Extracto
El cáncer de próstata (CaP) metástasis óseas se han creído durante mucho tiempo que los osteoblastos debido a un hueso la remodelación que conduce a la formación de hueso nuevo. Sin embargo, estudios recientes han demostrado una mayor actividad osteolítica en las etapas iniciales de la metástasis ósea CaP, lo que sugiere que la orientación tanto osteolíticas y osteoblásticas mediadores probablemente inhibir la remodelación ósea y la metástasis ósea CaP. En este estudio, se encontró que las células de CaP podrían estimular la diferenciación de los osteoclastos y los osteoblastos a través de la regulación de RANKL, RUNX2 y la osteopontina, la promoción de la remodelación ósea. Curiosamente, se encontró que los formulados de isoflavonas y 3,3'-diindolylmethane (BR-DIM) fueron capaces de inhibir la diferenciación de los osteoclastos y los osteoblastos a través de la inhibición de la transducción de la señal celular en RANKL, osteoblástica, y la señalización celular CaP. Por otra parte, se encontró que isoflavona y BR-DIM regulados hacia abajo la expresión de miR-92a, que se sabe están asociados con la señalización de RANKL, EMT y la progresión del cáncer. Por vía y análisis de redes, también observamos los efectos reguladores de isoflavona y BR-DIM en múltiples vías de señalización tales como AR /PSA, Nkx3-1 /Akt /p27, MITF, etc. Por lo tanto, isoflavonas y BR-DIM con sus múltiples -targeted efectos podrían ser útiles para la prevención de la progresión del CaP, especialmente mediante la atenuación de los mecanismos de la metástasis ósea
Visto:. Li Y, D Kong, Ahmad a, B Bao, Sarkar FH (2012) Orientación de la remodelación ósea por isoflavona y 3,3-diindolilmetano en el contexto del cáncer de próstata metástasis en los huesos. PLoS ONE 7 (3): e33011. doi: 10.1371 /journal.pone.0033011
Editor: Muzaffer Cicek, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 21, 2011; Aceptado: February 2, 2012; Publicado: 7 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud (5R01CA083695, 5R01CA108535, 5R01CA132794, y 5R01CA131151 adjudicado a FHS). Los autores agradecen a Puschelberg Guido y fundaciones por su generosa contribución financiera. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Autor Fazlul Sarkar y co-autor Aamir Ahmad son PLoS ONE miembros del Consejo Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es un cáncer común y la segunda causa principal de cáncer relacionados se espera que las muertes en hombres en los Estados Unidos con un estimado de 241,740 nuevos casos y 28.170 muertes en 2012 [1]. La alta tasa de mortalidad de CaP se debe principalmente al desarrollo de la metástasis. CaP exhibe habitualmente sus características progresivas a través de las cascadas de la dependencia de andrógenos para castrar la resistencia con la eventual metástasis. A pesar de que la PCa puede considerarse localizado en la próstata, todavía hay una incidencia 15% a 20% de la metástasis posterior [2]. Se ha informado de que el 35% de los pacientes con CaP desarrollar metástasis hematogeneous y que la metástasis ósea del CP es la más frecuente (~ 90%) entre las metástasis hematogeneous [3]. metástasis óseas CaP se han creído durante mucho tiempo para ser osteoblástica debido a la formación de hueso nuevo. Por lo tanto, moléculas dirigidas osteoblásticas como la endotelina-1, la señalización de BMP, y Wnt se ha considerado como estrategias para la inhibición de la metástasis ósea CaP [2]. Sin embargo, estudios recientes encontraron una mayor actividad osteolítica en las etapas iniciales de la metástasis ósea CaP [4], [5]. Se encontraron varios factores de crecimiento para ser liberado de la matriz del hueso durante la degradación cuando células de CaP metástasis en el hueso. Por otra parte, las células cancerosas podrían extenderse al hueso y utilizar la maquinaria de citocinas locales para estimular la osteoclastogénesis, lo que resulta en el crecimiento de la resorción ósea y de células de cáncer [6]. Estos hallazgos sugieren que la remodelación ósea incluyendo procesos osteolíticas y osteoblásticas se produce durante la metástasis ósea CaP y, a su vez, favorece el crecimiento de las células de CaP en el hueso de nueva formación. Por lo tanto, la orientación molecular de ambos osteolíticas y osteoblásticas mediadores probablemente inhibir la remodelación ósea, lo que podría ser una estrategia terapéutica nueva para la inhibición de la metástasis ósea CaP.
