Se cree
Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) que es responsable de la iniciación del tumor y la recidiva después de la quimioterapia. Orientación de los CAC y no los CAC con compuestos específicos puede ser un método eficaz para reducir el crecimiento del cáncer de pulmón y metástasis. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la salinomicina, un inhibidor selectivo de células madre cancerosas, con o sin combinación con paclitaxel, en un modelo metastático. Para evaluar el efecto de estos fármacos en la metástasis y el tumor microambiente nos aprovechamos de las personas inmunocompetentes y el modelo de ratón LLC altamente metastásico. Aldefluor ensayos se utilizaron para analizar las ALDH +/- poblaciones en murino LLC y H460 humano y células de cáncer de pulmón H1299. Salinomicina redujo la proporción de ALDH + células madre cancerosas en células LLC, mientras que aumentaron paclitaxel tal población. Se observó el mismo efecto para las líneas celulares H460 y H1299. Salinomicina redujo la capacidad de formación de tumorsphere LLC por más de 7 veces, pero paclitaxel no mostró ningún efecto. En
in vivo
experimentos, paclitaxel redujo el volumen del tumor primario, pero aumentó el número de nódulos metastásicos (P & lt; 0,05), mientras que la salinomicina tenían ningún efecto sobre los tumores primarios, pero redujo las metástasis pulmonares (p & lt; 0,05). La combinación de ambos fármacos no mejoró el efecto de las terapias individuales. niveles ALDH1A1, SOX2, CXCR4 y SDF-1 mRNA fueron más altos en las lesiones metastásicas que en los tumores primarios, y fueron significativamente elevados en ambos lugares por tratamiento con paclitaxel. Por el contrario, se redujeron dichos niveles (o en algunos casos no cambiaron) cuando los ratones se administraron con salinomicina. El número de F4 /80 + y células CD11b + también se redujo después de la administración de ambos fármacos, pero particularmente en la metástasis. Estos resultados muestran que la salinomicina apunta a las CSC ALDH + pulmonares, lo que tiene importantes efectos terapéuticos
in vivo fotos: por la reducción de las lesiones metastásicas. Por el contrario, el paclitaxel (aunque la reducción del crecimiento del tumor primario) promueve la selección de ALDH + células que probablemente modificar el microambiente pulmonar para fomentar la metástasis
Visto:. Larzabal L, El-Nikhely N, Redrado M, W Seeger, Savai R, Calvo a (2013) Efectos diferenciales de las drogas dirigidas a cáncer de células madre (CSC) y no-CSC Poblaciones en tumores primarios de pulmón y metástasis. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10.1371 /journal.pone.0079798
Editor: Ilya Ulasov, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2013; Aceptado: September 25, 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Larzabal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido financiado por "proyecto UTE CIMA", ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 de subvención, PIUNA (ref. 12028402) y el Gobierno de Navarra (ref. 2179) (AC). LL fue apoyado por una beca Gobierno Vasco. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo y la causa más común de muerte por cáncer en hombres y mujeres [1]. La mayor parte de los casos de cáncer de pulmón pertenecen al cáncer de células no pequeñas de pulmón (NSCLC) tipo (85% de ellos). El pronóstico para los más de 60% de los pacientes con NSCLC es pobre, en parte debido etapa avanzada al momento del diagnóstico se opone a la cirugía curativa, y en parte porque los tratamientos médicos son ineficaces. En 2007, las tasas de supervivencia a 5 años para los hombres y las mujeres diagnosticadas con cáncer de pulmón eran un 16%. Por desgracia, estos porcentajes no han cambiado sustancialmente durante varias décadas a pesar de los importantes avances en el diagnóstico y las opciones terapéuticas [2]. Aunque el uso de terapias dirigidas para el cáncer de pulmón ha sido un gran avance en la investigación del cáncer, sólo una pequeña proporción de los pacientes se benefician de ellos. Por lo tanto, existe una clara necesidad de nuevas alternativas terapéuticas para un tratamiento más eficaz de este tipo de tumor. Una nueva vía terapéutica que actualmente está siendo probado en experimentos preclínicos para una variedad de tumores sólidos se dirige a las células madre del cáncer (CSC). La hipótesis de los CAC establece que los CAC son responsables de la