Extracto
Antecedentes
Las publicaciones recientes sugieren que la iniciación neoplásica y el crecimiento dependen de un pequeño subconjunto de células, denominadas células madre del cáncer (CSC). Anaplásico de tiroides Carcinoma (ATC) es un tumor sólido muy agresivo con un mal pronóstico, que se caracteriza por una alta desdiferenciación. La existencia de células madre cancerosas podría dar cuenta de la heterogeneidad de las lesiones ATC. CD133 se ha identificado como un marcador de células madre de tejidos normales y cancerosas, aunque su función biológica sigue siendo desconocido.
Metodología /Principales conclusiones
líneas celulares ATC ARO, KAT-4, KAT-18 y FRO se analizaron para la expresión CD133. La citometría de flujo mostró CD133
células de punto de venta sólo en ARO y KAT-4 (64 ± 9% y el 57 ± 12%, respectivamente). Estos datos fueron confirmados por qRT-PCR e inmunocitoquímica. ARO y KAT-4 también fueron positivos para el marcador de fibronectina fetal oncofetal y negativo para-tirocito específica marcadores de diferenciación tiroglobulina, tiroperoxidasa y sodio /cotransportador de yoduro. Ordenados ARO /CD133
pos células exhiben mayor proliferación, autorrenovación, la capacidad de formación de colonias en comparación con ARO /CD133
neg. Además, ARO /CD133
pos mostró niveles de factor de transcripción tiroideo TTF-1 similar a la línea celular de tiroides fetal TAD-2, mientras que la expresión en CD133
neg /ARO era insignificante. La expresión del marcador de células madre OCT-4 detectado por RT-PCR y citometría de flujo fue notablemente mayor en pos ARO /CD133
en comparación con ARO /CD133
células Neg. El marcadores de células madre c-KIT y Thy-1 fueron negativos. Se investigó la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos, mostrando una notable resistencia a la apoptosis inducida por quimioterapia en ARO /CD133
pos si se compara con el /CD133
neg células ARO.
Conclusiones /Importancia
describimos CD133
pos células en líneas celulares de ATC. ARO /CD133
células madre pos exhiben características similares a las células - como la alta proliferación, la capacidad de auto-renovación, expresión de Octubre-4 - y se caracterizan por una mayor resistencia a la quimioterapia. La positividad simultánea para el factor específico de tiroides TTF-1 y onfFN sugieren que podrían representar las células madre, como el cáncer de tiroides putativos. Nuestros
in vitro
hallazgos podrían proporcionar nuevas perspectivas para nuevos enfoques terapéuticos
Visto:. Zito G, P Richiusa, Bommarito A, E Carissimi, Russo L, Coppola A, et al. (2008)
in vitro
Identificación y Caracterización de CD133
Las células de vástago como el cáncer de tiroides anaplásico en pos de carcinoma líneas celulares. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10.1371 /journal.pone.0003544
Editor: Karen S. Aboody, Ciudad del Centro Médico de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 7, 2008; Aceptado: 6 octubre de 2008; Publicado: 28 Octubre 2008
Derechos de Autor © 2008 Zito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) es uno de los tumores endocrinos más agresivos con características morfológicas de neoplasia indiferenciada. Los pacientes con ATC tienen un mal pronóstico, con una supervivencia media de 2-6 meses. La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia no mejoran la tasa de supervivencia [1].
Recientemente, se han identificado células madre adultas en las glándulas tiroides humanos [2]. Estas células expresan varios marcadores específicos, tales como el factor de transcripción nuclear OCT-4 (también conocido como OCT-3, OCT-3/4) y los marcadores endodérmico GATA-4 y HNF4α [2] - [4].
