Extracto
Los prometedores resultados de linfoma anaplásico de quinasa inhibidores (ALK) han cambiado el significado de las fusiones de ALK en varios tipos de cáncer. Estas fusiones ya no son mera objetivos de investigación o marcadores de diagnóstico, pero que ahora están directamente relacionados con el beneficio terapéutico de los pacientes. Sin embargo, la mayoría de los tejidos tumorales disponibles en entornos clínicos son fijados con formalina y embebido en parafina (FFPE), y esto limita considerablemente los estudios genéticos detallados en muchos casos clínicos. A pesar de las mejoras técnicas recientes han permitido el análisis de algunas mutaciones conocidas en los tejidos FFPE, la identificación de genes de fusión desconocidos utilizando sólo tejidos FFPE sigue siendo difícil. Hemos desarrollado un 5'-rápida amplificación de cDNA sistema optimizado para tejidos FFPE extremos basados en este sistema y se evaluó en un tejido de cáncer de pulmón con
ALK
reordenamiento y sin las fusiones 2 ALK conocidos EML4-ALK y KIF5B-ALK . Con este sistema, se identificaron con éxito una novela de fusión ALK, KLC1-ALK. El resultado fue confirmado por reacción inversa en cadena de la polimerasa y la fluorescencia
In situ
hibridación. A continuación, se sintetizó el de larga duración ADNc putativo de
KLC1-ALK Opiniones y demostramos el potencial transformador de la quinasa de fusión con ensayos usando células 3T3 de ratón. A lo mejor de nuestro conocimiento, KLC1-ALK es la primera fusión oncogénica novedoso identificado utilizando sólo tejidos FFPE. Este hallazgo ampliará el valor potencial de los tejidos FFPE de archivo y proporcionar más conocimientos biológicos y clínicos en cáncer de pulmón ALK-positivo
Visto:. Togashi Y, Soda M, Sakata S, E Sugawara, Hatano S, R Asaka , et al. (2012) KLC1-ALK: A Novel Fusion en el cáncer de pulmón identificados utilizando un tejido incluidas en parafina fijado en formol Sólo. PLoS ONE 7 (2): e31323. doi: 10.1371 /journal.pone.0031323
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 17 de octubre de 2011; Aceptado: January 5, 2012; Publicado: 8 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Togashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, así como por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia; el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón; el competir con del vehículo conmemorativo Fundación de Japón; Cancer Research Fund Takamatsu princesa; y la Fundación Uehara Memorial. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cinasa del linfoma anaplásico (ALK) es un receptor tirosina quinasa, que fue descubierto en el linfoma anaplásico de células grandes (LACG) en forma de una proteína de fusión, NPM-ALK [1], [2]. La formación de una proteína de fusión con una pareja a través de translocaciones cromosómicas es el mecanismo más común de ALK sobreexpresión y activación del dominio quinasa de ALK. prometedores resultados recientes de ensayos clínicos con un inhibidor de ALK, crizotinib, han cambiado el significado de fusiones de ALK en el cáncer de pulmón [3], [4], [5], [6], tumores miofibroblásticos inflamatorios (MITs) [7], y LACG [8]. ALK fusiones ya no son blancos mera investigación o marcadores de diagnóstico y están directamente relacionados con el beneficio terapéutico de los pacientes.