Para inhibir proceso osteolítica, varias estrategias se han desarrollado, incluyendo el uso de los bifosfonatos y la orientación de los reguladores biológicos de la osteoclastogénesis, tales como osteoprotegerina (OPG), el receptor activador del factor nuclear-kB (RANK) y el activador del receptor del ligando del factor nuclear-kB (RANKL). La maquinaria de citoquinas más importante, que está implicada en la remodelación ósea y la metástasis ósea del CP, es OPG /RANK /RANKL señalización [7], [8]. RANKL se expresa por los osteoblastos, y es necesaria y suficiente para la osteoclastogénesis [9]. RANKL se une a su receptor RANK que está presente en la superficie de los precursores de osteoclastos, induciendo la formación de osteoclastos y la activación [9], [10]. Los estudios han demostrado que las células RAW264.7, uno de los macrófagos precursoras de osteoclastos, podría diferenciar a los osteoclastos cuando se cultiva en presencia de RANKL [10]. Las características principales de los osteoclastos incluyen la capacidad para absorber el hueso, para expresar fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), y para expresar proteasas incluyendo metaloproteinasas de la matriz (MMPs) que favorecen la invasión del cáncer y la metástasis [10], [11]. Es importante destacar que la expresión de RANKL también se ha encontrado en algunas células cancerosas, así como en células T activadas [6], [11], [12]. Por lo tanto, la señalización de RANKL se ha creído que ser una diana terapéutica para la inhibición de la remodelación ósea y la metástasis ósea [13].
Además, varias moléculas incluyendo endotelina-1, BMP, y Wnt han sido creído como el importante reguladores de la diferenciación de osteoblastos y la formación de hueso [2], [14] - [16]. Los estudios histológicos han demostrado que las lesiones osteoblásticas de la metástasis ósea CaP se caracterizan por la deposición de nuevos huesos, que son producidos por los osteoblastos, no organizados y entrelazado entre focos de células cancerosas. En los osteoblastos, la endotelina-1, BMP, y las moléculas en la señalización de Wnt son altamente expresado. Además, los niveles séricos elevados de fosfatasa alcalina específica del hueso, un marcador de la diferenciación y la proliferación de osteoblastos, se observan a menudo en pacientes de cáncer con metástasis ósea [17], lo que sugiere la importancia de estas moléculas en la metástasis ósea CaP. Por lo tanto, la orientación de estas moléculas osteoblásticas podría inhibir la remodelación ósea y la metástasis ósea CaP
.
Recientemente, agentes naturales han recibido mucha atención en el área de la investigación del cáncer. isoflavona genisteína se encuentra principalmente en la soja ha demostrado su capacidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas
in vitro
y
in vivo
sin toxicidad. Hemos encontrado previamente que la isoflavona genisteína podría inhibir NF-kappa B y la activación de Akt en las células del cáncer [18]. Por otra parte, hemos informado de que la genisteína en la dieta podría inhibir CaP en la metástasis ósea experimental en un modelo SCID-humana [19] y que la genisteína podría potenciar la apoptosis induciendo efectos de los agentes quimioterapéuticos a través de la baja regulación de NF-kB [20]. 3,3, diindolylmetano (DIM) es otro agente natural y se encuentra principalmente en los miembros de la familia de las crucíferas, como el brócoli. Nosotros y otros han encontrado que DIM y su producto formulado (BR-DIM fabricado por BioResponse, LLC. Con una mayor biodisponibilidad) podría regular a la baja la expresión de AR, Akt y NF-? B, que conduce a la inhibición del crecimiento de PCa y la inducción de la apoptosis
in vitro
y
in vivo
[21], [22]. DIM también fue encontrado para potenciar la eficacia terapéutica de agentes quimioterapéuticos [23]. En este estudio, se investigó si G2535 mezcla que contiene isoflavonas genisteína 70,5%, y BR-DIM podría inhibir la diferenciación de los osteoblastos y los osteoclastos mediada a través de la regulación de las vías de señalización celular que están involucrados en la remodelación ósea y la metástasis ósea CaP.