Una relación entre las células madre y el cáncer se ha sugerido en varios tejidos donde se supone que las células de cáncer de derivar a partir de progenitores inmaduros o células madre [5]. células madre de cáncer (CSC) se han encontrado en la leucemia [6], glioblastoma [9], gástrico [10], de pulmón [11], y de colon [12] el cáncer [7], de mama [8], de próstata. Estas células, que representan sólo una pequeña población de la mayor parte del tumor, poseen la capacidad simultánea de auto-renovación y diferenciarse en otros citotipos [13]. El fenotipo de tallo como ha demostrado ser capaz de resistir las terapias convencionales, lo que conduce a la recaída de la enfermedad, incluso cuando la lesión primaria se ha erradicado [14], [15]. Hasta la fecha, sin embargo, no existen estudios que definitivamente se indica que las células madre son responsables de la carcinogénesis de la tiroides. Sin embargo, el patrón de rareza y el rápido crecimiento de ATC se asemeja a la naturaleza de las células madre. Sólo un estudio ha descrito una población muy pequeña, denominada población lado, enriquecida para las células madre entre las líneas celulares de cáncer de tiroides [16]. Además, la hipótesis de la carcinogénesis de células fetales, en el que las células cancerosas se derivan de los restos de las células tiroideas fetales en lugar de tirocitos adultos, se ha propuesto [17].
Varios marcadores han sido identificados para la caracterización de Los CSC. CD133 humano, un homólogo del antígeno altamente conservado de ratón Prominin-1, se identificó originalmente en una subpoblación de CD34
+ células hematopoyéticas derivadas de hígado fetal humano y la médula ósea [18] - [19]. CD133 se ha utilizado para la identificación y aislamiento de una población putativo CSC de varios cánceres humanos [20], [21]. Además, la expresión de CD133
pos células madre cancerosas en el carcinoma hepatocelular (HCC) se demostró conferir la quimio-resistencia
in vitro
[14]. Sin embargo, su función biológica sigue siendo desconocido. El factor de transcripción OCT-4 se considera un regulador principal de la pluripotencia de células madre y la auto-renovación de las capacidades de embriones humanos [22]. Curiosamente, estas propiedades de las células madre se atribuyen a OCT-4A, una variante de empalme del gen OCT-4 se encuentra en el núcleo [23], [24].
El objetivo del presente estudio fue investigar la expresión de marcadores de células madre putativas en líneas celulares establecidas humanos ATC, como ARO, KAT-4, KAT-18 y FRO. Se identificaron CD133
células de punto de venta en ORA y líneas celulares KAT-4. Este subconjunto se caracterizó por una mayor
in vitro
proliferación, autorrenovación y la capacidad de formación de colonias. ARO /CD133
pos eran más resistentes que ARO /CD133
neg células a la apoptosis inducida por la quimioterapia. Además, ARO /CD133
pos células expresan el factor de transcripción específico thyroblast TTF-1 y el marcador de células madre OCT-4, mientras que eran negativos para marcadores de células madre del c-Kit y Thy-1.
Materiales y Métodos
líneas celulares y condiciones de cultivo
líneas celulares ATC humano ARO, KAT-4, KAT-18 y FRO fueron amablemente proporcionados por el Prof. A. Fusco, Universidad de Nápoles , Italia. Durante la expansión de fase y para las células de ensayo auto-renovación se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS). Para todos los otros experimentos, las células se cultivaron en medio RPMI1640 libre de suero (SFM), suplementada con factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF, 20 ng /ml;. Sigma-Aldrich) [25]
Citometría de flujo
La expresión de marcadores de células madre CD133, Oct-4, c-kit y Thy-1 se evaluó por el flujo citometría (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Para el análisis de CD133, las células fueron tratadas primero con FcR reactivo de bloqueo (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y después se incubaron en la oscuridad a 4 ° C durante 10 minutos con ficoeritrina (PE) de ratón conjugado con IgG2b humanos anti CD133 /2 (clon 293C3, Miltenyi Biotec). Para co-tinción con c-Kit y Thy-1, las células fueron incubadas con IgG1 monoclonal de ratón anti-humano c-KIT y los anticuerpos Thy-1 anti-humanos IgG1 de ratón (Chemicon Internacional, Temecula, CA, EE.UU.) a 4 ° C durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego incubadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con policlonal de cabra anti-ratón a 4 ° C durante 30 minutos. Para la tinción con OCT-4, las células se fijaron y permeabilizaron con kit Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, Ca, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células fueron incubadas con el ratón monoclonal IgG2b 03 de octubre-/4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca, EE.UU.) a 4 ° C durante 30 minutos, se lavó dos veces con PBS y se incubaron con ficoeritrina (PE) conjugado policlonal anti-humana de cabra anti-ratón a 4 ° C durante 30 minutos. El anticuerpo primario reconoce la isoforma OCT-4A de la proteína (aa 1-134).