En el cáncer de pulmón, 3 parejas de fusión de ALK han sido reportados-EML4, TFG, y KIF5B -aunque la presencia de TFG-ALK en el cáncer de pulmón todavía no se ha demostrado con la evidencia histopatológica [9], [10], [11]. Además del cáncer de pulmón, ALK ha encontrado además para generar fusiones en LACG (fusionados a NPM, TPM3, TPM4, ATIC, TFG, CLTC, MSN, MYH9, o ALO17) [1], [2], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], IMT (TPM3, TPM4, CLTC, CARS, RanBP2, ATIC, o SEC31A) [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], el linfoma de células B grandes ALK-positivo (CLTC, la NGP, SEC31A, o SQSTM1) [25], [26], [27], [ ,,,0],28], y el cáncer renal (VCL, TPM3 o EML4) (Tabla 1) [29], [30]. Además de TFG-ALK en el cáncer de pulmón, algunas fusiones ALK se han reportado sin evidencia histopatológica:. TPM4-ALK en el carcinoma de células escamosas de esófago [31], [32] y EML4-ALK en los carcinomas de colon y de mama [33]
anti-ALK inmunohistoquímica jugó un papel importante en la identificación de estas parejas de fusión ALK. Varios fusiones ALK exhiben un patrón de tinción característico en anti-ALK inmunohistoquímica porque la localización subcelular de proteínas de fusión de ALK depende de la pareja de fusión. Por ejemplo, NPM-ALK, que es la fusión más común en ALK-positivo LACG (85%), exhibe un patrón de tinción nuclear y citoplasmática porque el heterodímero de NPM y NPM-ALK se localiza en el núcleo y el homodímero de NPM-ALK en el citoplasma; CLTC-ALK muestra un patrón granular citoplasmática porque se localiza en las vesículas pequeñas. Si un tumor presenta un patrón de tinción anti-ALK no reconocido, el paciente puede tener una pareja de fusión novela. Además de la diferencia en la localización subcelular, la diferencia en intensidad de la tinción es una clave para la identificación de nuevos socios. EML4-ALK apenas se tiñeron por inmunohistoquímica convencional anti-ALK [11], [34]. Para superar esta limitación, hemos desarrollado el método de intercalado de polímero de anticuerpos mejorada (IAEP), lo que aumenta la sensibilidad moderada en el sistema de detección inmunohistoquímica, y EML4-ALK estaba manchada consistente con este método [11]. Esto indicó que un tumor que se inmunotiñó positivamente para ALK solamente por un método de inmunohistoquímica sensible pero no por métodos convencionales puede albergar una novela de fusión ALK. Sobre la base de esta hipótesis, se identificaron con éxito PPFIBP1-ALK en 2 casos IMT que dieron positivo en inmunohistoquímica anti-ALK sólo cuando manchado por el método IAEP [35].
Anti-ALK inmunohistoquímica puede por lo tanto ser útil para detectar tumores candidatos para una novela de fusión ALK. Sin embargo, para identificar la pareja de fusión, por lo general se requieren otras técnicas moleculares, tales como 5'-amplificación rápida de extremos de ADNc (5 'RACE) o reacción en cadena de la polimerasa inversa de transcripción inversa (RT-PCR). A lo mejor de nuestro conocimiento, no hay fusiones oncogénicos nuevos han sido descubiertos usando (FFPE) los tejidos fijados en formalina embebidos en parafina sólo porque los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE están severamente degradados durante el proceso de fijación. En el presente estudio, hemos desarrollado un método 5'-RACE optimizado para
ALK sobre Fusion detección socio que era aplicable a los tejidos FFPE y se identificó una novela de fusión, kinesin cadena ligera 1 (KLC1) Alq, en el cáncer de pulmón utilizando sólo un tejido FFPE.
Métodos
Materiales
un bloque de tejido FFPE de adenocarcinoma pulmonar in situ, no mucinoso (anteriormente llamado carcinoma bronquioloalveolar) [36], que fue extirpados de un paciente femenino de 47 años de edad, se utilizó [37]. Este carcinoma fue negativo para EML4-ALK y KIF5B-ALK, aunque la presencia de
ALK
reordenamiento fue confirmada por anti-ALK IAEP inmunohistoquímica y una fluorescencia de división de hibridación in situ (FISH) de ensayo para ALK (en adelante como la ALK desconocido caso de fusión-positivo) (Figura 1) [37]. También se emplearon dos bloques de tejido FFPE de casos de tumores ALK-positivos, para el que ya se había confirmado la presencia de EML4-ALK o KIF5B-ALK. El ARN total se extrajo de cada tejido FFPE con el uso de el kit de aislamiento RecoverAll ™ total de ácido nucleico para FFPE (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japón). Las edades de los 3 FFPE bloques utilizados (tiempo desde la producción de tejidos FFPE para la extracción de RNA) fueron 65, 40 y 51 meses para el caso de fusión ALK-positivo desconocida, EML4-ALK, y KIF5B-ALK, respectivamente. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. El estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional del Centro del Cáncer de Shizuoka (ID aprobación de 22 J132-22-1) y la Fundación Japonesa para la Investigación del Cáncer (ID aprobación 2010-1011)
.
