Extracto
Introducción
inherente y adquirido resistencia a cisplatino reduce la eficacia de este fármaco en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso puede resultar en el desarrollo de nuevos agentes para mejorar la sensibilidad de cisplatino.
Métodos
Un modelo isogénicas de la resistencia a cisplatino fue generada en un panel de líneas celulares de cáncer (A549, SKMES-1, MOR, H460). Durante un período de doce meses, las líneas celulares resistentes al cisplatino (CII) se derivaron de las células originales, de la misma edad de los padres (PT) y posteriormente caracterizado. Proliferación (MTT) y ensayos de supervivencia clonigénicas (violeta cristal) se llevaron a cabo entre las células de PT y CISR. La respuesta celular a la distribución de la apoptosis y el ciclo celular inducida por cisplatino se examinaron por análisis FACS. Un panel de marcadores de células pluripotentes y madre del cáncer se examinó además de las proteínas de la EMT, c-Met y β-catenina. También se evaluó la formación de aductos de cisplatino-ADN, el daño del ADN (γH2AX) y la captación de platino celular (ICP-MS).
Resultados
Los estudios de caracterización demostraron una disminución de la capacidad proliferativa de las células tumorales de pulmón en respuesta al cisplatino, aumento de la resistencia a la muerte celular inducida por cisplatino, la acumulación de células resistentes en la fase G0 /G1 del ciclo celular y el aumento de capacidad de supervivencia clonogénico. Por otra parte, las células resistentes muestran una firma tallo-como putativo con una mayor expresión de CD133 + /CD44 + células y el aumento de la actividad de ALDH en relación con sus padres células correspondientes. Los marcadores de células madre, Nanog, Oct-4 y Sox-2, se upregulated significativamente al igual que los marcadores de EMT, c-Met y β-catenina. Mientras sublíneas resistentes demostraron una disminución de la captación de cisplatino en respuesta al tratamiento, la reducción de la formación de aductos de ADN cisplatino-GPG y disminuyeron significativamente se observaron focos γH2AX en comparación con líneas celulares de sus padres.
Conclusión
Nuestra cisplatino resultados identificados subpoblaciones resistentes de células de NSCLC con una firma de tallo como putativo, proporcionando una mayor comprensión de los eventos celulares asociados con el fenotipo de resistencia a cisplatino en el cáncer de pulmón
Visto:. Barr MP, Gray SG, Hoffmann AC, Hilger RA , Thomale J, O'Flaherty JD, et al. (2013) Generación y Caracterización de resistentes al cisplatino células no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón Viendo una firma de vástago igual. PLoS ONE 8 (1): e54193. doi: 10.1371 /journal.pone.0054193
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 7 Febrero, 2012; Aceptado: December 10, 2012; Publicado: 17 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Barr et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Más de un millón de casos de cáncer de pulmón son diagnosticados. cada año. La enfermedad es la principal causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres [1]. A pesar de los intensos esfuerzos para controlar la morbilidad y la mortalidad por cáncer de pulmón, la tasa de supervivencia global a cinco años sigue siendo pobre.
El cisplatino,
cis
-Diamminedichloro-platino (II), es uno de los más comúnmente utilizado agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de cáncer, en particular cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [2]. Los efectos citotóxicos de cisplatino están mediados por su interacción con el ADN, lo que resulta en la formación de aductos de ADN que activan varias vías de transducción de señales y culminan en la activación de la apoptosis [3]. Mientras que el 20-40% de los pacientes con experiencia NSCLC metastásico una respuesta parcial a las terapias de combinación recién desarrollados [4], la mayoría de los respondedores recaída dentro de los seis meses [5]. Dentro de la población de pacientes que sufren una recaída, se ha propuesto la selección de células y /o adquisición de células resistentes durante el tratamiento con quimioterapia resistentes pre-existentes. Por lo tanto, una mejor comprensión de la base molecular de la resistencia a cisplatino está garantizado con el fin de dilucidar los mecanismos subyacentes y los marcadores de este fenotipo resistente a los medicamentos, que en la actualidad limita radicalmente la utilidad clínica de este fármaco en pacientes con cáncer de pulmón.