Resultados
la diferenciación de los osteoblastos y los osteoclastos en el sistema de co-cultivo con células de CaP
Para investigar el papel de la señalización celular relacionadas con los huesos en la remodelación ósea durante la metástasis ósea del CP, que desarrolló por primera vez a un compañero sistema -cultura para permitir que células de CaP y osteoclastos o los osteoblastos cultivados bajo la misma condición medio de cultivo. Hemos encontrado que las células de cáncer de próstata PC-3 podrían crecer bien con pre-osteoclastos células (RAW264.7) (Figura 1A) y que tanto las células C4-2B y pre-osteoblastos (células hFOB1.19) podrían crecer juntos (Figura 1B) . Entonces, se trataron co-cultivo de células RAW264.7 PC-3 y con RANKL o TGF-β para inducir la diferenciación de los osteoclastos. Incubamos el co-cultivo de células y C4-2B hFOB1.19 a 39 ° C para inducir la diferenciación de los osteoblastos. tinción TRAP se llevó a cabo para detectar la diferenciación de osteoclastos mientras que la tinción de la fosfatasa alcalina se llevó a cabo para detectar la diferenciación de osteoblastos. Se observó formación de células multinucleadas y los gránulos de color marrón oscuro en los osteoclastos diferenciados rodeadas de células PC-3 (Figura 2a), lo que sugiere que la diferenciación de los osteoclastos podría ser inducida por RANKL o TGF-β en el entorno de crecimiento de CaP. También observamos gránulos de color azul oscuro en las células hTOB1.19 rodeadas por las células C4-2B (Figura 2B), lo que sugiere que podría ser diferenciado de osteoblastos cuando se cultivan junto con células de CaP.
A. las células PC-3 (indicado por el triángulo negro) fueron co-cultivadas con células RAW264.7 (indicados por la flecha negro) en baja densidad celular (a, b) y de alta densidad celular (C, D). células B. C4-2B (indicados por triángulo blanco) fueron co-cultivadas con células hFOB1.19 (indicados por la flecha blanca) en baja densidad celular (e, f) y de alta densidad celular (g, h). × 100.
A. células RAW264.7 se co-cultivaron con células PC-3 (indicada por la flecha negro) y se trató con 100 ng /ml RANKL (a, b) o 10 ng /ml de TGF-β (c, d) durante 8 días. tinción TRAP mostró gránulos de color marrón oscuro (indicados por la flecha blanca) en osteoclastos diferenciados rodeadas de células PC-3. células B. hFOB1.19 se cultivaron solo (e, f) o co-cultivadas (g, h) con células C4-2B (indicados por triángulo negro) en 39 ° C durante 5 días. tinción de fosfatasa alcalina mostró gránulos de color azul oscuro (indicado por el triángulo blanco) en los osteoblastos diferenciados. × 200.
inducida por TGF-β diferenciación de los osteoclastos a través de RANKL
Desde que se observó la diferenciación de los osteoclastos por el TGF-β, hemos probado el efecto de TGF-β en la expresión de RANKL . Se encontró que el nivel de expresión de RANKL se incrementó significativamente por el tratamiento de TGF-β en C4-2B y células PC-3 (Figura 3A), lo que sugiere que la inducción de la diferenciación de los osteoclastos por el TGF-β fue mediado a través de la regulación de RANKL y que las células de CaP pueden producir RANKL para inducir la diferenciación de los osteoclastos. También se observó que el nivel de expresión de CXCR-4, uno de los genes críticos para la metástasis, se incrementó significativamente por tratamiento de TGF-β. Estos resultados sugieren que el aumento del nivel de TGF-β por las células tumorales o estroma podría promover la remodelación ósea y metatstasis CaP través de RANKL y CXCR-4 de señalización
A:. C4-2B y las células PC-3 fueron tratados con 100 OPG ml /ng o 10 TGF-β ml /ng por 24 horas. La expresión de RANKL y la proteína CXCR-4 se midió por análisis de Western Blot. B y C: células RAW246.7 (B) y hFOB1.19 (C) en las cavidades inferiores fueron co-cultivadas con C4-2B (C4), PC-3 (PC), ARCAP
M (M) y ARCAP
E (E) las células de cáncer de próstata en cámaras superiores durante 48 horas. El análisis de Western Blot se llevó a cabo para medir la expresión de los osteoclastos o los osteoblastos marcadores en las células RAW264.7 o hFOB1.19.