iniciación del tumor, la supervivencia celular después de la terapia, la diseminación metastásica y la recurrencia del tumor [3]. A pesar de la evidencia reciente sugiere que los cánceres de pulmón humano, al igual que otros tumores, también pueden albergar poblaciones de CSC, la identificación de células madre cancerosas de pulmón humano se ha visto obstaculizada por la falta de marcadores de células madre fiables. Expresión y actividad de aldehído deshidrogenasas (ALDH) sirven como marcadores de CSC en mama [4] y del pulmón [5] tumores. Además, el aumento de la actividad de ALDH se ha encontrado en poblaciones de células madre en diferentes tipos de tumores, incluyendo el mieloma humano múltiple, leucemia mieloide aguda, cerebro, mama, hígado, colon, páncreas [6], [7] y, más recientemente, en el pulmón, donde ALDH1A1 expresión se asocia con una baja supervivencia en una cohorte de pacientes con CPCNP en estadio I [8]. La fracción de ALDH + se enriquece en células iniciadoras de tumores con un aumento de la migración, la capacidad de adhesión y el potencial metastásico [9]. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la medición de los niveles de ALDH o actividad enzimática puede servir como un pulmón CSC marcador.
CSC son resistentes a muchos tratamientos actuales contra el cáncer, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia [10], [11]. Esto sugiere que muchas terapias contra el cáncer, mientras que matar la mayor parte del tumor, en última instancia puede fallar porque no eliminan las células madre cancerosas, que se las arreglan para sobrevivir y para regenerar nuevos tumores. evidencia experimental reciente sugiere también una gran plasticidad de ambas poblaciones y CSC-CSC no [12]. Esto ha llevado a algunos autores a plantear la hipótesis de que los dirigidos a las poblaciones tanto de CSC CSC y no es probable que sean necesarios para un tratamiento más eficaz, aunque esta cuestión no se ha probado experimentalmente todavía.
salinomicina, un ionóforo de potasio, era identificado recientemente como un inhibidor selectivo de células madre de cáncer de mama humano
in vitro
[13]. Aunque el mecanismo de acción de salinomicina aún no está claro, parece actuar como un potente inhibidor de la resistencia a múltiples fármacos P-glicoproteína (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].
migración de células tumorales y metástasis, como características importantes de la biología del tumor comparten muchas similitudes con el tráfico de leucocitos, que está regulado por la crítica por quimiocinas y sus receptores. La acumulación de datos sugieren que CXCR4 (CXC de quimiocinas receptor-4) y SDF1 (estroma celular deriva del factor de 1, o CXCL12) podría regular la migración y metástasis en una variedad de pulmón, mama y de próstata células del cáncer [15]. Por otra parte, la sobreexpresión CXCR4 correlacionado con mal pronóstico en muchos tipos de tumores [16]. CSC expresan receptor CXCR4 y responden a un gradiente quimiotáctico de su específica ligando SDF-1 [17], lo que sugiere que las CSC probablemente representan una subpoblación capaz de iniciar la metástasis [18]. Una mejor comprensión del mecanismo migratorias de las células cancerosas y células madre cancerosas proporcionaría herramientas más adecuadas para el desarrollo de nuevas terapias para reducir tanto las recurrencias locales y distantes
.
CSC interactúan con rodea a las células no malignas y ambos tipos de células son co- regulada en el microambiente del tumor [19]. Las células de la microambiente tumoral no sólo podrían mejorar el crecimiento del tumor primario, sino también facilitar su diseminación metastásica a órganos distantes. consecuencia metastásico exitosa depende por lo tanto de la capacidad de las células cancerosas para aprovechar el microambiente que rodea a cada paso del proceso metastásico. microambiente tumoral comprende numerosas células incluyendo las células endoteliales, los fibroblastos del estroma y una variedad de células de médula ósea derivadas (BMDCs) tales nos macrófagos, células supresores de origen mieloide, Tie2 que expresan monocitos y células madre mesenquimales [20]. Cuando las células tumorales llegan al sitio de la metástasis tienen que conseguir adaptado a un nuevo microambiente que es diferente de la del tumor primario [21]. Las interacciones tumor-estroma precisas en tumor primario y el sitio de la metástasis son en gran parte desconocidos.