Recientemente, se propuso la teoría de la célula madre del cáncer (CSC) para explicar la heterogeneidad del tumor y la carcinogénesis [6]. Según este modelo, los tumores pueden ser vistos como un resultado de la organogénesis anormal impulsado por CSC de. Estos son células tumorales auto-renovación de que son capaces de iniciar y mantener el crecimiento del tumor a través de las subpoblaciones de células tumorales con características madre o células progenitoras. El uso de
in vitro en sistemas e
in vivo y modelos de xenoinjertos de cáncer de pulmón primarios humanos en ratones, investigaciones recientes han demostrado que las células tumorales de pulmón que expresan marcadores específicos CSC eran altamente carcinogénico, dotados con tallo-como características y salvado por el tratamiento con cisplatino [7].
En este estudio, hemos generado y caracterizado un panel de líneas celulares de cáncer resistentes a cisplatino, proporcionando una herramienta valiosa con la que investigar los mecanismos moleculares y células madre putativa Los marcadores que pueden estar asociados con este fenotipo de resistencia en el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Líneas celulares
La línea celular de cáncer de pulmón de células grandes humana, NCI-H460 (en lo sucesivo denomina H460) y su variante resistente fue cedida gentilmente por el Dr. Dean Fennell, Centro para la Investigación del cáncer y Biología celular, Universidad Queen de Belfast [8]. La línea celular de adenocarcinoma humano, MOR [9], y su correspondiente variante resistente cisplatino se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Promochem, Teddington, Reino Unido). A549 (adenocarcinoma) y SKMES-1 (carcinoma escamoso) líneas celulares también se adquirieron de la ATCC [10], [11]. MOR y células H460 se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) mediano. Las células A549 se cultivaron en medio F12 de Ham suplementado con 4 mM L-glutamina mientras que las células SKMES-1 se cultivaron en medio EMEM suplementado con 2 mM de aminoácidos no esenciales 1% de L-glutamina y (NEAA). Para todas las líneas celulares, los medios de comunicación se complementó con suero inactivado por calor 10% fetal bovino (FBS), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (Lonza, Reino Unido). Todas las células se cultivan como cultivos monocapa y se mantuvieron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire a 37 ° C.
Medicamentos
El cisplatino [
cis
-diammineplatinum (II) dicloruro] se obtuvo de Sigma-Aldrich y se disolvió en 0,15 M NaCl. Las alícuotas fueron almacenadas a -20 ° C hasta por un máximo de tres meses y se descongelaron inmediatamente antes de su uso.
inducción de cisplatino-resistencia en las células NSCLC
resistentes al cisplatino (CII) variantes de cada línea celular se deriva de cada uno (PT) línea original parental de células por la exposición continua a cisplatino (Sigma-Aldrich, UK) después de los estudios de dosis-respuesta iniciales de cisplatino (0,1 M-100 mM) durante 72 h desde la que IC
se obtuvieron 50 valores. Inicialmente, cada sublínea CISR fue tratado con cisplatino (IC
50) para 72 h. El medio se retiró y se dejó que las células se recuperaran durante otras 72 h. Este período de desarrollo se llevó a cabo durante 6 meses aproximadamente, después de lo cual IC
50 concentraciones fueron re-evaluado en cada línea celular resistente. Las células fueron mantenidas continuamente en presencia de cisplatino a estos nuevos IC
50 concentraciones durante 6 meses. Mientras que las células A549 se trataron inicialmente con IC
50 concentraciones de cisplatino, las células fueron sensibles al tratamiento a esta concentración que resulta en la senescencia celular y el crecimiento retardado. Por esta razón, se redujo la concentración de cisplatino (IC
25) hasta que las células demostraron sensibilidad a cisplatino en el IC
50 concentración apropiada.
sensibilidad del ensayo de Drogas (MTT)
Las células (2,5 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche a 37 ° C. En pocas palabras, después del tratamiento de las células con cisplatino durante 72 h, el reactivo MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro] se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 4 horas a 37 ° C . Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) a cada pocillo y se mezcló durante 5 min en un agitador orbital. La absorbancia se registró a 595 nm y la sensibilidad al cisplatino se calcula en base a las mediciones de proliferación celular a las 72 h
Ciclo Celular & amp.; Análisis Apoptosis
Las células se recogieron por tripsinización, se sedimentaron por centrifugación a 1300 rpm durante 3 min y se suspendieron en 1 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS). Las células se fijaron posteriormente en 90% de etanol frío y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 1 ml de PBS que contenía yoduro de propidio (25 g /ml) y RNasa A (100 mg /ml) libre de DNasa. Después de incubación a 37 ° C durante 30 min, la distribución del ciclo celular de las células de PT y CISR se analizaron mediante FACS (Becton Dickinson, UK). Se midieron las células apoptóticas (SubG0) en respuesta a concentraciones crecientes de cisplatino entre las células de PT y CISR después del tratamiento durante 24 h.
