Extracto
Cáncer lado la población de tallos como las células (SP) se han identificado en muchos tumores sólidos; Sin embargo, la mayoría de estas investigaciones se llevan a cabo utilizando líneas celulares de cáncer establecidas. Las células cancerosas en el tejido tumoral que contienen fibroblastos y muchos otros tipos de células son mucho más complejos que cualquier línea celular de cáncer. Aunque se identificaron células SP en la línea de laringe carcinoma de células escamosas (LSCC) de células Hep-2 en nuestro estudio piloto, se desconoce si el tejido LSCC contiene células SP. En este estudio, las células LSCC (LSCCs) fueron cultivadas primaria y purificado a partir de un espécimen LSCC resecado quirúrgicamente derivado de una neoplasia epiglottic bien diferenciado de un varón chino. Esto fue seguido por la verificación de las características del epitelio específico, como ultraestructura y biomarcadores. Una subpoblación SP distinta (4,45 ± 1,07%) se aisló por Hoechst 33342 análisis de flujo de salida de LSCCs cultivadas mediante el uso de un citómetro de flujo. cáncer de células madre (CSC) -asociado ensayos, incluyendo la expresión de auto-renovación y genes marcadores CSC, la proliferación, la diferenciación, la formación de esferoides, resistencia a la quimioterapia, y luego se llevaron a cabo entre tumorigenicidad LSCCs no SP (NSP) y SP.
in vitro
y
in vivo
ensayos revelaron que las células SP manifiestan expresión preferencial de auto-renovación y genes marcadores CSC, mayor capacidad de proliferación, la diferenciación y la formación de esferoides; resistencia a la quimioterapia reforzada; y una mayor tumorigenicidad de xenoinjerto en ratones inmunodeficientes comparación con las células de NSP. Estos hallazgos sugieren que los LSCCs cultivadas y purificadas primarias contienen células SP-madre como el cáncer, que puede servir como un modelo valioso para la investigación en el CSC LSCC
Visto:. Wu CP, Zhou L, M Xie, Du HD , Tian J, Sun S, et al. (2013) La identificación de las células madre, como el cáncer lateral de población en purificada en cultivo primario de laringe humana Carcinoma espinocelular epitelios. PLoS ONE 8 (6): e65750. doi: 10.1371 /journal.pone.0065750
Editor: Jian Cao, Universidad de Stony Brook, Estados Unidos de América
Recibido: November 26, 2012; Aceptado: April 29, 2013; Publicado: 11 Junio 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30872855) y la Fundación de Ciencia y Tecnología de Shanghai de China (12JC1402101). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción población lado
cáncer tallo-como las células (SP) se han identificado con éxito en una amplia gama de tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama [1], [2], carcinoma hepatocelular [3] - [7], pulmón cáncer [8], [9], cáncer gastrointestinal [10] - [12], cáncer de próstata [13], cáncer de vesícula biliar [14], cáncer de ovario [15], cáncer de endometrio [16], cáncer de páncreas [17], [ ,,,0],18], cáncer urológico [19], [20], el glioblastoma [21], el melanoma [22], el osteosarcoma [23], [24], las neoplasias mesenquimales [25], cáncer nasofaríngeo [26], el cáncer oral [27], [28], y otros tipos de cáncer de cabeza y cuello [29], [30]. Sin embargo, la mayoría de estas investigaciones se han realizado utilizando líneas celulares de cáncer establecidas. Aunque las líneas celulares de cáncer establecidas son herramientas útiles en la investigación básica y preclínica cáncer, son imita simplificadas de tejidos complejos y heterogéneos, sólidos cancerosos. Las células cancerosas en los fibroblastos de tejido tumoral primario que contiene, células del estroma, linfocitos y otros tipos de células son mucho más complejas que las células en cualquier línea celular de cáncer. Por lo tanto, las células cancerosas cultivadas y purificadas primarios derivados de los tejidos cancerosos pueden ser una mejor representación del tumor original.