Co-cultivo con células de cáncer de próstata aumentó la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos
Para investigar si las células de CaP pueden promover la diferenciación de los osteoclastos y los osteoblastos, las células cultivadas que RAW264.7 o hFOB en la cámara baja del sistema de cultivo y diversas células de CaP cultivadas incluyendo C4-2B, PC-3, ARCAP
M y ARCAP
e células en la cámara superior de manera que las proteínas secretadas por las células cancerosas podrían entrar en la cámara inferior de la cámara superior a través de una membrana con 1 micras de poro. Se realizó un análisis de Western blot para medir los marcadores de diferenciación de osteoclastos y osteoblastos. Se encontró que el co-cultivo de las células RAW264.7 con células de CaP aumentó la expresión de TRACP, uno de los principales marcadores de diferenciación de los osteoclastos en las células RAW264.7 (Figura 3B). La expresión de la fibronectina también se incrementó cuando se co-cultivaron con C4-2B y células PC-3 (Figura 3B). También se observó aumento de la expresión de RUNX2, uno de los marcadores de osteoblastos, en células hFOB1.19 (Figura 3C). La expresión de osteopontina, uno de los genes importantes para la remodelación ósea, también se indujo cuando se co-cultivaron con células de CaP (Figura 3C). Estos resultados sugieren que las células de CaP pueden producir algunas moléculas que contribuyen a la inducción de la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos, causando la remodelación ósea.
isoflavona y BR-DIM inhibieron la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos
para investigar los efectos de las isoflavonas y BR-DIM en el differntiation de los osteoclastos y los osteoblastos, las células tratadas RAW264.7 o hFOB1.19 con 10 a 25 G2535 M o BR-DIM durante los procesos de los osteoclastos y la diferenciación de osteoblastos. Se realizó tinción TRAP o fosfatasa alcalina para detectar la diferenciación de los osteoclastos u osteoblastos. Hemos observado que la formación inducida por el TGF-β de los osteoclastos multinucleados y que los tratamientos de isoflavona y BR-DIM disminuyó significativamente los gránulos de color marrón oscuro en las células RAW264.7 (Figura 4A) y los gránulos de color azul oscuro en las células cuando se cultivan hFOB1.19 solo (Figura 4B ) o co-cultivadas con C4-2B (Figura 4C). Estos resultados sugieren claramente que isoflavona y BR-DIM podrían inhibir la diferenciación de los osteoclastos y los osteoblastos, lo que podría atenúan la remodelación ósea durante CaP metástasis y sería muy deseable para la inhibición de la metástasis ósea CaP
A:. RAW246. 7 células fueron tratadas con 10 ng /ml de TGF-β solo o combinado con 10 G2535 mu M durante 8 días. Se llevó a cabo la tinción TRAP. gránulos de color marrón oscuro indican la diferenciación de los osteoclastos. × 100. B y C: las células se cultivaron hFOB1.19 sola (B) o co-cultivadas con células C4-2B (C) a 39 ° C. Las células también se trataron con G2535 20 M o 10 M BR-DIM durante 5 días. tinción de fosfatasa alcalina mostró gránulos de color azul oscuro en osteoblastos diferenciados. × 200.