Clonigénicas Ensayo de Supervivencia
La sensibilidad de las células de NSCLC con el cisplatino se midió utilizando el ensayo clonogénico, el método de elección usado para determinar la efectividad de los agentes citotóxicos, tales como la quimioterapia [12]. Las células se dejaron adherir durante la noche a 37 ° C y se trataron con concentraciones crecientes de cisplatino para 9-14 días. Las colonias se fijaron y se tiñeron con metanol (25% v /v) que contiene violeta cristal (0,05% w /v) durante 30 min después de lo cual se retiró la solución de tinción residual y las placas se lavaron con agua. Las colonias que constan de células 100 o más se contaron usando el contador de colonias ColCount ™ (Oxford Optronix Ltd, Oxford, UK). eficiencias de chapado (PE) se calcularon utilizando la fórmula: PE = número de colonias /número de células sembradas. La fracción superviviente (SF) se calculó usando la fórmula: SF = número de colonias /número de células sembradas × PE). Las curvas de supervivencia se construyeron para la determinación de la capacidad de supervivencia de las células resistentes al cisplatino en relación con células madre en respuesta a diversas concentraciones de cisplatino.
Análisis de citometría de flujo de cáncer putativo tallo marcadores de células
Padres y cisplatino células resistentes se recogieron por tripsinización y se lavaron en tampón FACS (2% de FBS 0,1% de azida de sodio en PBS) y se sedimentaron por centrifugación a 1300 rpm durante 3 min. tinción dual para CD133 y CD44 (marcador de células epiteliales) se llevó a cabo. Las células (1 × 10
6) se incubaron con o bien CD133 /1 (AC133) ficoeritrina (PE) de anticuerpos -etiquetados control de anticuerpo o isotipo (IgG1) (Miltenyi Biotec GmbH), o anticuerpo CD44 conjugado con FITC anti-humana y control de isotipo (IgG2b) (ImmunoTools GmbH, Alemania) correspondiente durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Las células se lavaron brevemente y se resuspendieron en tampón FACS para el análisis posterior. Las muestras se adquirieron y analizaron por FACS. dispersión lateral y perfiles de dispersión frontal se utilizan para eliminar los desechos celulares y dobletes. El porcentaje CD133 + y células CD44 + se determinó en líneas celulares de PT y CISR por citometría de flujo.
Aldefluor Ensayo
Se utilizó el kit Aldefluor (Cell Technologies, Vancouver, Canadá STEM) para identificar poblaciones de células con aldehído deshidrogenasa actividad (ALDH1). El ensayo se llevó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células (1 × 10
6 células /ml) fueron cosechadas a partir de líneas celulares de PT y CISR y se resuspendió en Aldefluor Tampón de Ensayo y se incubó durante 60 minutos a 37 ° C. La cantidad de producto de reacción ALDH fluorescente que se acumula en las células se correlaciona directamente con la actividad de ALDH en estas células. eflujo activo de las células se inhibe por la formulación especial de la Aldefluor tampón de ensayo. Para cada línea celular (PT y CISR), células de control se tiñeron utilizando condiciones idénticas pero incluyen un inhibidor de ALDH específica, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), para servir como un control negativo para cada experimento. Tales células se reconocen mediante la comparación de la fluorescencia en una muestra de ensayo a que en una muestra de control que contiene DEAB. Como sólo las células con una membrana celular intacta pueden retener el producto de reacción Aldefluor, sólo se identificaron las células ALDH1-positivo viables. Se detectaron las células que expresan ALDH1 brillantes fluourescent (ALDH1-positivo) en el canal verde fluorescente (520-540 nm) de un cian
ADP citómetro de flujo (Dako, Glostrup, Dinamarca) y se calcula como las células ALDH1 positivos porcentuales en cada línea celular.