carcinoma de células escamosas de laringe (LSCC) es una de las enfermedades más comunes de la región de la cabeza y el cuello. En los últimos años, los pacientes LSCC en la etapa avanzada todavía han tendido a sucumbir a la recurrencia locorregional y metástasis a distancia. células SP-madre como el cáncer desempeñan un papel crítico en la iniciación del tumor, el mantenimiento, la progresión, y la recaída [31] - [33]. Por lo tanto, la investigación en curso sobre células SP para desarrollar nuevos agentes que se dirigen a las células madre del cáncer (CSC) se necesita con urgencia.
nuestro estudio piloto SP células madre, como el cáncer identificado en la línea celular LSCC Hep-2 [30] . Sin embargo, se desconoce si el tumor sólido LSCC contiene células SP. En este estudio, por primera vez, se utilizó el análisis de Hoechst 33342 flujo de salida para identificar células SP, directamente de células purificadas en cultivo primario, bien diferenciados LSCC (LSCCs) derivadas de un paciente sometido a una laringectomía masculino chino por carcinoma de la epiglotis. Se encontró que los LSCCs cultivo primario contenían también una subpoblación SP distinta, lo que representó el 4.45 ± 1.07% del total de células cancerosas. Además, por
in vitro
y
in vivo
ensayos, documentamos que las células SP albergaban más propiedades madre-como cáncer en comparación con las células no-SP (NSP).
Materiales y Métodos
Ética Declaración
muestra tumoral se obtuvo con la aprobación del Comité de Ética del ojo, oído, nariz y garganta del hospital de la Universidad de Fudan, Shanghai, china. consentimiento informado firmado se obtuvo del paciente. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de Medicina Experimental de Shanghai. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Información del paciente
El paciente era un tratado de 68 años de edad de sexo masculino chino que se sometieron a laringectomía de células escamosas el carcinoma derivado de la epiglotis, el estadio IVA, T4aN2M0, sobre la base de la Unión Internacional para la 6ª edición de control del cáncer (UICC) sistema de clasificación TNM. En particular, no tienen antecedentes familiares de cáncer de cabeza y cuello, pero no tienen una historia de 40 años de fumar y 30 años de historia de consumo de alcohol.
cultivo primario y purificación de LSCCs
Una muestra del tumor resecado quirúrgicamente se sumergió en solución salina fría fosfato triple antibiótico tamponada (PBS) que contenía 1% de penicilina /estreptomicina y anfotericina B (10 mg /ml) (Invitrogen, Buffalo, Nueva York, EE.UU.), y la tijera en pequeños fragmentos, que a continuación se disociaron enzimáticamente en RPMI 1640 que contiene medio de colagenasa tipo IV (Sigma) a una concentración final de 200 U /ml durante al menos 12 horas a 37 ° C. Las células y los fragmentos restantes se aclararon y se suspendieron en BEGM ™ (medio de crecimiento celular epitelial bronquial) (Catálogo CC-3170; Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) suplementado con 1% de penicilina /estreptomicina. La suspensión se sembró en placas de petri de 60 mm en un humidificado 5% CO
2 incubadora a 37 ° C. Después de 3-4 días de incubación, algunos de los fragmentos y las células adheridas a la placa; los que no se adhieren se lavaron lejos antes se renovó el medio. Los fibroblastos se eliminaron mediante una breve exposición a 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen, Buffalo). Las células cancerosas cerca de confluencia fueron separadas con 0,25% de tripsina-EDTA y se subcultivaron. Las células se almacenan en nitrógeno líquido desde el paso 1.
morfológica de examen y inmunocitoquímica
LSCCs cultivadas se examinan bajo un microscopio de contraste de fase para las características morfológicas. Para validar el origen epitelial, LSCCs crecimiento durante 24 h en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 10 min y después se incubaron en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) /10% de suero normal de cabra /0,3% de Triton X- 100 (Boster, Wuhan, china) a temperatura ambiente durante 40 min para bloquear interacciones no específicas y permeabilizar las células. Los anticuerpos monoclonales contra citoqueratina humana (CK) (pan) (1:50, clonar AE1 /AE3; Maixin Biotech, Fuzhou, China), citoqueratina 5 (CK5) (1:50, catálogo c0246; Abou, San Francisco, CA, EE.UU. ), y vimentina (1:50, clon SP20; se añadieron Maixin Biotech) y se incubaron durante la noche a 4 ° C, seguido de la adición de anticuerpo secundario e incubación en la oscuridad durante 1 hora a 37 ° C. los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Boster, Wuhan, china). El anticuerpo secundario fue conjugado con Cy3 cabra anti-ratón /conejo inmunoglobulina (Ig) G cadenas ligeras y pesadas (H + L). (1:100; Jackson, Lancaster, PA, EE.UU.)