isoflavona y BR-DIM RANKL regulado y señalización de cáncer de próstata, lo que podría inhibir el crecimiento del cáncer de próstata y la osteoclastogénesis
Como hemos constatado que isoflavona y BR-DIM inhibieron la diferenciación de los osteoclastos, que investigó aún más el mecanismo molecular de acción de isoflavonas y BR-DIM en osteoclastgenesis. Hemos llevado a cabo el análisis de microarrays de perfil de expresión génica de las células tratadas con C4-2B G2535 o BR-DIM. Mediante el uso de Ingenuity Pathway Analysis, encontramos que la isoflavona y BR-DIM inhibieron la transducción de la señal celular en la vía de señalización de RANKL (Figura 5A y la Tabla 1) y PCA de señalización (Figura 5B y Tabla 1). BR-DIM y isoflavona inhibieron significativamente la expresión de MITF, uno de los factores importantes transcrption implicadas en la regulación de la expresión génica osteoclástica (Figura 5A y la Tabla 1). BR-DIM y isoflavona también inhibió la transducción de señales en el CaP de señalización con la sobre regulación de p27 y la baja regulación de PSA y ciclina D (Figura 5B y Tabla 1). Por otra parte, isoflavonas y BR-DIM regulan las moléculas en las redes de transducción de señales con baja regulación de Akt, Nkx3-1, STK-4, CDK13 y MITF (Figura 5C, 5D y Tabla 1), lo que lleva a la inhibición de la osteoclastogénesis y el crecimiento del CaP. Por otra parte, hemos llevado a cabo en tiempo real de RT-PCR y Western blot para confirmar los resultados de microarrays y Pathway Analysis Ingenity. Hemos observado que la BR-DIM y isoflavona las reguladas la expresión de MITF, Akt, Nkx3-1, ciclina D y PSA, y hasta regulado la expresión de p27, p38 y CREB en el ARNm (Figura 6 A y 6 B) y proteína (Figura 6C y 6D) niveles. Estos resultados son consistentes con los datos de microarrays, lo que sugiere que la BR-DIM y isoflavonas podrían inhibir la osteoclastogénesis y el crecimiento del CaP.
BR-DIM regulada en las moléculas de señalización RANKL (A), señalización de cáncer de próstata (B), y la señal redes de transducción (C, D) analizados por microarray y análisis Ingenuity Pathway en las células C4-2B. El color rojo indica hasta reguladas moléculas, mientras que especifica verdes moléculas de las reguladas. Las cifras fueron creados automáticamente por el software Ingenuity Pathway Analysis.
BR-DIM y isoflavona regulada la expresión de MITF, p38, Akt, Nkx3-1, p27, ciclina D, CREB y PSA en el ARNm y los niveles de proteína probados por PCR en tiempo real (A, B) y el análisis Western Blot (C, D). células C4-2B (A, C) y PC-3 (B, D) se trataron con 25 mM G2535 o 25 mM BR-DIM durante 24 horas (para la extracción de ARN) o 48 horas (para la extracción de proteínas). . (BD: BR-DIM)
RANKL regulado hasta la expresión de miR-92a mientras isoflavona y BR-DIM abragated la sobre regulación de miR-92a estimulada por RANKL
Por predicción computarizada de miRNAs objetivo, hemos encontrado que RANKL podría regular varios miRNAs como miR-92a y miR-155, que conduce a un aumento de la osteoclastogénesis. Para confirmar si el miR-92a es un objetivo legítimo de RANKL o no, las células tratadas C4-2B con 100 ng /ml RANKL durante 24 horas. Hemos observado que la expresión inducida miR-92a tratamiento RANKL en células de CaP (Figura 7A). Es importante el descubrimiento de que el tratamiento de las células con isoflaone o BR-DIM disminuyó la expresión de miR-92a y atenúa la inducción de la expresión de miR-92a estimulada por RANKL en el CaP células (Figura 7A), lo que sugiere una relación mecánica entre RANKL, miR 92a y la actividad biológica de isoflavonas o BR-DIM
A:. C4-2B células fueron tratadas con 100 ng /ml RANKL, 25 G2535 M, 25 M BR-DIM, o combinación de RANKL y G2535 o BR-DIM durante 24 horas. El ARN total se extrajo y se detectó la expresión de miR-92a en las células C4-2B tratados. B: las células se cultivaron en C4-2B cámara baja del sistema de co-cultivo. células RAW246.7 y hFOB1.19 se cultivaron en la cámara superior. Las células fueron tratadas con G2535 25 M o 25 M BR-DIM durante 48 horas. La expresión de E-cadherina y vimentina se midió por análisis de Western Blot. C: Las células se trataron con hFOB1.19 G2535 25 M o 25 M BR-DIM durante 48 horas. La expresión de periostina se detectó por análisis de Western Blot.