La apoptosis se evaluó por la caspasa 3 ensayo. Las células se fijaron y se permeabilizaron con el kit Cytofix-Cytoperm (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células fueron incubadas con IgG de conejo monoclonal anti-caspasa activa 3 (BD Pharmingen) a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavó dos veces con PBS y luego incubadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con IgG policlonal de cabra anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology) a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Los datos se analizaron con el software Pro CELLQuest (Becton Dickinson Sistemas Immunocytometry, San Jose, CA, EE.UU.). Gating se llevó a cabo sobre la base de perfiles de tinción de control negativos.
inmunocitoquímica
ARO y KAT-4 líneas de células se sembraron en la cámara de diapositivas (Lab-Tek, Nunc, Naperville Inc., EE.UU.), permitió se unieran durante 48 horas y luego se usa para inmunocitoquímica. Las células se fijaron en 3% H
2O
2 en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente, después se lavaron dos veces en PBS, se bloquearon con 3% de BSA y se permeabilizaron con PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con el ratón CD133 anti-humano (IgG1, AC133 clon, Miltenyi Biotec) en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se enjuaga con PBS. La expresión se detectó usando anticuerpos biotinilados secundarias y estreptavidina /peroxidasa de rábano picante. Cromógeno 3-amino-9-etilcarbazol sustrato (AEC) y se utilizó diapositivas se counterstained con hematoxilina.
Clasificar de /CD133
pos células ARO
ARO células se trataron con tripsina y etiquetados con primaria CD133-biotina y biotina-microperlas (indirecto CD133 Kit de aislamiento de células, Miltenyi Biotec), según las instrucciones del fabricante. Después de la clasificación magnética, la pureza de células se evaluó por citometría de flujo utilizando ficoeritrina (PE) conjugado anti-humano CD133 /2 (clon 293C3, Miltenyi Biotec).
Aislamiento de RNA total, RT-PCR y QRT-PCR
El ARN total fue extraído y purificado a partir cultivaron KAT-4, KAT-18, FRO y ARO (sin clasificar, ordenadas CD133
neg y CD133
pos) líneas celulares utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milán, Italia), que incluye una etapa de digestión con DNasa I SET. la cantidad y la calidad del ARN se evaluaron por espectrofotometría de UV. 2 g ARN total fueron transcritas invertir en un volumen de 20 l con cebadores oligo dT (Applied Biosystems, Darmstad, Alemania) y StrataScript RT (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tiroglobulina (Tg), tiroperoxidasa (TPO), sodio /cotransportador de yoduro (NIS), fibronectina oncofetal (onfFN) y OCT-4 expresión se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [26] - [27]. 1 l se añadió ADN complementario a una reacción de 50 l que contiene 5 l de 10 x tampón de reacción, 50 mmol /l de MgCl
2, 1 l dNTPs, cebadores sentido y antisentido 50 pmol y 0,5 U de Taq ADN polimerasa oro. Las reacciones se llevaron a cabo a 95 ° C durante 10 minutos; 35 ciclos a 95 ° C durante 45 segundos, 55 ° C durante 45 segundos (cebador específico) y 72 ° C durante 45 segundos, seguido por una extensión a 72 ° C durante 7 minutos y la terminación a 4 ° C. secuencias de pareja de cebadores, ADNc tamaños de los fragmentos y las temperaturas de recocido fueron los siguientes: Tg (762 pb): 5'-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 'y 5'-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3' (55 ° C), TPO (593 pb): 5 ' TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 'y 5'-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3' (55 ° C), NIS (179 pb): 5'-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 'y 5'-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3' (57 ° C), onfFN (215 bp) : 5'-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 'y 5'-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3' (55 ° C), OCT-4 (456 pb): 5'-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 'y 5'-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3' (63 ° C) , β-actina (439 pb): 5'-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 'y 5'-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3' (55 ° C). Para el análisis de OCT-4, NTera2 ADNc (control positivo) fue proporcionado amablemente por el Dr. S. Liedtke, Universidad de Dusseldorf, Alemania. Para onfFN y TTF-1, TAD-2 cDNA se utilizó como control positivo. CD133 y TTF-1 de expresión se analizó por PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) en muestras individuales. Total de 2 g se utilizaron para medir los niveles de mRNA en relación con ß-actina expresión mRNA. cebadores y sondas de PCR fueron adquiridos de Qiagen (Quantitect Primer Prominin1 y TTF1). Todas las reacciones se realizaron en un volumen final de 20 l con la plantilla de ADNc de 2 l utilizando un LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). El análisis de datos se realizó con qBase del navegador que emplea un modelo de cuantificación relativa Δ-Ct con la corrección de la eficiencia de PCR y la normalización de referencia único gen (β-actina: 5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 'y 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3') [28] .