Anterior trabajo seminal ha demostrado que la salinomicina y paclitaxel exhibido modos distintos de acción en un modelo de ratón de cáncer de mama, con salinomicina poseer CSC-específica actividades inhibidoras [13]. Teniendo en cuenta que las CSC puede ser mediadores clave de la metástasis, la hipótesis de que las células madre cancerosas dirigidos específicamente con salinomicina reduciría el potencial metastásico de las células tumorales residuales. Para hacer frente a esta hipótesis, se investigó la eficacia de la presunta salinomicina CSC-farmacológico específico en el crecimiento y la diseminación metastásica de NSCLC. Presentamos aquí que la salinomicina afecta diferencialmente la tasa de crecimiento del tumor primario y NSCLC relativa potencial metastásico a los del paclitaxel agente quimioterapéutico convencional, la correlación de las actividades biológicas con las medidas de los rasgos CSC. También utilizando el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) modelo de ratón, se presenta cómo estos compuestos afectan el microambiente tumoral en ambos sitios de tumor primario y metastásico.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y compuestos
Las líneas celulares utilizadas en este estudio incluyen el carcinoma de pulmón de ratón Lewis (LLC) y H460 y H1299 humana. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en RPMI (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) con suero bovino fetal 10% (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y 1% de penicilina-estreptomicina (Lonza, Basilea, Suiza), a 37 ° C y 5% de CO
2 atmósfera. Salinomicina y paclitaxel se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.) y se disolvieron en 20% de DMSO en PBS (vehículo). Las concentraciones finales de salinomicina y paclitaxel utilizadas en todo
in vitro Los ensayos se
1 mg /ml para la salinomicina y 40 ng /ml para paclitaxel. Las células tratadas con vehículo se utilizaron como controles. Estas dosis se utilizaron basado en publicaciones anteriores [13].
Esfera Formación Ensayo
Para la formación de la esfera, las células fueron cultivadas en medio de cultivo libre de suero DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, Reino Unido ) suplementado con factores de crecimiento (MEGM SingleQuots, Lonza, Basilea, Suiza) y B27 (Gibco, Paisley, UK). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos ultra bajas de fijación (Corning, Lowell, MA, EE.UU.) a una densidad de 1000-5000 células por pocillo, dependiendo de la línea celular y se cultivaron durante 7-10 días. Para evaluar el potencial de auto-renovación de estas células, la primera generación de esferas se recogió por centrifugación suave, disociado en suspensiones de una sola célula, y se cultivaron en las condiciones descritas anteriormente para otros 7 a 10 días. Para probar el efecto de los fármacos en la capacidad de formación de esferas, las células se colocaron en placas en presencia de 20% de DMSO (vehículo), salinomicina (1 mg /ml) o paclitaxel (40 ng /ml) al principio del experimento, sin más Además de la droga. Después de 7 días, se analizaron las placas para la formación de tumorspheres pulmón y el número de esferas por pocillo fue cuantificado usando un microscopio invertido (Olympus, Hamburgo, Alemania). Para evaluar el efecto del tratamiento con fármaco en la ALDH + población en esferas LLC derivadas de, las esferas formadas fueron tratados con paclitaxel (40 ng /ml) o vehículo durante 72 horas. Después de la incubación, Aldefluor los ensayos se realizaron por citometría de flujo.
ALDH tinción y clasificación de células
El kit Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.) se utilizó para el perfil y las células separadas con alta y la actividad enzimática de ALDH baja. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 × 10
6 Se incubaron las células en tampón Aldefluor que contiene el sustrato de proteína ALDH (BAAA, BODIPY-aminoacetaldehído, 1 mmol /L) durante 30 minutos a 37 ° C. Las células que podría catalizar BAAA a su producto fluorescente (BAA) se consideraron ALDH +. Ordenación de Puertas de FACS fueron extraídas con respecto a la celda de fluorescencia de línea de base, que se determinó mediante la adición de la diethylaminobenzaldehyde inhibidor de ALDH-específico (DEAB) durante la incubación. 7-aminoactinomicina D (7-AAD; Sigma-Aldrich) se utilizó para enumerar células viables, apoptóticas y muertas (Figura S1A). Las células fueron ordenados en una FACSAria Ilu (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) y la pureza de células clasificadas se ensayó después de que el proceso se completó (Figura S1B). Los datos fueron analizados por la célula de Quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) y softwares FlowJo (Ashland, Estados Unidos).