isoflavona y BR-DIM regulada epitelio-mesenquimal transición (EMT) marcadores, E-cadherina y vimentina
Como nos observó que isoflavona y BR-DIM podrían inhibir la expresión de miR-92a, que podría promover la metástasis y regular EMT apuntando a la baja regulación de la expresión de e-cadherina [24], que investigarse más a los efectos de isoflavona y BR-DIM en la expresión de e-cadherina y vimentina, las dos más importantes y bien aceptados marcadores de EMT que se asocian directamente con la EMT fenotipo. Cultivamos células C4-2B en la cámara inferior de un sistema de co-cultivo en el que las células cultivadas RAW264.7 y hFOB1.19 en la cámara superior para imitar el microambiente tumoral de células de CaP y la interacción de los osteoclastos /osteoblastos. Posteriormente, se trataron las células con G2535 25 25 M o M BR-DIM durante 48 horas. Se encontró que isoflavona o BR-DIM tratamiento aumentó la expresión de E-cadherina y la disminución de la expresión de vimentina (Figura 7B), lo que sugiere que la isoflavona y BR-DIM podrían prevenir la inducción de la EMT mediante la regulación de la expresión de miR-92a, E -cadherin y vimentina.
isoflavona y BR-DIM inhiben la expresión del gen osteoblástica
Desde que se observó que la isoflavona y BR-DIM podrían inhibir la diferenciación de los osteoblastos, que investigarse más a la diana molecular de isoflavona y la acción BR-DIM en la diferenciación de los osteoblastos. Las células tratadas con hFOB1.19 G2535 25 25 M o M BR-DIM durante 48 horas. Se encontró que isoflavona o tratamiento BR-DIM inhibieron la expresión de la periostina (Figura 7C), uno de los genes importantes para la diferenciación de osteoblastos. Estos resultados sugieren que la inhibición de la periostina podría ser uno de los mecanismos moleculares por los cuales isoflavona y BR-DIM inhibieron la diferenciación de los osteoblastos.
Discusión
Es bien sabido que las células de CaP con frecuencia metástasis a el hueso. En el hueso, células de CaP metástasis podrían utilizar los nutrientes de la sangre en la médula ósea, interactuar con pre-osteoclastos y pre-osteoblastos, y estimular la remodelación ósea [25], [26]. La interacción entre células de CaP y pre-osteoclastos /pre-osteoblastos es un paso crítico para la remodelación ósea durante CaP metástasis ósea [26]. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de co-cultivo con células de CaP y pre-osteoclastos /pre-osteoblastos es importante para la investigación de las interacciones moleculares de las vías de señalización durante la metástasis ósea CaP y la remodelación ósea. Nuestros datos muestran que las células de CaP andrógeno-insensible incluyendo las células PC-3 y C4-2B podrían crecer bien con pre-osteoclastos o pre-osteoblastos en la misma placa de cultivo con medio definido, que imita
in vivo
ambiente con interacción directa de células de CaP y células óseas locales. En nuestro sistema de co-cultivo, las células de CaP, pre-osteoclastos, y pre-osteoblastos podrían también crecer en cámaras individuales que fueron separados por una membrana que permite proteínas de distribución (factores solubles) entre las dos cámaras, mientras que la separación de diferentes tipos de células en cámaras individuales . De esta manera, el efecto de las proteínas secretadas (factores solubles) a partir de células de CaP en las células óseas o los efectos de las proteínas secretadas a partir de células óseas en células de CaP pueden ser investigados. El uso de co-cultivo, hemos probado las alteraciones moleculares en los osteoclastos u osteoblastos estimulados por células de CaP. Estudios recientes realizados por otros investigadores demostraron que el co-cultivo de osteoblastos y los osteoclastos podría ser útil para examinar el metabolismo óseo y la osteoclastogénesis [27], [28]. Estos hallazgos sugieren que el sistema de co-cultivo es muy útil para la investigación de las alteraciones moleculares en células de CaP son valores iniciales hasta el hueso, lo que permitirá evaluar las alteraciones en los transducción de señales entre células de CaP y las células óseas locales durante la metástasis ósea CaP y el hueso remodelación como se documenta por nuestros resultados.