in vitro
cultura y Ensayo de proliferación celular de ARO /CD133
células pos
Después del aislamiento, ARO /CD133
pos y ARO /CD133
neg células se cultivaron inmediatamente en SFM suplementado con bFGF y EGF en una atmósfera de 5% de CO
2 a 37 ° C.
la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo colorimétrico utilizando 3- (4,5 -Dimethylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) y BrdU (colorimétrico) kit (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Para el ensayo MTT, según ARO /CD133
células de punto de venta y ARO /CD133
neg se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 SFM l /pocillo y se cultivaron hasta 72 horas. Las células se incubaron durante 4 horas a 37 ° C con MTT; Después de la incubación, se retiró el medio y las células se trataron con DMSO durante 5 minutos. La viabilidad se evaluó por el espectro de absorción UV a 550 nm con lector de microplacas modelo 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.).
Para el ensayo BrdU, clasificado ARO /CD133
pos y ARO /CD133
neg se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 l SFM /pocillo y se cultivaron hasta 144 horas. La viabilidad se evaluó por el espectro de absorción UV a 450 nm con lector de microplacas modelo 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.).
Auto-Renovación de ensayo de ARO /CD133
células pos
Ordenada ARO /CD133
pos células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB. expresión CD133 se detectó por citometría de flujo en los días 0, 4, 8 y 11. En la misma los puntos de tiempo apoptosis se evaluó por Kit Anexina V-FITC Apoptosis Detección (BD Pharmingen, San Diego, Ca, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
ensayo de formación de colonias de /CD133
pos células ARO
Ordenada ARO /CD133
pos y neg células ARO /CD133
se cultivaron en placas de 6 pocillos en SFM metilcelulosa (medio básico HSC-CFU, Miltenyi Biotec). Las placas se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora humidificada durante 2 semanas. El número de colonias se evaluó por recuento microscópico.
Agentes de quimioterapia
ARO /CD133
pos y neg células CD133
se cultivaron en SFM suplementado con bFGF (20 ng /ml ) y EGF (20 ng /ml) con o sin cisplatino (5, 10, 15 y 20 mM; Pharma, Austria), doxorrubicina (0,5, 1, 1,5 y 2 M; Ebewe Pharma, Austria), etopósido (10, 30 , 100 m; Teva Pharma, Holanda). El porcentaje de pos viable ARO /CD133
y células CD133 neg
se evaluó a los 24, 48 y 72 horas por ensayo MTT ya las 48, 96 y 120 horas de ensayo BrdU.
En la apoptosis evaluación, ARO /CD133
células de punto de venta y CD133
neg se cultivaron en placas de 6 pocillos y se trataron con la mayor concentración de cada fármaco (20 M cisplatino, 2 doxorrubicina M y 100 M etopósido) hasta 120 horas. Evaluación de la apoptosis (caspasa 3 de ensayo) se evaluó mediante citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS v. 11 el software para Windows. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones estadísticas se basan en pruebas no paramétricas y la significación estadística se definió en p & lt; 0,05. Para los experimentos con chemoterapics, las diferencias en la viabilidad de las líneas celulares ATC se calcularon con la prueba de Mann-Whitney; p para la tendencia con diferentes concentraciones de fármaco se calculó con la prueba W de Kendall.