Microscopía Electrónica de Transmisión
Una pastilla obtenida a partir de los LSCCs cosechados en el paso 2 se fijó con glutaraldehido al 2,5% y fijó posteriormente en tetróxido de osmio al 1%. La muestra se deshidrataron a través de una serie graduada de alcohol y embebido en resina. Se cortaron secciones ultrafinas, teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se observaron con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM120 (TEM).
citómetro de flujo para la pureza de LSCCs cultivo primario
LSCCs cultivadas se tripsinizaron, se lavaron en PBS, se fijaron en 4% PFA durante 10 min, y se incubó en 1% de suero de BSA /10% normal de cabra /0,3% de Triton X-100 (Boster) a temperatura ambiente durante 40 min para permeabilizar las células y bloquear no específica interacciones. Esto fue seguido por la incubación en PBS que contiene CK (pan) anticuerpo isotiocianato de fluoresceína (1:500, clon C-11; Sigma) durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS y se analizaron usando un flujo cian ADP citómetro (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.). Las células tratadas con PBS en lugar de CK (PAN) sirvieron como control.
Detección y aislamiento de SP y NSP células mediante citometría de flujo
LSCCs cultivadas en fase de crecimiento exponencial fueron lavadas en PBS, se trataron con tripsina, y suspendido a una concentración de 1 x 10
6 células /ml en medio BEGM frío. Hoechst 33342 (Sigma) se añadió a una concentración final de 5 g /ml en la presencia o ausencia de verapamil (Sigma) a 50 mmol /l, se preincubaron durante 30 min a 37 ° C. Esto fue seguido por una incubación de 90 min en la oscuridad a 37 ° C con un intervalo de agitación. Después del lavado, se añadió 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma) para excluir las células muertas, y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo EPICS ALTRA (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.).
Ensayo de viabilidad celular
SP recién ordenados y LSCCs NSP se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células /pocillo en 0,2 ml de medio BEGM y medio libre de suero (SFM; se describe en el siguiente ensayo la formación de esferoides). Cada grupo se repitió en 6 pozos, y medio sin células sirvió como control. La viabilidad celular se midió utilizando el conteo de células Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) las instrucciones del fabricante, siguiendo. La incubación duró 3 h, y el ensayo se llevó a cabo por triplicado. absorbancia ultravioleta se midió a 450 nm con un lector de placas de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR)
reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA , EE.UU.) se utilizó para extraer el ARN total de las células SP aisladas y NSP utilizando. La transcripción inversa se realizó usando el kit de reactivos PrimeScript® TA con gDNA borrador (Takara, Dalian, China). PCR en tiempo real se realizó con el kit SYBR Premezcla Ex TaqTM (Takara) en un instrumento LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza). El ciclo térmico incluyó una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Beta-actina (ACTB) se utilizó como control endógeno. El 2
-ΔΔCT fórmula se utilizó para calcular la expresión de mRNA relativa de SP frente a las células de NSP. Los cebadores utilizados para la amplificación se enumeran en la Tabla 1.
Western Blot para el CSC marcadores
Sobre 30 g de proteína de las muestras de lisados celulares de células SP ordenada y NSP se analizaron mediante el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (Beyotime, Shanghai, china), electrotransferred a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, USA), y se sondearon durante la noche con anticuerpo primario (Epitomics, Burlingame, CA, EE.UU.) para CD44 (1:1,000 , 1998-1), CD24 (1:500, T3445), CD133 (1:1,000, 3621-1), ABCG2 (1:1,000, 3765-1), IMC1 (1:10,000, 5590-1), Oct4 ( 1:1,000, 2876-1), Sox2 (1:1,000, 2683-1), y NANOG (1:1,000, 3369-1). a continuación, se aplicó IgG de cabra anti-conejo (H + L) (1:5,000, Jackson), seguido por detección de la señal usando BeyoECL Plus (Beyotime, Shanghai, China). anticuerpo ACTB (1:5,000, R1207-1; Hua Biotech, Hangzhou, China) se utilizó para normalizar la cantidad de muestra cargada
Ensayo de proliferación
Ordenada SP y NSP LSCCs fueron sembradas como. descrito arriba. En los días 1, 3, 5 y 7 después de la clasificación, el crecimiento celular se ensayó usando el CCK-8, siguiendo las instrucciones del fabricante. La incubación duró 3 h, y el ensayo se llevó a cabo por triplicado. absorbancia ultravioleta se midió a 450.