la diferenciación de los osteoclastos u osteoblastos es un paso importante en la metástasis del cáncer a la remodelación ósea y el hueso. Mediante el uso de nuestro sistema de co-cultivo, se encontró que los pre-osteoclastos podrían diferenciar en los osteoclastos a madurar cuando se co-cultivaron conjuntamente con células de CaP. Además, pre-osteoblastos también podrían diferenciarse en osteoblastos para madurar cuando se co-cultivadas con células de CaP. Además, hemos encontrado que la co-cultivo de osteoclastos y osteoblastos con células de CaP podría aumentar la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos. Estos hallazgos sugieren que las moléculas producidas por células de CaP pueden inducir la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos. Es importante destacar que se encontró que isoflavona y BR-DIM podría inhibir la diferenciación de los osteoclastos y osteoblastos cuando se co-cultivaron con células de CaP, lo que sugiere que isoflavona y BR-DIM serían útiles para la inhibición de la metástasis ósea PCa y la remodelación ósea (Figura 8) . Se ha sabido que las células de CaP en la metástasis ósea estimulan la remodelación ósea, mientras que facilita la remodelación ósea CaP metástasis ósea y la invasión en el hueso [29] - [31], que se conoce como un ciclo vicioso de la remodelación ósea y la metástasis ósea. Nuestros resultados mostraron que isoflavona y BR-DIM inhibieron la diferenciación de células de hueso, lo que sugiere que isoflavona y BR-DIM podría inhibir CaP metástasis ósea a través de la interrupción de la remodelación ósea.
Se ha informado de que la diferenciación de los osteoclastos se produce primero durante la remodelación ósea cuando células de CaP metastatizan al hueso [4], [5]. Por lo tanto, la inhibición de la diferenciación de los osteoclastos es importante para la interrupción de CaP metástasis ósea y homing. Es bien sabido que la señalización de RANK /RANKL /OPG es el regulador clave de la diferenciación de osteoclastos [32]. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento RANKL podría inducir significativamente la diferenciación de los osteoclastos, lo cual es consistente con el informe publicado [33]. Más importante aún, se encontró que TGF-β-hasta podría regular la expresión de RANKL, lo que lleva a la diferenciación de los osteoclastos. Estos resultados también son consistentes con el informe de otro investigador [31], lo que sugiere que la activación de TGF-β, que se observa comúnmente en CaP avanzado, podría estimular la diferenciación de los osteoclastos, que conduce a la resorción ósea y la remodelación ósea. Por otra parte, es bien sabido que el TGF-β también podría inducir EMT [34], lo que facilita la progresión de CaP incluyendo la invasión y la metástasis ósea. Es importante destacar que, nuestros datos muestran que isoflavona podría atenuar TGF-β inducida por la diferenciación de osteoclastos, y que isoflavona y BR-DIM podría regular la expresión de marcadores de EMT (Figura 8), lo que sugiere que estos agentes naturales podrían ser útiles para la prevención de la progresión de CaP y metástasis ósea.
Nuevas pruebas sugieren que los microRNA (miRNA) regulan muchos procesos fisiológicos y patológicos [35]. Nuestros resultados mostraron que, además de los osteoclastos que regulan, RANKL podría también hasta de regular la expresión de miR-92a. El miR-92a se ha encontrado para regular a la baja la expresión de genes anti-tumorales, lo que resulta en la proliferación de células de cáncer [36]. informe reciente mostró que la E-cadherina es un objetivo directo de miR-92a y de que la expresión de miR-92a promueve la metástasis de los ganglios linfáticos del carcinoma esofágico de células escamosas humano a través de la regulación por disminución de la E-cadherina [24]. Por lo tanto, RANKL también podría promover la progresión del CaP a través de la regulación de miR-92a y por lo tanto por la baja regulación de la E-cadherina. Curiosamente, isoflavonas y BR-DIM fueron capaces de atenuar la sobre regulación de miR-92a estimulado por el tratamiento RANKL, lo que sugiere la importancia de estos agentes naturales (isoflavonas y BR-DIM) en la inhibición de la progresión del CaP y la metástasis ósea (Figura 8 ).