Resultados
Identificación de CD133
pos células en líneas celulares ATC
Con el fin de identificar las células madre cancerosas en líneas celulares de ATC, se analizó la expresión de CD133 mediante citometría de flujo en ORA, KAT-4, KAT-18 y FRO (figura 1A). ARO y KAT-4 mostraron una positividad media de 64 ± 9% y el 57 ± 12%, respectivamente; KAT-18 y FRO fueron negativos. Los resultados fueron confirmados por qRT-PCR (Fig. 1B). CD133
pos células en líneas celulares ARO se caracterizaron por la localización citoplasmática y polarizada del antígeno en la superficie apical de las células (Fig. 1C). El estado indiferenciado de las líneas celulares de ATC se confirmó en la PCR por la presencia de onfFN [26] y la ausencia de-tirocito específicos marcadores diferenciadores Tg, TPO y NIS [27] (Fig. 2A y B).
(a) La citometría de flujo análisis de CD133 en ORA, KAT-4, KAT-18, y las líneas celulares FRO. Las líneas negras representan tinción positiva para CD133, líneas grises muestra de control negativo con un anticuerpo isotipo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) Análisis de la expresión de CD133 en líneas celulares de ATC por QRT-PCR. Los datos se representan como factor de cambio (escala relativa), teniendo en cuenta inmunocitoquímica KAT-18 = 1. (C) de CD133 en la línea celular ARO. Las flechas indican la localización apical y polarizado de CD133 (20 aumentos).
La expresión de genes específicos de la tiroides (Tg, TPO, NIS) (A) y el marcador fetal onfFN (B) en ORA, KAT- 4 y normal de la tiroides por RT-PCR. TAD-2 línea celular se utilizó como control positivo para onfFN mRNA. β-actina se utilizó como control interno en ambos experimentos. pb = pares de bases.
C
ell cultura de células clasificadas pos ARO /CD133
Cluster-eficacia de formación de ordenada ARO /CD133
células de punto de venta se evaluó mediante análisis FACS, mostrando 90% CD133 positividad (Fig. 3A). Después del aislamiento, ARO /CD133
pos células cultivadas en SFM, complementado con bFGF y EGF, crecieron como células esféricas, individuales, no adherentes. Al cabo de unos días, ARO /CD133
pos células comenzaron a formar grupos que aumentaron progresivamente en número y tamaño, aunque no forman folículos. Por el contrario, ARO /CD133
células neg apenas se agregan en grupos (Fig. 3B).
(A) La pureza de ARO /CD133
células pos después de clasificación celular magnética evaluó mediante citometría de flujo. (B) Características de los pos ordenada ARO /CD133
y ARO /CD133
neg en los días 0, 3 y 10 de la cultura. ARO /CD133
pos células formaron agrupaciones que se incrementaron en tamaño de las horas extraordinarias.
in vitro
ensayo de proliferación celular, la auto-renovación y la capacidad de formación de colonias de ARO /CD133
células pos
La proliferación se evaluó mediante MTT y el ensayo BrdU. ARO /CD133
pos células mostraron
in vitro
aumento de la proliferación en comparación con ARO /CD133
células neg con MTT tanto a las 48-72 horas y BrdU en 72-144 horas (p = 0,028 y p≤0.001, respectivamente) (Fig. 4A y B). En cuanto a la caspasa 3, citometría de flujo mostró la apoptosis espontánea en SFM, que varió después de 144 horas de 0,5 a 2% para /CD133
células pos ARO y desde 3.4 hasta el 8,8% para el /CD133
células neg ARO (datos no mostrado). Autorrenovación también se evaluó (Fig. 4C). la expresión de CD133 en ARO /CD133
células pos inicialmente se redujo de 90% en el día 0 al 46% en el día 8, y se mantiene un estado estable hasta el día 11. La disminución de CD133 horas extras expresión no fue causada por la muerte celular (& lt; 2%, los datos no mostrados). En lugar de ello, la proliferación celular continúa durante todo el período de cultivo, lo que sugiere que ARO /CD133
células de punto de venta se caracterizan por la capacidad de división asimétrica (es decir, la producción de dos células hijas, una CD133
pos y uno CD133
neg). ensayo de formación de colonias confirmó la alta capacidad de auto-renovación de ARO /CD133
pos, en comparación con ARO /CD133
células Neg. De hecho, ARO /CD133
células pos fueron capaces de formar un mayor número de colonias de tumor (p = 0,028) (Fig. 4D y 4E).