CXCR4 Citometría de Flujo
Después de la incubación de las células con LLC vehículo, salinomicina (1 mg /ml) o paclitaxel (40 ng /ml) durante 72 horas las células se lavaron una vez con PBS y después se cosechó con 0,05% de tripsina /0,025% de EDTA. Independiente células se lavaron con PBS /EDTA /BSA (tampón de lavado) y se resuspendieron en el tampón de lavado (10
6 células /100 l). se añadió anticuerpo CXCR4 (Sigma) o su respectivo control de isotipo a la suspensión celular a las 1:50 concentración y se incubaron a 4 ° C durante 30 min. Las células marcadas se lavaron de nuevo y se añadió el anticuerpo secundario conjugado con FITC (BD Bioscience) y se incubaron a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. Las células fueron lavadas y analizadas en un citómetro (BD Biosciences).
Ensayo clonogénico
Para evaluar el potencial clonogénico de ALDH poblaciones positivas y negativas de células LLC después de la clasificación, se sembraron 500 células por pocillo en placas de 6 pocillos en condiciones adherentes. Después de 10 días en cultivo, las colonias se fijaron con formalina al 4% tamponado (Panreac, Barcelona, España) y se tiñeron con cristal violeta 2%. Se determinó el número de colonias por pocillo.
proliferación celular y la proliferación celular Ensayo de citotoxicidad
se determinó mediante el ensayo de MTT (Roche, Palo Alto, EE.UU.). Ordenada ALDH poblaciones positivas y negativas de células LLC o células LLC no clasificados se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (1000 células por pocillo) en 100 l de medio. 24, 48, 72 y 96 horas más tarde se añadieron 10 l de MTT. absorbancia espectrofotométrica se midió a 570 nm.
Para el ensayo de citotoxicidad, las células LLC que crecen en adherente o en anoikis resistentes a condiciones (de formación de esferas) se sembraron en placas de 96 pocillos (1000 células por pocillo) y se trataron con paclitaxel diluido en serie (0-100 nM). Setenta y dos horas después de la incubación, ensayos de MTT se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante. El porcentaje de supervivencia de las células se normalizó dividiendo la absorbancia final de las muestras tratadas por la del control no tratado, y de la IC
50 se calculó.
Extracción de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR)
ARN total fue aislado de las células, que contiene gránulos de esfera, o muestras de tejido congelado utilizando QIAamp RNeasy Minikit (Qiagen, Chatsworth, CA). Después del tratamiento con DNasa I, la transcripción inversa se realizó con transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) para generar ADN complementario (ADNc). QRT-PCR se realizó en un 7900 en tiempo real máquina de PCR de Applied Biosystems. reacciones QRT-PCR se llevaron a cabo con SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Forster City, CA, EE.UU.) y los niveles de GAPDH se utilizaron como controles. Se utilizó el valor de umbral de ciclo media (Ct) para el gen de interés, normalizado al valor Ct de la limpieza de genes (GAPDH) para calcular los valores de expresión de genes. Los ensayos se realizaron para cuantificar los niveles de ARNm de ratón y /o humana ALDH1A1, genes SOX2, CXCR4, SDF-1, CD11b, VEGF y VEGFR1. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S1. Los datos se dan como 2
-ΔΔCt o 2
-ΔCt.