Ensayo de diferenciación
SP aislado y las células de NSP se cultivaron en medio BEGM durante 18 días durante el cual las muestras se restained por Hoechst 33342 en días 6, 12, y 18 para cuantificar el porcentaje de células SP en cada grupo. Se utilizó un citómetro de flujo para el análisis
esferoide Formación Ensayo
Ordenada SP y las células de NSP (5.000 células /ml) se cultivaron usando el kit StemPro_ NSC SFM (A10509-01;. Invitrogen, Carlsbad), con SFM que contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) /F12, 20 ng del factor de crecimiento de fibroblastos /ml, y 20 ng del factor /ml de crecimiento epidérmico. Además, el 1% de 200 mmol /l de L-glutamina (25030; Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) se añadió. Después de la siembra, se observó la capacidad de formación de esferoides de los dos subconjuntos en el tiempo.
sensibilidad del ensayo de drogas
Ordenada SP y NSP LSCCs se sembraron a 5 x 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio BEGM que contiene cisplatino (Pharmaceutical Factory, Nanjing, china) en un gradiente de concentración (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 g /ml). Cada concentración se repite en 6 pocillos. Los otros pozos 6 paralelas se preincubaron con 50 mmol /l verapamil como quimiosensibilizador a cisplatino durante 30 min a 37 ° C. Una concentración de 0 g /ml sirvió como control. Un 6 pozos adicionales que contenía medio sólo sirvió como un control en blanco. Las células, cultivadas durante 48 h, se evaluaron por incubación con CCK-8 para 3 h. La tasa de inhibición (IR) se evaluó usando la fórmula IR = 100% de tasa de -survival (SR), y el SR se midió usando la fórmula SR = (media de absorbancia de los pocillos de ensayo /absorbancia media de los pocillos de control) x 100% .
xenoinjerto tumorigenicidad Ensayo
in vivo
Varón diabéticos no obesos (NOD) /inmunodeficiencia combinada severa (SCID), 6-8 semanas de edad (Slac Empresa Laboratorio Animal , Shanghai, china), se alimentaron en cabinas de flujo laminar en condiciones libres de patógenos específicos. Ordenado SP, las células de NSP, y LSCCs matrices sin clasificar se suspendieron en 0,2 ml de PBS y se inyecta en la axila de cada ratón. Los ratones se palpan dos veces cada semana para la formación de tumores y se sacrificaron 6 semanas después. Todos los nódulos tumorales fueron fotografiados, se pesaron, y se confirmaron mediante tinción de hematoxilina y eosina. Los valores de p se calcularon de acuerdo con los pesos de los tumores SP relación con los de los tumores de NSP.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) de al menos 3 experimentos independientes. t de Student o
se utilizó Mann-Whitney
prueba con el software GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego CA, EE.UU.) para examinar las diferencias. Los valores de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
morfológica, inmunocitoquímica, y ultraestructural Características
Los LSCCs cultivados crecieron como una monocapa en un patrón de adoquines, demostrando su epitelial. origen. Por otra parte, exhiben características típicas de cambio maligno (Fig. 1A-C). La tinción positiva de la CK (PAN) y CK5 y tinción negativa de vimentina confirmó su linaje epitelial (Fig. 1D-F). La micrografía electrónica de transmisión reveló características epiteliales típicos de LSCCs, incluyendo muchas mitocondrias, reticuli endoplasmático rugoso, ribosomas, grandes núcleos irregulares con la membrana nuclear que muestra hendidura profunda, y las proyecciones microvillus que se extienden sobre la superficie de la célula. Los bloques de tonofilamentos en el citoplasma y numerosos desmosomas en las conexiones intercelulares se observaron con frecuencia (Fig. 1G-I).