(A) ensayo de proliferación celular (MTT). La línea punteada representa ARO /CD133
células NEG, línea continua representa ARO /CD133
células de punto de venta. Los datos se expresan como valores medios ± SD y son representativos de cuatro experimentos independientes. p & lt; 0,03. (B) Ensayo de proliferación celular (BrdU). La línea punteada representa ARO /CD133
células NEG, línea continua representa ARO /CD133
células de punto de venta. Los datos se expresan como valores medios ± SD y son representativos de cuatro experimentos independientes. p≤0.001. (C) la capacidad de auto-renovación de ARO /CD133
células de punto de venta. línea de negro representa el número de ARO /CD133
células pos evaluados por citometría de flujo. La línea punteada representa la viabilidad celular evaluada por el ensayo MTT. (D) ensayo de formación de colonias en medio de metilcelulosa de pos ordenada ARO /CD133
y CD133
células neg (40 aumentos) (E) Número de colonias de ARO /CD133
pos y CD133
neg las células después de 15 días de incubación (p & lt; 0,03).
se evaluó de tratamiento de ARO /CD133
pos y CD133
células neg con medicamentos de quimioterapia
sensibilidad a los fármacos mediante el ensayo de MTT y BrdU. ARO /CD133
pos y las células NEG ARO /CD133
se incubaron con diferentes concentraciones de doxorrubicina, cisplatino y etopósido. ARO /CD133
pos células mostraron una notable resistencia a los medicamentos a los tres agentes en comparación con ARO /CD133
neg células durante todo el periodo de cultivo (p = 0.05 para el MTT y p≤0.001 para BrdU, respectivamente). Un experimento representativo después de 48 horas de cada tratamiento se muestra en la Fig. 5A-F. Consistentemente con estos resultados, la apoptosis evaluada por actividad de caspasa 3 mostró una activación dramático en ARO /CD133
neg en comparación con ARO /CD133
células de punto de venta en todos los puntos de tiempo analizados (Figura 6A, representativos de tres experimentos independientes con doxorrubicina ). Histogramas en el punto de tiempo de 72 horas se muestran en la Figura 6B. Se obtuvieron resultados similares con los otros fármacos utilizados (datos no mostrados).
(A) Análisis MTT después de 48 horas de cultivo en presencia de 0,5, 1, 1,5 y 2 M doxorrubicina (B) después de 48 horas en presencia de 5, 10, 15 y 20 cisplatino mu M (C) después de 48 horas en presencia de 10, 30 y 100 mM etopósido. Los datos se expresan como valores medios ± SD y son representativos de tres experimentos independientes (p≤0.05). (D) (E) (F) representan el análisis de BrdU en las mismas condiciones de A, B, C (p≤0.001). La línea punteada representa ARO /CD133
neg células y la línea continua representa ARO /CD133
células de punto de venta en todos los gráficos.