Análisis Western Blot
La proteína total se extrae de los padres y cisplatino células resistentes utilizando tampón RIPA enfriado con hielo (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 EDTA mM, 1% (v /v) de Triton-X 100, 0,1% (w /v) SDS) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y cóctel inhibidor de la proteasa (AEBSF 2 mM, EDTA 1 mM, 130 mM bestatina, 14 M E-64, 1 mM Leupepin, 0,3 M aprotinina). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo del ácido bicinconínico según las instrucciones del fabricante (BCA). La proteína (40 mg) a partir de lisados de células enteras se fraccionó en 12% de geles de SDS-PAGE y transferidos a una membrana de PVDF (Pall Corporation, FL, EE.UU.). Eficacia de transferencia y carga se confirmaron mediante tinción reversible de la membrana con solución Ponseau S (Sigma-Aldrich, UK) después de la transferencia de proteínas. Las membranas se bloquearon a temperatura ambiente con leche en polvo desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween-20 (TBS-T) y se exploró el uso de un panel de marcadores de células madre embrionarias humanas (Abcam plc, Reino Unido) . Estos anticuerpos policlonales de ratón de conejo primario incluyó a Nanog, Oct-4 y Sox-2 (1:1000). La expresión proteica de c-Met (Millipore) y β-catenina (BD Transducción Laboratories) También se examinó utilizando anticuerpos monoclonales de ratón en 1:100 y 1:2000, respectivamente. Las membranas se lavaron en TBST y se incubaron con una peroxidasa de rábano secundaria (HRP) itrio anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente (1:2000). Las membranas se lavaron en TBST después de la incubación con anticuerpos secundarios. complejos de anticuerpos unidos se detectaron y visualizaron utilizando SuperSignal
® West Pico sustrato aumento de quimioluminiscencia (Pierce, IL, EE.UU.). Las transferencias fueron despojados y re-probaron con anticuerpo α /β tubulina (Señalización Celular) para el control de carga. El análisis densitométrico se llevó a cabo utilizando el software y el porcentaje de expresión TINA ™ representado con respecto a los controles (100%).
inmunofluorescencia Microscopía y medición de cisplatino de ADN aductos
Cells (PT y CISR) fueron tratados con cisplatino (IC
50) durante 0, 4, 12 y 24 h después de lo cual se recogieron por tripsinización y se lavaron dos veces en PBS. Las células (1 × 10
6 células /ml) se resuspendieron en PBS y manchado (10 l), por triplicado, en Superfrost Oro Diapositivas (ThermoFisher). Los portaobjetos se permitió brevemente al aire seco a temperatura ambiente. La tinción de inmunofluorescencia y la medición de los productos de platinación de ADN específica se llevó a cabo como se describe anteriormente [13], con modificaciones menores. Brevemente, las células se fijaron durante la noche en metanol enfriado con hielo y se sometieron a digestión proteolítica con 60 mg /ml de pepsina y 40 mg /ml de proteinasa K (100 l por punto de 10 min a 37 ° C en una cámara humidificada). Tras el bloqueo de los sitios de unión no específica con 5% (w /v) de leche en polvo no grasa en PBS, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo primario de rata que reconoce específicamente aductos de ADN CDDP (GPG RC-18) a 37 ° C durante 2 h o 4 ° C durante la noche. de unión del anticuerpo primario se detectó utilizando un anticuerpo anti-rata marcada con Cy3® (Dianova, Hamburgo). Los portaobjetos se incubaron a continuación en 1 g /ml DAPI en PBS durante 30 min a TA durante la contratinción nuclear (v /w). Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio de fluorescencia Axioplan (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Alemania) acoplado a una cámara CCD C4880 (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Alemania). Para la cuantificación de CDDP con los bienes públicos aductos de ADN por microscopía de inmunofluorescencia, las señales de fluorescencia se midieron por análisis digital de imágenes cuantitativa mediante el 6.0 Sistema ACAS CytometryAnalysis (ACAS II, Ahrens Electronics, Bargterheide, Alemania). Los niveles de aductos en cada muestra se calcularon como unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU) de, al normalización de fluorescencia integrado derivados de anticuerpos a partir de 200 núcleos individuales /muestra con el contenido de ADN correspondiente. Los datos se presentan como la media del intervalo AFU ± 95% de confianza (IC) de tres experimentos independientes.