(A) de laringe células de carcinoma de células escamosas (LSCCs) crecieron directamente desde el explante de 48 h después de la siembra , rodeado por los fibroblastos (flecha). (B) En el paso 1, LSCCs creció con fibroblastos coexistentes (flecha). (C) En el paso 4, LSCCs creció vigorosamente y sin fibroblastos y exhibía características típicas de los cambios malignos, incluyendo numerosas figuras mitóticas, una gran relación entre núcleo al citoplasma, prominentes múltiples nucleolos, células gigantes multinucleadas ocasionales, vacuolas citoplásmicas, redonda y de células luminiscentes, y anormalidad nuclear. La tinción positiva de citoqueratina (CK) (pan) (D) y CK5 (E), y la tinción negativa de vimentina (F). características ultraestructurales (flechas) de LSCCs que muestran desmosomas en las conexiones intercelulares (G), tonofilamentos en el citoplasma (H), y la membrana nuclear sangría (I).
Pureza y clasificación de células SP en Purificada LSCCs cultivo primario
La pureza del cultivo primario LSCCs determinados por citometría de flujo fue de 98,32 ± 0,93% (Fig. 2A, B). la clasificación de células se llevó a cabo después de excluir las células muertas y restos celulares en base a señales de dispersión y fluorescencia de yoduro de propidio. La puerta R2 mostró las células SP que eran Hoechst 33342 negativa /dim, y la puerta R4 indica las células de NSP que eran Hoechst 33342 positiva. células SP ocuparon algunos 4,45 ± 1,07% de las células totales. Cuando preincubado con verapamil de 30 min, el porcentaje de células SP se redujo a 0,14 ± 0,13% de las células totales (Fig. 2C, D). Se recogieron células SP y NSP para experimentos posteriores. La pureza de células SP y no SP recién ordenados era 99,25 ± 0,23% y 98,98 ± 0,22%, respectivamente (Fig. 2E, F).
Pureza
(A) de LSCCs cultivadas determinados por citómetro de flujo utilizando citoqueratina (CK) (pan) (98,32 ± 0,93%) y el control (B). (C) Clasificación de LSCCs utilizando Hoechst 33342. La puerta R2 representa la población lateral (SP) células (4,45 ± 1,07% de las células totales) y la puerta R4 es la no-SP células (NSP). (D) La proporción de SP después del tratamiento con verapamilo fue de 0,14 ± 0,13%. La pureza de la SP recién ordenados (99,25 ± 0,23%) (E) y células de NSP (98,98 ± 0,22%) (F).
Viabilidad de las células Después Ordenando
Sin significativa no se detectaron diferencias en la viabilidad celular entre el SP recién ordenados y LSCCs NSP mantenido tanto en medio BEGM y SFM (P & gt; 0,05) (Fig. 3A), indicando que la concentración de Hoechst (5 mg /ml) utilizado en este estudio no potencialmente alterar la viabilidad celular de LSCCs NSP.
. (A) La viabilidad celular después de la clasificación. No se detectó ninguna diferencia significativa en la viabilidad celular entre la población lateral (SP) y las células no-SP (NSP) en medio epitelial bronquial crecimiento celular (BEGM) y medio libre de suero (SFM). Relativa (B) y los niveles de ARNm (C) de proteínas de auto-renovación y genes marcadores de CSC en SP y células NSP. (D) la tasa de crecimiento celular de las células SP y NSP tanto BEGM y SFM determinó por recuento celular Kit-8 (CCK-8) (*** P & lt; 0,01, ** P & lt; 0,05, * P & gt; 0,05).
Expresión de auto-renovación y genes CSC marcador en el nivel de ARNm
Las expresiones de ARNm relativas de ABCG2, IMC1, Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, CD133 y en SP y ordenada NSP células se determinaron por QRT-PCR. Los resultados mostraron que las células SP mostraron una mayor expresión de ARNm en ABCG2, BMI1, Oct4, NANOG, SOX2, y CD44 en comparación con las células de NSP. Sin embargo, no se detectó ninguna diferencia significativa de la expresión de CD24 y CD133 ARNm entre el SP y células NSP (Fig. 3B).
niveles de proteína de CSC marcadores
No se encontraron células SP haber aumentado de proteínas niveles de CD44, ABCG2, IMC1, Oct4, Sox2, y Nanog en comparación con las células de NSP. No se detectaron diferencias significativas de los niveles de proteína CD24 y CD133 entre SP y las células de NSP (Fig. 3C).