El panel A muestra la resultados de inmunohistoquímica anti-ALK con el método IAEP en adenocarcinoma pulmonar in situ, no mucinoso. El patrón de tinción fue difusa citoplasmática. El lado basal de las células tumorales era más fuertemente manchadas, indicando una localización subcelular de la proteína desigual KLC1-ALK. Los análisis de FISH reveló que este caso fue positivo en el ensayo dividida por
ALK gratis (Panel B: se observan extremos 5 'y 3' señales individuales) y negativo en
EML4-ALK
y
KIF5B-ALK
ensayos de fusión (Panel C:
EML4
, rojo;
ALK
, verde; Panel D:
KIF5B
, verde;
ALK
, rojo).
Modificado 5'-RACE para fusiones ALK aplicables a los tejidos FFPE
5'-RACE se realizó con el SMARTer RACE kit de amplificación de ADNc (Clontech ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. En breve, en lugar de los cebadores incluidos en el kit, ALK-3242R (5 'CTCAGCTTGTACTCAGGGC-3') se utilizó para la síntesis de cDNA. El ADNc se sometió a 5'-RACE PCR usando Primestar SA ADN polimerasa (Takara) y los siguientes cebadores: Universal Primer A Mix del kit y ALK-3206R (5 'ATGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTT-3'). La condición de la PCR consistió en 5 ciclos a 94 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 3 min; 5 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 70 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 3 min; y 30 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 3 min.
Fish &
FISH análisis de los genes de fusión se realizó con sondas de ADN para KLC1 y ALK. secciones no teñidas (4-m de espesor) fueron sometidos a hibridación con una sonda conjunto ALK-split (Dako, Tokio, Japón) o con cromosomas artificiales (BAC) sondas bacterianas clones derivados de ALK (RP11-984I21 y RP11-62B19) y KLC1 (RP11-186F6). hibridizada diapositivas fueron teñidas con DAPI y examinarlos en el microscopio de fluorescencia BX51 (Olympus, Tokio, Japón).
Síntesis del ADNc putativo de
KLC1-ALK
Dos PCRs independientes se realizaron utilizando ADNc sintetizados a partir de un tejido tumoral que expresa KIF5B-ALK con los siguientes conjuntos de cebadores: KLC1-NheI-M (5'-GCGCTAGCGAATGTATGACAACATGTCCAC-3 ') y KLC1-BPR (5'-GTGCTTCCGGCGGTACACATCTACAGAACCAAACTC-3'), y ALK-BPF (5'-GGGAGTTTGGTTCTGTAGATGTGTACCGCCGGAAGC-3 ') y ALK-EcoRI (5'-GATAGAATTCTCAGGGCCCAGGCT-3'). A continuación, la segunda PCR se realizó utilizando una dilución 1/100 de una mezcla de los primeros productos de PCR como molde con los cebadores KLC1-NheI-M y ALK-EcoRI (Figura 2).