Migración de ensayo (Boyden Cámara) guía
Migración ensayos se llevaron a cabo en una cámara de Boyden. 20000 células por pocillo en medio libre de suero se sembraron en el transwell superior de placas de 24 pocillos (Costar) en presencia de vehículo, salinomicina (1 mg /ml) o paclitaxel (40 ng /ml). Medio con 10% de suero, se utiliza como un quimioatrayente, se colocó en el compartimiento inferior. Después de 48 horas, las células en la cámara superior se limpian con un paño de algodón, y las células en el compartimiento inferior se fijaron con formalina al 4% y se tiñeron con cristal violeta. Se evaluó el número de células migratorias con un microscopio Leica DMIL LED usando el software LAS EZ (Leica Microsystems).
Los estudios en animales
Los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas establecidas por nuestra instituciones (Universidad de Navarra), en virtud de un animal protocolo aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Navarra (069/11). Todos los animales fueron alojados en jaulas microisolator y en condiciones SPF. Todos los procedimientos de cirugía se realizó bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
Para la evaluación del tumor iniciar la capacidad de CSC, de seis semanas de edad (NSG NOD SCID IL2Rg de The Jackson se utilizaron laboratorio, EE.UU.). Se inyectaron mil o cinco mil células LLC según positivos o negativos ALDH por vía subcutánea en los flancos de los ratones en PBS. El volumen del tumor se midió después de 3 semanas con un calibrador electrónico. Al final del experimento los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación. Se utilizaron cuatro ratones por grupo.
Para probar el efecto de la salinomicina y paclitaxel
in vivo, página 5 × 10
se inyectaron células LLC 5 por vía subcutánea en el flanco de 8 semanas de edad C57BL /6 ratones. El tratamiento con fármacos se inició 6 días después de la inyección de células tumorales, el tiempo en el que el tumor primario alcanzó aproximadamente 50 mm
3. Los animales se administran ya sea con 20% de DMSO en PBS (vehículo), salinomicina (5 mg /kg), paclitaxel (5 mg /kg), o una combinación de ambos fármacos cada 2 días, por inyección intraperitoneal, durante 5 semanas. Se seleccionaron estas dosis y pautas de tratamiento basado en publicaciones anteriores [13]. Los tumores se midieron cada 2 días con un calibrador electrónico. Cuando los tumores primarios alcanzaron aproximadamente 300 mm
3, los tumores fueron removidos quirúrgicamente y se cosen las incisiones. La operación se realizó con ratones anestesiados utilizando isoflurano (Esteve, Barcelona, España) y en condiciones asépticas. Con el fin de reducir el sufrimiento de los animales se les administró con ketoprofeno (5 mg /kg) cada 24 horas durante 3 días después de la cirugía. Tres semanas más tarde, los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación y los pulmones se retiraron para el análisis adicional de nódulos metastásicos. Cada grupo comprendía 5 ratones, y el experimento se repitió dos veces, con el fin de confirmar los resultados.
Tinción y análisis de imágenes
Las secciones de tejido se fijaron en 4% de formalina tamponada, se embebieron en parafina, y seccionada (5 micras de grosor). Las preparaciones fueron teñidas con H & amp; E. Para la cuantificación de las metástasis pulmonares, imágenes digitales de secciones de pulmón de cada uno de los animales (n = 5 por grupo) fueron adquiridos con un microscopio Axioplan 2 (Zeiss, Alemania) utilizando un macro de la casa Metamorph (Molecular Devices, USA), que permite para componer un mosaico de imágenes captadas a 2,5 veces, con enfoque automático y corrección de sombras. Las imágenes fueron analizadas de forma automática con ImageJ y se cuantificó el área ocupada por los nódulos tumorales con respecto a la zona del pulmón no malignas.
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
Para teñir las células cebadas, una solución de azul de toluidina ( 0,1%) se aplicó a las secciones de tejido después de la desparafinación y rehidratación.
para la inmunohistoquímica CD31, la recuperación de antígeno se llevó a cabo por las diapositivas de calentamiento en el microondas durante 20 min en tampón de citrato 10 mM a pH 6. los tejidos fueron entonces se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-CD31 primaria (Dianova, Hamburgo, Alemania) a una dilución de 1:20. A continuación, los portaobjetos se incubaron durante 30 min a TA con un anticuerpo anti-rata de conejo secundario (Dako) a una dilución 1:50 en diluyente de anticuerpo Dako Real (Dako). Los portaobjetos se incubaron a continuación durante 30 min a TA con el EnVision ™ sistema de detección de anti-conejo (Dako). actividad de la peroxidasa se reveló con DAB como se describió anteriormente. Las muestras fueron de contraste con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron con DPX (VWR, Leicestershire, Reino Unido). Para cuantificaciones, 150 imágenes al azar (200x) por grupo experimental (30 por animal) fueron capturadas con un microscopio Leica (Wetzlar, Alemania) equipado con el software de análisis ™. inmunotinción positiva se filtró de la tejido no teñido y se cuantificó con Image J (NIH Image, Bethesda, EE.UU.).