(A) actividad de caspasa 3 después del tratamiento con doxorubicina. La línea punteada representa ARO /CD133
células NEG, línea continua representa ARO /CD133
células de punto de venta. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (p≤0.001). 3 actividad (B) de la caspasa en el punto de tiempo de 72 horas con doxorrubicina. línea de negro representa una tinción positiva para la caspasa 3, línea gris muestra de control negativo con un anticuerpo isotipo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
in vitro
caracterización de ARO /CD133
células pos
Con el fin de caracterizar mejor el ARO /CD133
población pos, se evaluó la co-expresión de otros marcadores de células madre. La expresión del ARNm de factor de transcripción tiroideo-1 (TTF-1) en ORA /CD133
pos fue significativamente mayor que en /CD133
células neg ARO, similar a TAD-2 línea celular de tiroides fetal (control positivo) ( Fig. 7A). OCT-4 expresión fue de 91 ± 3% en /CD133
pos células ARO
vs página 5 ± 1,5% en ORA /CD133
neg, lo que sugiere las características de células madre pluripotentes de ARO /CD133
pos células (Figura 7B). Estos datos fueron confirmados por PCR semicuantitativa, usando la línea celular NTera2 como control positivo (Figura 7C). La cuantificación, expresado en relación a la densidad NTera2, mostraron niveles de OCT-4 mRNA en ARO /CD133
células neg casi dos veces más bajos que en /CD133
pos ARO (35%
vs
62%, respectivamente , con NTera2 = 100%)
(a) QRT-PCR de TTF-1 mRNA expresión en ARO /CD133
pos y neg células CD133
.; TAD-2 línea celular se utilizó como control positivo. (B) La citometría de flujo análisis de OCT-4A en CD133
ARO pos /neg ARO células y /CD133
. línea de negro representa tinción positiva para OCT-4A, línea gris muestra de control negativo con un anticuerpo isotipo. (C) RT-PCR semicuantitativa de la OCT-4 mRNA en CD133
pos /neg ARO y las células ARO /CD133
. β-actina se utilizó como control interno. línea celular NTera2 se utilizó como control positivo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes
El marcadores de células madre de la membrana c-Kit -. Expresado en CES (células madre embrionarias) - y Thy-1 - típicos de mesenquimales y células madre hematopoyéticas - fueron negativos (datos no mostrados).
Discusión
En los últimos años, varios estudios han sido publicados que apoya la hipótesis de que los tumores surgen a partir de poblaciones de células heterogéneas con diferentes propiedades biológicas. Recientemente, se ha sugerido que las células madre, que se caracteriza por auto-renovación y capacidad de diferenciación, pueden desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer [29], [30]. Desde múltiples mutaciones que ocurren durante muchos años son necesarios antes de una célula se vuelve cancerosa, las células con una larga vida útil del tallo pueden ser los mejores candidatos para la acumulación de tales células heterogéneos inductores de cáncer [5], [31]. Sin embargo, no está claro todavía si estas células madre cancerosas se originan de desdiferenciación de células maduras dentro de los órganos o de células madre residentes que adquieren progresivamente un fenotipo maligno [32].
ATC es uno de los sistemas endocrino más agresivo tumores caracterizados por alto grado de desdiferenciación [1]. La existencia de células madre residentes tiroides puede explicar tanto la proliferación sostenida y la heterogeneidad de las lesiones ATC [4]. Takano et al. la hipótesis de que una estrecha relación entre las células madre y la carcinogénesis podría existir en ATC [17], [26], [33]. ATC perfil de expresión génica sugiere al menos tres tipos de células indiferenciadas como su origen: las células madre de la tiroides, que expresan ARNm onfFN pero no Tg, con alto potencial de diferenciación, la auto-renovación y la capacidad de generar los carcinomas anaplásicos; thyroblasts, que expresan tanto Tg y el ARNm onfFN y los folículos que no forman; prothyrocytes, que son más diferenciada que thyroblasts, que expresan Tg pero no onfFN mRNA, con la capacidad de formar folículos. Mitsutake et al. han identificado una población muy pequeña lateral (SP), muy enriquecido para las células madre, en varias líneas celulares de cáncer de tiroides humana. Sin embargo, tanto SP
POS y SP
poblaciones neg formaron tumores cuando son trasplantadas en ratones desnudos, lo que demuestra que las células madre del cáncer-como no son exclusivos o idénticas a las células SP [16].
En el presente estudio, nosotros mantenemos que el ATC puede originarse a partir de células madre de la tiroides. Describimos CD133
pos células con características fenotípicas de las células madre, que crecen sin la formación de folículos. Sin embargo, entre las cuatro líneas celulares analizadas, sólo el ARO y KAT-4 mostraron alto porcentaje de CD133
células de punto de venta (64 ± 9% y el 57 ± 12%, respectivamente; Fig. 1A). Nuestros resultados son consistentes con las observaciones recientes sobre líneas celulares de hepatoma altamente agresivos, también se caracteriza por muy alto porcentaje de CD133
pos células [34]. La expresión de alto CD133 en el ATC podría ser, por tanto, asociado con la agresividad del tumor. Sin embargo, la ausencia de este marcador en KAT-18 y las líneas celulares de aquí para allá, sugiere que la mera presencia de CD133 no es suficiente y todavía tienen que ser identificados otros marcadores. Además, según lo informado por Takano et al. [17], se encontró que ARO y KAT-4 líneas celulares expresaron onfFN pero no Tg, TPO y NIS, lo que confirma su estado indiferenciado.