Cell Growth Rate
En los días 1, 3, 5 y 7 después de la clasificación, absorbancia de las células SP y NSP se midió utilizando CCK-8 para determinar la tasa de crecimiento. En el medio BEGM, tanto SP y las células NSP proliferaron en el tiempo. SP células alcanzaron una fase de crecimiento exponencial de 3 días después de la siembra y el día 7 que habían alcanzado una meseta. En contraste, las células NSP continuaron creciendo lentamente hasta el día 7 antes de pasar a una fase de actualización (P & lt; 0,001). En el SFM, células SP proliferaron de manera estable con una velocidad más baja que la de la BEGM. En contraste, las células NSP apenas se propagan (Fig. 3D).
Análisis Diferenciación
En los días 6, 12, y 18 después de la siembra, el SP cultivadas y las células fueron NSP restained con Hoechst 33342 a medir las diferencias en su capacidad de diferenciación. Los datos mostraron que el porcentaje de células SP disminuyó en cultivo con el tiempo, a 17,67 ± 1,45% en el día 6, 9,08 ± 0,61% en el día 12, y 4,45 ± 0,63% en el día 18 (Fig. 4A-F). En el día 18, el porcentaje de células 33.342 al aceite /negativos Hoechst en células SP cultivadas fue similar a la de LSCCs sin clasificar, mientras que las células de NSP cultivadas solamente contenían 0,07 ± 0,03% de células SP (Fig. 4G-H), que puedan haber surgido a partir de células SP residuales de la última clasificación.
el porcentaje de población lateral (SP) células detectadas en las células cultivadas SP disminuyó con el tiempo. El porcentaje de células SP fue 17.67 ± 1.45% en el día 6 (A, B), 9,08 ± 0,61% en el día 12 (C, D), y 4,45 ± 0,63% en el día 18 (E, F). Por el contrario, el porcentaje de células SP en cultivaron células no-SP (NSP) fue de 0,07 ± 0,03% (G, H).
Esfera Formación
SP células aisladas proliferaron de manera estable en el medio de cultivo de células madre. Flotantes esferas en suspensión generada a partir de una sola célula de SP LSCCs aumentaron de tamaño con el tiempo (Fig. 5A-C). Por el contrario, algunas células NSP murieron y otras propagan muy lentamente y no podían formar esferas visuales (Fig. 5D).
En el día 3 (A, × 100), el día 5 (B, × 100), y día 7 (C, × 400), flotando cúmulos esféricos de población lateral (SP) células expandidas en forma escalonada en el tiempo. Por el contrario, no SP (NSP) las células no pudieron formar grupos esféricas después de ser cultivadas durante 7 días (D, × 100). (E) La sensibilidad de SP recién ordenados y NSP al cisplatino. La tasa de inhibición (IR) de células SP mostró una diferencia significativa de las células de NSP en cada concentración (P & lt; 0,001), con la excepción de 11 mg /ml (p & gt; 0,05). células SP eran más resistentes a cisplatino que las células de NSP; esto podría ser revertido por el tratamiento previo verapamilo.