Por inmunofluorescencia, las secciones de tejido se hidrataron y se incubaron con tripsina durante 10 min para la recuperación de antígeno. A continuación, los tejidos se sumergieron en 5% de BSA con 0,1% Triton-X en PBS durante 1 h a TA, para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos. Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados para el marcaje de inmunofluorescencia: anti-F4 /80 (1:200; AbD Serotec, Raleigh, Carolina del Norte, EE.UU.) y anti-CD11b (1:100; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Después de la incubación con los anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche, los portaobjetos se incubaron con AlexaFluor 488 marcado con anticuerpo secundario (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), a contratinción con nuclear 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción y montada con Dako fluorescentes montaje de los medios de comunicación (Dako). La cuantificación de CD11b, F4 /80 y células positivas azul de toluidina se llevó a cabo mediante análisis de imagen asistido por ordenador, usando sistemas de QWin 500IW (Leica Instruments) Leica DMLA y. En tumores primarios, cada muestra se analizó en 5-10 campos ópticos seleccionados al azar y se calculó el porcentaje de células positivas con respecto al número total de células teñidas con DAPI. En los nódulos pulmonares, se contaron las células positivas de forma manual porque nos pareció más fiable en este tipo de lesiones pequeñas, y los datos se expresaron como porcentaje del área del tumor (mm
2).
Para ALDH1A1 inmunotinción, células H460 se cultivaron en portaobjetos de cámara (BD Biosciences) y, cuando confluentes, se fijaron portaobjetos /permeabilizadas en acetona 01:01 /metanol durante 5 min. La peroxidasa endógena se inactivó con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% y los sitios de unión no específicos se bloquearon durante 30 min con suero normal de cabra al 5%. Las células fueron incubadas con el anticuerpo contra ALDH1A1 (BD), a una dilución 1:100, por 2 h a TA y se lavaron en TBS. La detección de anticuerpo primario se llevó a cabo con el sistema anti-ratón Envision (Dako, Glostrup, Dinamarca). actividad de la peroxidasa se reveló con DAB (3,3 '-Diaminobencidina; Dako) y las células fueron counterstained con hematoxilina. Por último, las diapositivas fueron encubrimiento deslizado con glicerol de montaje mediano.
Métodos Estadísticos
Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron examinados con de Student
t
prueba o ANOVA para las variables paramétricas no apareados y la u de Mann-Whitney
T
prueba o de Kruskal-Wallis para las variables no paramétricas no apareados. La normalidad se analizaron con la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos fueron analizados con el programa estadístico SPSS (versión 17.0 para Windows SPSS) y GraphPad Prism 5 (GraphPad). Los valores se expresan como medias ± SEM o SD, y la significación estadística se definió como P & lt; 0,05 (*), P & lt; 0,01 (**), y P & lt;. 0.001 (***)
Resultados
identificación de la Población ALDH + CSC-como en células LLC
Nosotros y otros han demostrado previamente que la medición de la actividad de ALDH es un método apropiado para la identificación de células madre del cáncer de pulmón (CSC) [22] , [23], pero si este marcador se podría utilizar para aislar y caracterizar la población LLC CSC era desconocido. Para evaluar la presencia de esta población en la línea de células LLC en función de su actividad enzimática de ALDH, ensayo Aldefluor seguido por el análisis FACS se llevaron a cabo. Como se muestra en la Figura 1A, la línea celular LLC tuvo un promedio de células positivas ALDH 11,43 ± 0,38%, lo que está en consonancia con los resultados publicados previamente para otras líneas celulares humanas y células primarias de pacientes [5]. El uso de DEAB (un inhibidor de ALDH específica) sirvió como control negativo.