Dos primera PCR redondas se realizaron por separado usando ADNc sintetizado a partir de un tejido tumoral que expresa KIF5B-ALK con los siguientes conjuntos de cebadores: KLC1-NheI-M y KLC1-BPR, y ALK-BPF y ALK-EcoRI. KLC1-BPR y ALK-BPF tenían secuencias aguas abajo del punto de ruptura ALK (exón 20) y aguas arriba del punto de ruptura KLC1 (exón 9) como las secuencias de adoptantes, respectivamente. A continuación, la segunda PCR se realizó utilizando una dilución 1/100 de la mezcla de los primeros productos de la PCR como plantilla con los cebadores KLC1-NheI-M y ALK-EcoRI. Los primeros productos de la PCR fueron recocidos, extendida entre sí, y luego se amplificaron con los cebadores.
ensayo de transformación de
KLC1-ALK
Análisis de los transformadores actividad de fusiones de quinasa se realizó como se describe anteriormente [9], [38], [39]. Un plásmido de expresión basado en pMXS para cada fusión se utilizó para generar retrovirus ecotrópicos recombinantes [40], que luego se utilizaron individualmente para infectar fibroblastos 3T3 de ratón. Se evaluó la formación de focos transformados después de cultivar las células durante 4 días. Se inyectó el mismo conjunto de células 3T3 vía subcutánea en ratones nu nu /, y la formación de tumores se examinó después de 14 días. Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica Jichi (ID aprobación 1135).
Resultados
Identificación de
KLC1-ALK
como una novela
gen de fusión ALK
Nuestros modificados 5'-RACE fielmente aislados fragmentos de cDNA para
EML4-ALK
o
KIF5B-ALK en venta tumores positivos para ALK conocidos (suplementario Figura S1 A y B). Posteriormente, se trató de aislar fragmentos de ADNc que abarcan los puntos de fusión desde el caso desconocida fusión ALK-positivo. La secuenciación de nucleótidos de tales productos 5 'RACE-reveló que 2 de 10 clones contenían el extremo 3' del exón 9 de
KLC1
(ENST00000348520) fusionado con el primer nucleótido del exón 20 de
ALK
(ENST00000389048), lo que indica la presencia de una nueva fusión entre
KLC1
y
ALK
. Como este reordenamiento constituía una fusión en marco entre los 2 genes, el de larga duración
KLC1-ALK
cDNA probablemente produce una proteína de 984 aminoácidos que contiene un amino-terminal dos tercios de KLC1 y una región intracelular de ALK (Figura 3A). aislamiento mediada por RT-PCR de un punto de fusión confirmó con éxito la fusión en marco entre las 2 mensajes (Figura 3A y B). Además, para confirmar la reordenación genómica responsable de la fusión, se realizó un ensayo de FISH de fusión (Figura 3C). Estos resultados fueron consistentes con la presencia de t (2; 14) (p23; q32.3), lo que lleva a la generación de
KLC1-ALK
Panel A muestra la estructura esquemática de. KLC1, ALK y KLC1-ALK proteínas y la secuencia de ADNc alrededor del punto de fusión. azul oscuro, naranja y rojo representan partes espiral de la bobina, transmembrana y dominios quinasa, respectivamente. Los exones de quiebre y el número de los aminoácidos se indican. KLC1-ALK-específica RT-PCR usando ARN extraído de los tejidos FFPE del caso ALK fusión-positivo desconocido amplificó un fragmento del tamaño del producto esperado (140 pb, Panel B) con la secuencia de fusión consistente (Panel A). Una prueba FISH fusión de
KLC1-ALK
reveló una señal de fusión (amarillo) en múltiples células tumorales (grupo C). M, marcador (escalera de 100 pb); S, la muestra (el caso de fusión-positivo ALK desconocido); N, control sin molde.
Transformar el potencial de
KLC1-ALK
La larga duración ADNc putativo de
KLC1-ALK fue
sintetizado a partir de los tejidos congelados con la expresión de fusión KIF5B-ALK (Figura 2, Figura suplementaria S2), y se utilizó para generar un retrovirus recombinante que expresa la proteína de fusión con una etiqueta de epítopo FLAG amino-terminal. La infección de células 3T3 con el virus que expresa KLC1-ALK múltiple se producen fácilmente focos transformados en la cultura y tumores subcutáneos en un ensayo de tumorigenicidad ratón desnudo (Figura 4), lo que confirma la capacidad de transformación potente de KLC1-ALK.