Las diferencias de sensibilidad al fármaco entre SP y células NSP
Las diferentes concentraciones de cisplatino se utilizaron para evaluar las diferencias de sensibilidad a los fármacos entre SP y células en NSP la presencia o ausencia de verapamil, un bloqueador de la ABCG2 transportador de superficie celular responsable de la resistencia quimioterapéutico. Cuando se trata con cisplatino solo, células SP mostraron una fuerte resistencia hasta que la concentración de cisplatino alcanzó 9 g /ml, y el IR de células SP no mostró diferencias significativas de NSP a una concentración de 11 mg /ml (p & gt; 0,05). En comparación con células SP, el IR de las células NSP mostró diferencia significativa en cada concentración (P & lt; 0,001), excepto en 11 mg /ml. El IR de células SP pretratados con verapamil aumentar sin diferencia significativa en comparación con las células de NSP (P & gt; 0,05), pero con una diferencia significativa en comparación con células SP sin pretratamiento verapamil (P & lt; 0,001). No se detectaron cambios notables en el IR de las células de NSP en la presencia o ausencia de verapamilo (P & gt; 0,05). (Fig. 5E)
Capacidad Superior Tumorígeno de células SP en NOD /SCID
Se utilizó el LSCCs no clasificados para el experimento preliminar y escogió 4 × 10
5 como el número de células de inoculación más alto de células SP y NSP. Con el menor número de células de la inoculación (2 × 10
4), SP células formadas dos tumores (n = 4); Por el contrario, el número de células de inyección bajo para células NSP para formar dos tumores fue 2 × 10
5 (n = 4). No se detectaron diferencias significativas entre los pesos de los tumores y los tumores SP NSP. Los resultados patológicos confirmaron que ambos tumores formados por células SP y NSP eran LSCCs bien diferenciadas, similar a la tumor original (Fig 6;. Tabla 2).
(A) Los puntos de inyección de diabéticos no obesos (NOD) /inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Hematoxilina y eosina de los tumores derivados del paciente (B), ratones (C, tumor formado por la población lateral (SP); D, tumor formado por no-SP (NSP) células). Tanto los tumores originales y xenoinjertados estaban bien diferenciado, carcinoma de célula típica, escamosa con perlas de queratina frecuentemente observadas (flechas). (E) con 2 × 10
5 células inyectadas, células SP formó cuatro tumores más grandes (4/4), mientras que las células NSP formaron dos tumores mucho más pequeños (2/4). (F) El análisis estadístico de los pesos tumorales SP y NSP en diferentes cantidades de células inyectadas (*** P & lt; 0,01, ** P & lt; 0,05).
Discusión
en este estudio describimos el aislamiento exitoso y la identificación de células SP cáncer de tallo como directamente de un espécimen LSCC resecado quirúrgicamente derivado de una neoplasia epiglottic bien diferenciado en un paciente masculino chino. Aunque LSCCs primarias son difíciles de cultivar
in vitro
, antes del aislamiento que se intentó el cultivo primario de 40 especímenes LSCC y tuvimos éxito en un caso. A continuación, purificados los LSCCs cultivadas mediante tripsinización diferencial repetida para eliminar la coexistencia de los fibroblastos.
El patrón monocapa y adoquines de LSCCs identificados por microscopía de contraste de fase, la tinción positiva de la CK (PAN) y CK5, tinción negativa de vimentina, y la ultraestructura del epitelio (incluyendo tonofilamentos y desmosomas) revelados por microscopía electrónica de transmisión confirmó el linaje epitelial de las LSCCs cultivadas (Fig. 1).
Dado que las células escamosas malignas se determinan fenotípicamente por citoqueratina, se utilizó un flujo de citómetro con CK anticuerpo (PAN) para evaluar la pureza de LSCCs cultivadas. Aunque los resultados deben ser 100%, la pureza era de 98,32 ± 0,93%, lo que podría ser el resultado de la eficacia imperfecta del anticuerpo (Fig. 2A, B). A continuación, demostraron que la LSCCs cultivo primario purificadas contenían una subpoblación de SP distinta (4,45 ± 1,07%), basado en su capacidad para excluir el 33342 tinte Hoescht, y esta capacidad podrían ser bloqueados por verapamil, consistente con informes anteriores que Hoechst 33342 exclusión es verapamil sensible (Fig. 2C-F).
como un tinte de unión a ADN, Hoechst es tóxico para las células, particularmente a altas concentraciones. A fin de eliminar la preocupación de que las células de NSP preferentemente conservan citotóxico Hoechst 33342, lo que podría alterar la capacidad de proliferación, un ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo después de la clasificación. Los resultados no revelaron diferencias significativas en la viabilidad celular entre el SP recién ordenados y células de NSP (P & gt; 0,05) (Fig. 3A), indicando que la viabilidad de las células de NSP LSCCs no estaba potencialmente afectada por 5 mg /ml Hoechst, una concentración ampliamente utilizado la investigación en la celda SP [34].