A. La fracción de ALDH + celular (medida por Aldefluor ensayos) representa ~ 11% de las células totales en la línea de células LLC. B. aislada LLC ALDH + células poseen la capacidad de auto-renovación, como se muestra por su capacidad de generar ambas poblaciones ALDH +/- después de 8 días de cultivo, mientras que las células ALDH- sólo dan lugar a células negativas. C. Número de clones generados por las células LLC ALDH + y ALDH- después de la clasificación. La población ALDH + muestra una mayor capacidad clonogénico que su contraparte negativa. D. Número de esferas generadas por las células LLC ALDH +/-. análisis E. QRT-PCR de los niveles de ARNm de ALDH1A1 en células LLC cultivadas en condiciones adherentes, esferas primarias (S1) y esferas de segunda generación (S2). F. quimiorresistencia a paclitaxel de LLC crecido en cualquiera de las condiciones adherentes o en esferas (S1) se midió con un ensayo MTT. IC
50 para células LLC adherentes: 35.8 nM; IC
50 para las esferas LLC S1: & gt; 93,6 nM. Datos y las barras de error: media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05. ** P & lt; 0,01. *** P & lt; 0,001. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces independientes (cada uno de ellos por triplicado).
Las propiedades típicas de CSC incluyen sus capacidades de auto-renovación y diferenciación,
in vivo
tumorigénico potencial y la resistencia a la quimioterapia [24]. Para comprobar estas características en células LLC, lo primero que examinó la capacidad de auto-renovación de la ALDH + población. Después de la clasificación de células ALDH, fracciones de células positivas y negativas se sembraron por separado. Después de 8 días en cultivo, ensayo Aldefluor se llevó a cabo para analizar el fenotipo de la población de células resultante. ALDH Cultured + células fueron capaces de regenerar ambas poblaciones de células positivas y negativas ALDH. Por el contrario, las células cultivadas ALDH- no fueron capaces de generar la ALDH + población (Figura 1B). Este resultado demuestra que sólo las células ALDH + son capaces de reconstituir la población total de células, una propiedad típica de células madre cancerosas. ensayos de MTT revelaron que no hubo diferencias en las tasas de crecimiento entre ALDH + y poblaciones de células ALDH- (Figura S1c). No se encontraron diferencias entre la población parental sin clasificar y ALDH + o poblaciones ALDH- (datos no muestran).
Para comparar el potencial tumorigénico de las células ALDH + y ALDH- LLC, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con GSN 1 × 10
3 o 5 × 10
3 células. Como se muestra en la Tabla 1, se observó el crecimiento del tumor en 3 de 4 ratones después de la inoculación con 1 x 10
células ALDH 3 +, mientras que no se observó crecimiento del tumor en las células ALDH-. Después de la inyección de 5 × 10
3 células ALDH +, 3/4 ratones presentan una masa tumoral con un volumen medio del tumor de 235,3 ± 64,6 mm
3, mientras que sólo 2/4 ratones desarrollaron un tumor pequeño después de la inyección de la ALDH- población (con un volumen tumoral de 27.45 ± 5.47 mm
3).