Paneles superiores : fibroblastos de ratón 3T3 fueron infectadas con el retrovirus que codifican KLC1-ALK o EML4-ALK o con el virus de vacío correspondiente (Mock). Las células se fotografiaron después de 4 días de cultivo. Barra de escala, 1 mm. paneles inferiores: Los ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con las células 3T3 correspondientes, y la formación de tumores se examinó después de 14 días. El número de tumores formados por las inyecciones se indica en la parte inferior.
Discusión
A continuación, al analizar solamente los tejidos FFPE, descubrimos con éxito una novela de fusión ALK, KLC1-ALK. Si bien se congelaron los materiales incluidos en la muestra a partir de muestras de biopsia o extirpado quirúrgicamente se pueden utilizar para diversos tipos de análisis moleculares, que no se toman muestras de forma rutinaria en la mayoría de los entornos clínicos. Por el contrario, las muestras FFPE por lo general se producen, y los archivos de histopatología de diagnóstico son una cantidad extremadamente grande de recursos de los tejidos FFPE en los laboratorios de diagnóstico de patología común. Sin embargo, el ADN y el ARN extraído de tejidos FFPE son severamente degradada durante la fijación con formalina y por lo general no son adecuados para ensayos que necesitan mucho tiempo de ADN /ARN de alta calidad. Los recientes avances técnicos han permitido que algunos análisis de mutaciones puntuales conocidas y genes de fusión conocidas, pero todavía es difícil identificar una aberración gen no reconocido utilizando sólo un tejido FFPE.
más ALK
fusiones, el punto de
ALK
ruptura está situado dentro del intrón 19, y el punto de fusión en el ARNm es típicamente el primer nucleótido del exón 20. por lo tanto, si los cebadores para la 5'-RACE se colocan inmediatamente aguas abajo del primer nucleótido de
ALK
exón 20, tal 5'-RACE puede aislar con éxito productos de PCR que contienen la secuencia del gen socio aún utilizando tejidos FFPE. Sobre la base de esta hipótesis, hemos establecido un sistema de 5'-RACE de
ALK
fusiones optimizados para tejidos FFPE. Con este sistema, hemos identificado un nuevo
ALK sobre Fusion,
KLC1-ALK
. A lo mejor de nuestro conocimiento, esta es la primera novela de fusión oncogénica identificado utilizando sólo un tejido FFPE.
Precaución, sin embargo, es necesaria. En algunos casos raros con
ALK
de fusión, el punto de ruptura
ALK sobre Fusion ARNm no puede estar en el extremo 5 'del exón 20. Por ejemplo, en la variante 4 de
EML4-ALK
, el exón 14 de
EML4
se fusiona a una secuencia desconocida de 11 pb, que a su vez está conectado al nucleótido 50 de
ALK
exón 20 (E14; ins11; del49A20) [38]. Nuestro sistema de 5'-RACE no funcionaría en este caso, debido a que el cebador inverso ALK-3206R corresponde a los nucleótidos 12-34 de
ALK
exón 20. Por lo tanto, si nuestro modificada 5'-RACE no consigue aislar la fusión cDNAs de los casos con un reordenamiento de ALK confirmado, otros ajustes de imprimación se puede intentar.
kinesin es un heterotetrámero de 2 kinesin cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras quinesina, y se mueve sobre los microtúbulos hacia su plus termina llevando varios cargamentos . Las cadenas pesadas puerto de la actividad motora, mientras que las cadenas ligeras juegan un papel en la unión de la carga y en la modulación de la actividad y la localización subcelular de las cadenas pesadas. KLC1 se une a los kinesin cadenas pesadas con un dominio N-terminal y a diversas cargas a través de los dominios de repetición tetratricopeptide [41], [42]. De los 3 histopatológicamente confirmado parejas de fusión de ALK en el cáncer de pulmón, EML4 colocaliza con los microtúbulos y puede contribuir a la estabilización de los microtúbulos [43], KIF5B mueve sobre los microtúbulos como una cadena pesada kinesin [44], y KLC1 une a kinesin cadenas pesadas como una cadena ligera de quinesina. Por lo tanto, es interesante que todos los 3 fusiones ALK en el cáncer de pulmón es probable que colocalize con los microtúbulos.