en comparación con las células de NSP, células SP tienen una mayor expresión de genes, tales como Oct4, NANOG, BMI-1, ABCG2, y SOX2 [31], que participan en la regulación de células madre auto-renovación. Curiosamente, estos cinco genes también funcionan como marcadores CSC en tumores sólidos [35], [36]. Además, CD44, CD24, CD133 y son marcadores CSC conocidas en tumores sólidos [37]. Se investigó la expresión de los ocho genes de ambos niveles de mRNA y proteína. De acuerdo con informes anteriores, no se encontraron células SP tener upregulated expresión significativa de Oct4, Nanog, IMC-1, ABCG2, Sox2, y CD44 tanto en mRNA y los niveles de proteína en comparación con las células de NSP. Es de destacar que las células NSP también mostraron expresión de la proteína CD44, en consonancia con los informes previamente que CD44 se expresa en casi todas las células cancerosas; esto refleja la ambigüedad de CD44 en el CSC de mantenimiento [38]. También se encontró que las células SP tener expresión similar de CD24 y CD133, tanto en los niveles de proteína ARNm y en comparación con las células de NSP, en consonancia con los informes anteriores de que los fenotipos de CSC para tumores sólidos pueden no ser necesariamente uniforme entre los diferentes tipos de cáncer o incluso tumores del mismo histológico subtipo (Fig. 3B, C) [37].
auto-renovación y diferenciación son propiedades clave de las células madre que les permitan dan lugar a progenie, incluyendo células madre cancerosas, que albergan potencial de proliferación ilimitada, ya fenotípicamente diversas células que forman la mayor parte del tumor. En el ensayo de proliferación, las células SP crecieron significativamente más rápido que las células de NSP en tanto BEGM y medio SFM (Fig. 3D), lo que confirma el potencial proliferativo ilimitado de células SP. La asimetría es un tipo particular de la división celular con un mecanismo atractivo en CSC ya que sólo requiere una división tanto para auto-renovación y diferenciación [39]. En el ensayo de diferenciación, el porcentaje de células SP a partir de células cultivadas SP disminuyó en cultivo con el tiempo, con un incremento gradual en el porcentaje de células NSP. Incluso en día 18, las células cultivadas NSP solamente contenían 0,07 ± 0,03% células SP (Fig. 4), y estos pueden haber surgido de células SP residuales de la última clasificación. Esto sugiere que las células SP pueden someterse a la división celular asimétrica de auto-renovación y generar fenotipos heterogéneos de baja células tumorigénicas, incluyendo las células de NSP; sin embargo, las células de NSP no pueden diferenciar en sentido inverso en las células SP.
Las células madre neurales tienen la capacidad de crecer en SFM y formar una neuroesfera. Estas propiedades han sido explotados para la selección de células madre como en los cánceres humanos, representados principalmente por cáncer de mama. En nuestro estudio, la capacidad de las células SP para generar colonias esféricas fue significativamente mayor que la de las células de NSP, consistentes con estudios previos (Fig. 5A-D) [8], [30].
En la droga ensayo de sensibilidad, que mide las diferencias de sensibilidad a los fármacos entre SP y células NSP. El mecanismo que regula el flujo de salida de colorante Hoechst se confiere en parte a través de la expresión de la proteína de unión a ATP casete transportadores (ABC), predominantemente ABCG2, que participan en el flujo de salida de los agentes quimioterapéuticos [40], [41]. Por lo tanto, se utilizó el verapamilo para bloquear el transportador ABCG2 membrana y observamos los cambios de toxicidad de cisplatino. Se encontró que las células SP eran mucho más resistentes a cisplatino que las células de NSP en cada concentración (P & lt; 0,001), excepto a los 11 mg /ml (P & gt; 0,05) Esta situación puede ser revertida por el tratamiento previo con verapamilo, lo que indica que el transportador ABCG2 puede jugar un papel importante en la resistencia a fármacos (Fig. 5E). Sin embargo, hay que señalar que los ratones de triple knockout Mdr1a /b /BCRP1 son viables y todavía conservan algunas células SP en la médula ósea [42], lo que sugiere que el mecanismo en el que se determina el fenotipo SP no se confiere únicamente a través de la expresión de proteínas transportadoras ABC.