs también podrían estar relacionados con la acción anticancerígena de berberina.
El análisis estadístico de la cruz-funcional hablando entre DEGs y DASGs
Para explorar si hay algún tipo de funcionalidad cruzada hablar entre DEGs y DASGs, las pruebas estadísticas se llevaron a cabo desde tres perspectivas diferentes pero primarios.
local co-enriquecimiento entre las secuencias de los cromosomas.
Intuitivamente, se debe comprobar en primer lugar si los DEGs y DASGs se enriquecen juntos en las mismas o cercanas regiones de los cromosomas. Para llevar a cabo este examen, un enriquecimiento Resultado fue asignado a cada banda en todos los cromosomas de DASGs y DEGs, respectivamente [32]. Como se muestra en la figura 2A, los DEGs y DASGs exhiben bastante diferentes distribuciones de enriquecimiento a nivel mundial. Sin embargo, los patrones se podrían encontrar en cada región local. La mayoría de los sitios DASG enriquecido están en o cerca de los sitios enriquecidos por DEGs. Para cuantificar el co-patrón de enriquecimiento entre DEGs y DASGs, se calculó la distancia euclídea (0,941) entre las puntuaciones de enriquecimiento en todas las bandas de los cromosomas de DEGs y DASGs. Para probar la significancia estadística de la distancia entre DEGs y DASGs, simulaciones por muestreo al azar dos conjuntos de genes en el mismo tamaño de DEGs y DASGs se llevaron a cabo para 10000 veces para producir la distribución de la distancia euclidiana entre dos conjuntos de genes en los cromosomas . Como se muestra en la figura 2B, la distancia entre DEGs y DASGs fue significativamente más corta que las existentes entre los conjuntos de la muestra al azar. Estos resultados demostraron claramente que los DEGs y DASGs son físicamente co-enriquecida en los cromosomas correspondientes.
cercanía global basada en la interacción proteína-proteína red (PPI).
Tras el resultado anterior, adicional se tomaron los esfuerzos para medir la conexión funcional entre estos dos conjuntos de genes basado en la red PPI. En un primer momento, se realizaron simulaciones aleatorias 100000 tiempo para construir la distribución de un promedio de distancia más corta camino entre dos conjuntos de genes en las mismas escalas que DEGs y DASGs [33]. Entonces, la distancia promedio entre DEGs y DASGs se calcula y se compara con la distribución. Como se muestra en la figura 3, el primero es lejos de la media de la distribución simulada a una significación estadística de p-valor & lt; 0.05. Los resultados indicaron que estos DEGs y DASGs podrían estar estrechamente conectados a través de la interacción proteína-proteína.
A. Una ilustración ejemplo de la cercanía entre dos conjuntos de genes. Cada punto de un círculo representa un nodo en la red y cada línea representa el borde entre dos nodos. La ruta de color rojo es el camino más corto entre X e Y en esta red, que es de 3 pasos. La parte derecha es la matriz de corta longitud de la trayectoria entre todos los pares posibles a partir de dos conjuntos de genes (set_1 {Y, C, D}, set_2 {X, A, F}). Y su promedio más corta longitud de recorrido es de 2.78. B. La curva azul por encima del histograma de color amarillo se ajusta a la distribución de proximidad entre dos conjuntos de genes al azar en los mismos tamaños de DEGs y DASGs respectivamente. La línea roja punteada se refiere a la distancia entre DEGs y DASGs. El valor p representa la proporción de pares de genes con la distancia más corta que la que existe entre DEGs y DASGs.
similitud semántica funcional sobre la ontología árbol de genes (GO).
Mientras DEGs y se encontró que DASGs tener una distancia significativamente más corto en comparación con los conjuntos de genes-aleatorio muestreado de acuerdo con la red PPI, este tipo de correlación funcional es indirecta y no con fuerte importancia biológica. Por lo tanto, se empleó un método más directo para medir la correlación funcional entre DEGs y DASGs basado en los procesos biológicos afectados por ellas [35]. Para equilibrar la eficiencia y la medición robustez computacional, los términos GO proceso biológico con al menos 10 genes se seleccione como el conjunto proceso biológico de referencia (Fig 4A). Una puntuación de similitud semántica se asigna a cada dos GO términos basados en la estructura gráfica de GO, como se ilustra en la figura 4B. A continuación, una puntuación de similitud semántica promedio se calcula sobre todos los pares de términos GO, respectivamente, de los procesos biológicos afectados por DEGs y DASGs utilizando la estrategia promedio mejor partido. Y los procedimientos se realizaron en dos conjuntos de genes seleccionados al azar en la misma escala que DEGs y DASGs de 10000 veces para obtener la distribución de la similitud semántica promediado. Como se muestra en la figura 4C, la similitud semántica promediado entre DEGs y DASGs es extremadamente mayor que dos conjuntos aleatorios de recogida, lo que indica que estos dos genes conjunto podrían estar conectados funcionalmente.