La fusión ALK más frecuente en el cáncer de pulmón es EML4-ALK (4-7%) [9], [ ,,,0],38], y la segunda es KIF5B-ALK (0,5%) [11]. Un caso con TFG-ALK se informó [10]. KLC1-ALK puede ser poco frecuente, pero existe en el adenocarcinoma de pulmón, y los pacientes con esta fusión son altamente susceptibles de beneficiarse de la terapia de inhibidor de ALK igual que los pacientes con otras fusiones ALK. La incidencia puede ser baja, pero la importancia de esta fusión es muy alta desde la perspectiva de una opción terapéutica hecha a medida para el paciente. Otro punto importante es que KLC1-ALK se encontró en el adenocarcinoma in situ, no mucinoso (anteriormente llamado carcinoma bronquioloalveolar, BAC). BAC es reconocido a albergar raramente fusiones ALK, aunque un pequeño número de casos de BAC se ha examinado para la fusión de ALK en comparación con adenocarcinoma invasivo. Sería interesante desde una perspectiva patobiológico para examinar una cohorte a gran escala de BAC y otras condiciones premalignas para la fusión ALK
Hay 3 métodos para la detección de ALK: fusiones. RT-PCR, FISH ALK dividido, y de alta sensibilidad inmunohistoquímica anti-ALK. Por RT-PCR, el "gen 5 socio debe ser conocida. Nuestros resultados en este estudio identificó un gen más pareja que debe ser dirigido a la detección de ALK-fusión mediante RT-PCR en el cáncer de pulmón. Los otros 2 métodos pueden detectar todas las fusiones de ALK independientemente de pareja de fusión y, por lo tanto, son adecuados para el cribado de ALK-fusión. En otras palabras, estos 2 métodos no pueden identificar la pareja de fusión y necesitan ser logrado por-socio específico RT-PCR y /o FISH fusión para este propósito. Si se revela que el gen de la pareja en el caso probado es desconocido, un nuevo gen socio es altamente probable que se descubran, como se muestra en el presente estudio. De hecho, utilizando alta sensibilidad anti-ALK inmunohistoquímica (método IAEP) como la detección, se han identificado varias nuevas fusiones de ALK en varios tipos de cánceres, incluyendo adenocarcinoma de pulmón [11], linfoma [28], sarcoma [35], y de células renales el carcinoma [30].
Muchas herramientas eficientes se han establecido para la detección de los casos de fusión ALK-positivo utilizando tejidos FFPE, incluyendo anti-ALK inmunohistoquímica y FISH. Nuestros resultados se expandirán aún más el valor potencial de los tejidos FFPE de archivo y proporcionar más conocimientos biológicos y clínicos en cáncer de ALK-positivo en la próxima era de la terapia con inhibidores de ALK.
Apoyo a la Información
Figura S1. productos
5'-RACE utilizando tejidos FFPE. Nuestra modificado 5'-RACE aislado fielmente fragmentos de cDNA para
EML4-ALK gratis (A) o
KIF5B-ALK gratis (B) de tumores positivos para ALK conocidos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031323.s001 gratis (TIF)
figura S2. secuencia de ADNc de putativos
KLC1-ALK. El supuesto ADNc de longitud completa de
KLC1-ALK
fue sintetizado a partir del tejido congelado con la expresión de la fusión ALK-KIF5B
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031323.s002 gratis (PDF)
Reconocimientos
agradecemos al Sr. Motoyoshi Iwakoshi, Sra. Keiko Shiozawa, la Sra Tomoyo Kakita, y la Sra Kimie Nomura por su asistencia técnica, y la Sra Sayuri Sengoku para proporcionar asistencia administrativa.