Para caracterizar mejor las características funcionales y fenotípicas de estas células madre cancerosas putativas en el ATC, estudiamos ordenados ARO /CD133
células de punto de venta. ARO /CD133
pos células mostraron una mayor tasa de proliferación celular en comparación con CD133
neg células (Fig. 4A y B). Además, la capacidad de auto-renovación de ARO /CD133
células de punto de venta fue confirmada por disminución de CD133 expresión paralelo para aumentar en la proliferación celular, lo que sugiere la división asimétrica, es decir, la producción de CD133
pos y CD133
hija neg Células. Sin embargo, no se pueden excluir otros mecanismos de división asimétrica (por ejemplo CD133 post-transcripcional baja regulación). porcentajes mínimos de muerte celular excluyen que la disminución en la expresión de CD133 se debió a la apoptosis (& lt; 2%).
La confirmación adicional de que la mayoría de las células de punto de venta ARO /CD133
pueden ser células madre /progenitoras proviene de análisis de la expresión de otros genes relacionados con "stemness". Aunque el marcadores de células madre de c-Kit y Thy-1 fueron negativos, se observó una positividad fuerte para OCT-4. OCT-4 pertenece a la familia POU (Pit-Oct-UNC) de factores de transcripción que media en la pluripotencia en CES a través de la inhibición de la específica de tejido y la promoción de los genes de células madre [22], [23]. ARO /CD133
pos ordenados células fueron fuertemente positivas para OCT-4A en comparación con ARO /CD133
células NEG, y su expresión fue similar a la de NTera2 línea celular teratoma embrionario. Los cebadores y el anticuerpo monoclonal usado en nuestros experimentos para la variante de corte y empalme nuclear OCT-4A excluyen cualquier contaminación pseudogene o artefactos [24].
La tiroides nuclear factor de transcripción específico TTF-1 es una proteína que contiene homeodominio-perteneciente a la clase Nkx-2 de genes homeobox, que se requiere para el desarrollo adecuado de la tiroides y se utiliza como un marcador de la tiroides y carcinoma de pulmón [35]. TTF-1 se encontró expresión significativamente mayor en CD133
pos /ARO que en ARO /CD133
células NEG, con niveles de mRNA comparables a TAD-2 línea celular de tiroides fetal (control positivo). Esto implica que, si bien todas las líneas celulares ATC se Dediferenciado (expresión ausente de los genes-tiroideos específicos tales como Tg, TPO y NIS y positividad para onfFN), en ORA /CD133
poscells un marcador de organogénesis tiroides todavía se mantiene.
Además, con el fin de caracterizar funcionalmente estas células madre, como el cáncer putativo, se ensayó la sensibilidad a los medicamentos de quimioterapia más comunes utilizados en el ATC, es decir, cisplatino, doxorrubicina y etopósido. El cisplatino se reticula de ADN de varias maneras diferentes que interfieren con la división celular por mitosis, doxorrubicina interactúa con el ADN por intercalación y la inhibición de la biosíntesis macromolecular y etopósido inhibe la enzima topoisomerasa II [36] - [38]. ARO /CD133
células pos revelaron una resistencia significativa a todos los fármacos utilizados en cada punto de tiempo en comparación con ARO /CD133
células NEG, como se demuestra por los niveles de apoptosis marcadamente más bajas detectadas a través de la caspasa 3 (Fig. 6). El potencial inducción de moléculas anti-apoptóticas en lugar de apoptosis, o el bloqueo de tirocito mecanismos de regulación celular de rotación fisiológicas, demostrado en otras enfermedades de la tiroides, tales como la tiroiditis autoinmune [39], podrían explicar la capacidad adquirida de las células madre similares a la tiroides a ser resistentes a la quimioterapia. [43].