A. La trama circular muestra la proporción de los términos de GO con el número gen correspondiente. El barplot representa el número de GO términos con los genes más que cada uno de corte del número de genes. Y la parte de los términos de GO con más de 10 genes fueron seleccionados para su posterior cálculo. B. el mapa de calor de GO similitud semántica entre cada dos términos GO seleccionados. Cuanto más caliente el color, mayor es la similitud entre los dos términos. C. La curva representa la distribución de similitud semántica entre dos conjuntos de genes seleccionados al azar en el mismo tamaño de DEGs y DASGs respectivamente. La punta de diamante rojo se refiere a la similitud semántica entre DEGs y DASGs.
Discusión
La transcripción y splicing alternativo son dos procesos biológicos importantes durante la expresión génica, que en conjunto determinan el proteoma de las células bajo una cierta condición. En este estudio, para explorar la conexión funcional entre los genes expresados diferencialmente y genes diferencialmente alternativas de corte y empalme en las células cancerosas tratadas con berberina, se recogió el perfil de mRNA de las células BEL-7402 a través de RNA-seq. Entonces, tanto los DEGs y DASGs inducidos por la berberina fueron cuidadosamente identificados por un conjunto de software de análisis de secuencia. Sobre la base de la DEGs análisis funcional de enriquecimiento, se sugirieron dos posibles mecanismos que subyacen a la propiedad detención del ciclo celular para la berberina como a continuación.
berberina podría inducir la detención de fase G1 dependiente de p53 de las células cancerosas BEL-7402. Después las células BEL-7402 fueron tratados con berberina, cinco genes (
BBC3
,
FAS
,
CCNG2
,
GADD45B
, y
IGFBP3
) fueron reguladas y dos genes (
CASP9
,
THBS1
) fueron reguladas hacia abajo (Tabla C en S1 archivo) en la vía de señalización de p53. Cabe destacar que los cinco genes regulados son objetivos de abajo de p53 [41-45]. Mientras tanto, se encontró p53 que se expresa en un nivel modesto en BEL-7402 células antes y después del tratamiento berberina. El estado de p53 de tipo salvaje en la línea celular BEL-7402 también fue confirmado por otros investigadores [46, 47]. Estos resultados sugieren que la vía de señalización p53 podría ser influenciado bajo perturbación berberina. Como es sabido, p53 es una proteína de punto de control del ciclo celular crucial que hará que la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN [48]. Dos genes relacionados con el ciclo celular (CDKN2D, GADD45B), que están en la vía de aguas abajo de p53, se encontró que eran hasta regulada después del tratamiento berberina. Ellos podrían inhibir la actividad de las CDK que regulan la transición de fase G1-S. Y la detención del ciclo celular en la fase G1 en las células BEL-7402 inducidos por la berberina también se encontró en nuestro trabajo previo a través del análisis de citometría de flujo. [8] En conjunto, nuestros resultados indican que la berberina podría inhibir la proliferación de células BEL-7402 mediante la inducción del ciclo celular G1 detener de una manera dependiente de p53. Además, también se informó de la detención del ciclo celular dependiente de p53 en la fase G1 en varias otras líneas celulares de cáncer después del tratamiento berberina. [37-39] Nuestros estudios previos informaron el efecto detención del ciclo celular de la berberina por la orientación de la calmodulina, lo que podría ser la señal aguas arriba de las vías de p53 [8].
berberina podría suprimir la producción de citoquinas inflamatorias a través de la inhibición de NFkB. Resultados de ARN-ss indicaron que
NFKBIA gratis (
I? B
) fue significativamente hasta reguladas por el tratamiento berberina (cuadro D S1 Archivo). Como un inhibidor de NFkB,
I? B
puede dificultar la translocación de NFkB del citoplasma al núcleo [49]. Estudios anteriores han demostrado que la inhibición de NFkB puede influir en la expresión de muchos factores inflamatorios que podría promover el crecimiento de células tumorales y la invasión tumoral y la metástasis instalación [50]. En este estudio, cinco citoquinas (
IL-6
,
IL-8
,
IL1A
,
IL-33
y
IL11
) (Tabla D en S1 archivo) resultaron ser las reguladas después del tratamiento berberina acuerdo con los resultados de RNA-seq. Cabe destacar que todas estas citoquinas han sido reportados como factores pro-inflamatorias. Por ejemplo,
IL-6
y
IL-8
fueron reportados a ser significativamente expresado alto y desempeñar un papel importante en la migración y proliferación de las células cancerosas sostenible de hígado humano [51-53].