γH2AX focos Formación Ensayo
Las células (5 × 10
3) se sembraron, en por triplicado, en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. células parentales y resistentes fueron tratados con cisplatino para 0, 4, 8, 12 y 24 h. En cada punto de tiempo, medios de cultivo celular se retiró de cada pocillo y se fijaron durante 10 min en 100 l de formaldehído (4% v /v en PBS). Las células fueron lavadas dos veces en PBS. tampón (suero de cabra al 5%, 3% de Triton X-100 en PBS) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente de bloqueo. Las células fueron incubadas durante la noche a 4 ° C con un conejo primaria 2AX anti-fosfo-histona anti-humana (Ser139) anticuerpo (1:100) (Cell Signalling Technology) en tampón de dilución de anticuerpos (1% Triton X- BSA.0.3% 100 en PBS). Después de la eliminación del anticuerpo primario, las células se lavaron tres veces en PBS y se incubaron con cabra Alexafluor 488 marcado con anti-anticuerpo secundario de conejo (Invitrogen) (1:2000) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. El anticuerpo secundario se retiró y las células se lavaron tres veces en PBS. Las células fueron incubadas con Hoechst 33342 tinción nuclear (3 mg /ml) durante 30 min a 37 ° C, seguido de tres lavados en PBS. Tinción de las células para 2AX histona fosforilada (detectado como focos verde fluorescente) se obtuvieron imágenes por inmunofluorescencia utilizando el análisis de alto contenido (GE Healthcare). Diez campos de visión por pocillo fueron adquiridos utilizando un objetivo 20X. tinción nuclear se detectó utilizando un filtro de excitación de 360 nm y emisión de filtro de 460 nm, mientras que Alexafluor 488 se detectó a 480 nm y 535 nm, respectivamente. La media de la intensidad de fluorescencia nuclear se utilizó como una medida de γH2AX usando Incell analizador 1000 software de análisis de imágenes.
Cuantificación de captación celular cisplatino por ICP-MS
Para los estudios de captación de cisplatino, las células (1 x 10
7 células /ml) se sembraron en frascos de cultivo y se dejaron adherir durante la noche. Las células se trataron luego con cisplatino durante 24 h. Después del tratamiento, las células se lavaron en PBS, se recogieron y se contaron. Para el análisis de la captación del fármaco, las células (1 × 10
6) se suspendieron en 1% HNO
3 durante 24 horas a 70 ° C. Las células lisadas se analizaron por espectrometría de masas acoplado por inducción de plasma (ICP-MS). ICP-MS proporciona un análisis cuantitativo de la concentración de un elemento en solución acuosa y tiene una sensibilidad de 5 PPT o mejor para los productos de platino. La concentración de analito es proporcional al número de iones de un elemento específico que alcanzan el espectrómetro de masas de la solución vaporizada a 6000 ° C. Una sola medición ICP-MS representa el promedio de 20 lecturas por replicarse dentro de cinco repeticiones de la misma muestra de líquido, con un error muy pequeño (& lt; 5%). Las concentraciones de cisplatino reportados fueron promediados entre cuatro series de culturas, lo que garantiza que los valores son del tamaño correcto para dar cuenta de las diferencias de población celular y diluciones.
Las curvas de calibración se generaron utilizando diluciones seriadas de las soluciones madre acuosas detectable de nuevo a la norma material de referencia (SRM) de NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología). Los coeficientes de variación fueron de 1 a 4% (intra-ensayo) y de 5 a 10% (inter-ensayo).
Análisis estadístico
La comparación estadística entre grupos se llevó a cabo utilizando el análisis de la varianza (ANOVA). Donde se compararon las medias de dos conjuntos de datos, la significación se determinó mediante un Los estudiantes de dos colas
t-
de prueba. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p = 0.05. Los datos se representan gráficamente como media ± error estándar de la media (SEM). Todos los datos fueron analizados utilizando GraphPad INSTAT ™ (versión 3) software estadístico.
Resultados
Generación de IC
50 Concentraciones y desarrollo de células de NSCLC con un resistentes al cisplatino Fenotipo
para determinar IC
50 valores con los que tratar las líneas celulares parentales en la generación de líneas celulares resistentes a cisplatino, las células fueron tratadas con concentraciones crecientes de cisplatino que van desde 0,1 M a 100 mM. La línea celular H460 CISR fue generado previamente y se mantiene con 5 M cisplatino. La sensibilidad de cada (PT) de la línea celular original a dosis crecientes de cisplatino se demostró, donde cisplatino significativamente (p & lt; 0,001). Inhibió la proliferación de A549, las células MOR SKMES-1 y a 10 mM-100 mM durante 72 h (Fig 1A ). Las curvas de dosis-respuesta se generaron y IC
50 concentraciones se calcularon para todas las líneas celulares (Fig. 1B). Las concentraciones de cisplatino (CI
50) varió entre las cuatro líneas celulares (
A549
5,95 M,
SKMES-1