Además de los efectos inhibitorios sobre los osteoclastos, isoflavonas y BR-DIM también inhibted la diferenciación de los osteoblastos con la baja regulación de la periostina, uno de los genes importantes para la diferenciación de los osteoblastos. Por lo tanto, por la orientación tanto de los osteoclastos y la diferenciación de osteoblastos, isoflavona y BR-DIM podría interrumpir efectivamente la remodelación ósea, proporcionando micoenvironment desfavorable para el homing de células de CaP en el hueso. Aunque tanto isoflavona y BR-DIM mostraron efectos inhibidores sobre la diferenciación de células óseas, las moléculas implicadas y niveles alterados de isoflavona o tratamiento BR-DIM no eran los mismos, lo que sugiere que los mecanismos de regulación complejos están involucrados. Por vía de la red y el análisis, encontramos que la isoflavona y BR-DIM podrían afectar a múltiples vías de señalización tales como AR /PSA, Nkx3-1 /Akt /p27, LEF1 /ciclina D1, MITF /NR3C1, etc. En BR-DIM tratados C4 2B células, encontramos más potente baja regulación de PSA que se ha encontrado para modular los genes implicados en la remodelación ósea y los osteoblastos diferenciación [37]. Estos resultados sugieren que los efectos de metas múltiples de isoflavona y BR-DIM, lo que hará de isoflavona y BR-DIM poderosos agentes para inhibir el crecimiento de CaP en microambiente de la médula.
En conclusión, isoflavonas y BR-DIM pudieron centrarse tanto en los osteoclastos y osteoblastos diferenciación, y también podría apuntar a múltiples moléculas en células de CaP; Por lo tanto, estos agentes podrían inhibir la remodelación ósea y el crecimiento CaP, lo que sugiere que isoflavona y BR-DIM podrían ser muy útiles para la prevención de la progresión de CaP, especialmente metástasis ósea. La actividad biológica de isoflavona y BR-DIM está mediada a través de la baja regulación de múltiples vías de señalización que incluyen RANKL, AR /PSA, y la señalización Akt, lo que los hace agentes muy prometedores para la prevención y /o tratamiento de CAP y la metástasis ósea en combinación con la quimioterapia convencional.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, reactivos y anticuerpos
PC-3 (ATCC, Manassas, VA), C4-2B, ARCAP
e y ARCAP
M (Novicure, Birmingham, AL) células de cáncer de próstata y RAW264.7 pre-osteoclastos células (ATCC) se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal , 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina en una CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C. hFOB1.19 Pre-osteoblastos células (ATCC) se mantuvieron en DMEM /F12 sin rojo fenol (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal 10%, 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina en un 5% de CO
2 atmósfera a 34 ° C. G2535 mezcla de isoflavona (70,5% genisteína, daidzeína y 26,3% 0,31% glycetein fabricado por Tecnologías orgánicos y obtenido a partir de NIH) se disolvió en DMSO para preparar una solución de reserva que contenía 50 mM genisteína. Las concentraciones de isoflavona que hemos descrito en este artículo se refieren todos a la concentración de genisteína en la mezcla de isoflavonas. BR-DIM (BioResponse, LLC, Boulder, CO;. Formula-DIM y más bio
in vivo
[38]) fue generosamente proporcionado por el Dr. Michael Zeligs y se disolvió en DMSO para obtener un 50 mM stock solución. Anti-CXCR-4 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA), anti-fibronectina (Santa Cruz), anti-RUNX2 (Santa Cruz), anti-osteopontina (Santa Cruz), anti-periostina (Santa Cruz), anti-E -cadherin (Santa Cruz), anti-vimentina (Dako), anti-RANKL (amp I +; D, Danvers, MA), anti-TRACP (Sigma, St. Louis, MO), anti-MITF (Santa Cruz), anti- p27 (Santa Cruz), anti-PSA (Santa Cruz), D anti-ciclina (Santa Cruz), anti-p38 (Santa Cruz), anti-β-actina (Sigma) y anti-GAPDH (Sigma) se utilizaron anticuerpos primarios para el análisis de Western Blot.
co-cultivo de células de CaP con los osteoclastos y osteoblastos
para emular células CaP cultivadas en un entorno osteoclástica, PC-3 células y células RAW264.7 fueron co-cultivadas en relación 1:01 en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%, 50 U /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C. Las células fueron tratadas con 100 ng /ml RANKL o 10 ng /ml de TGF-β para 8 días para estimular la diferenciación de células RAW264.7. Del mismo modo, para imitar celular CaP cultiva en medio ambiente osteoblástica, las células C4-2B y hFOB1.19 fueron co-cultivadas en relación 1:02 en medio RPMI 1640 /F12 (01:01) suplementado con suero bovino fetal 10%, 50 U /ml penicilina estreptomicina, y 50 mg /ml en una atmósfera de CO2 al 5% a 39 ° C durante 5 días para estimular la diferenciación de osteoblastos de las células hFOB1.19.