a continuación, se analizó el potencial clonogénico de las fracciones de células LLC ALDH + y ALDH- en placas a 500 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y cultivándolas en la densidad clonal durante 10 días. células ALDH + dieron lugar a un número significativamente mayor de colonias que las células ALDH- (P & lt; 0,05; Figura 1C), lo que demuestra que las células ALDH + Display aumento de clonogenicidad. La capacidad clonogénico de la línea celular de sus padres fue intermedia entre la ALDH + y fracciones ALDH- (datos no muestran)
células ALDH + producido un mayor número de esferas que las células ALDH-. (P & lt; 0,01; Figura 1D). También se analizó la capacidad de toda la población LLC para formar esferas y de auto-renovación, dando lugar a una población esfera secundaria (S2). Después de 7 días en el suero y el estado libre de adherentes, células LLC formaron esferas primarias (S1). La desagregación de las esferas S1 y la cultura en las mismas condiciones que demostró la formación de un (S2) de la población esfera secundaria. Con el fin de confirmar que las esferas fueron enriquecidos en células madre cancerosas, cuantificamos los niveles de ALDH de ARNm en las células cultivadas en (esferas S1 y S2) condiciones adherentes y no adherentes. Por análisis de QRT-PCR se observó que las esferas S1 tenían significativamente mayor (p & lt; 0,001) Los niveles de ALDH de ARNm que las células cultivadas en condiciones adherentes, y que las esferas S2 también se enriquecieron en la expresión de ALDH (p & lt; 0,05) en comparación con las esferas S1 (figura 1E). Además, el análisis Aldeflour demostró un mayor número de células ALDH + en esferas (34,2% ± 6,56%) que en las células cultivadas en condiciones adherentes (11,43 ± 0,38%) (Figura 1D Suplemmentary y la Figura 1a). Por lo tanto, estos experimentos confirmaron que las esferas anoikis resistentes contenían una población enriquecida ALDH + CSC-como que era capaz de someterse a la auto-renovación.
Otra característica de células madre cancerosas es su resistencia a los agentes quimioterapéuticos convencionales. Por lo tanto, se utilizó el paclitaxel, un fármaco comúnmente usado contra el NSCLC, para evaluar la quimio-resistencia de las células LLC cultivadas en esferas o en condiciones adherentes. Como se muestra en la Figura 1F, células LLC cultivadas como esferas exhibieron mayores tasas de supervivencia cuando se trataron con diferentes dosis de paclitaxel que las células cultivadas en condiciones adherentes. El IC
50 valores para ambas poblaciones de células fueron significativamente (p & lt; 0,01) diferente: IC
50 para células LLC adherentes era 38,5 nM y & gt; 93,6 nM para las esferas LLC derivados (Figura 1f). Para determinar si las células derivadas-S1 correspondían a la ALDH + población con mayor resistencia a paclitaxel, se analizaron por Aldefluor el porcentaje de ALDH + células en esferas siguientes de tratamiento de drogas. Inesperadamente, no se observó un aumento significativo en el porcentaje de células ALDH + en respuesta a paclitaxel en el modelo de LLC en condiciones de cultivo esfera. Sin embargo, como describiremos más adelante, este fenómeno fue evidente en los modelos de NSCLC humanos, apoyando la premisa de que las células derivadas-S1 incluyen ALDH paclitaxel resistente + células. Tomados en conjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que la ALDH + fracción de células LLC corresponde a una población CSC resistente a los medicamentos.
Efecto diferencial de la salinomicina y paclitaxel focalización del CSC vs No-CSC Poblaciones
después de haber demostrado que la línea celular LLC tiene una ALDH + subpoblación con CSC características, hemos querido estudiar el efecto de la salinomicina, un compuesto identificado recientemente que inhibe selectivamente las células madre del cáncer de mama humano
in vitro
[13] . Se comparó el efecto de la salinomicina con la de paclitaxel en poblaciones CSC frente a no-CSC.
Para la posterior
in vitro
experimentos, se trataron células LLC con 1 mg /ml o 40 ng salinomicina /paclitaxel ml, lo que les permite recuperarse durante 24 horas en ausencia del fármaco. Para determinar los efectos específicos de la salinomicina y paclitaxel en las poblaciones de células ALDH +/-, ensayos Aldefluor seguido por análisis de FACS se llevó a cabo. Después de la clasificación de células, las células ALDH positivos y negativos se sembraron por separado y se administran con salinomicina (1 mg /ml) o paclitaxel (40 ng /ml) durante 72 horas y la viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MMT. Como se muestra en la Figura 2A, la supervivencia de las células ALDH + después de salinomicina tratamiento fue significativamente menor que la de las células ALDH- (p & lt; 0,05). Por el contrario, después de la supervivencia del tratamiento con paclitaxel de células ALDH + no fue afectada, mientras que sólo el 67,7% de células ALDH- estaban vivos (p & lt; 0,05). Estos resultados muestran que la salinomicina es altamente citotóxico para las células ALDH + paclitaxel, pero afecta a la población negativa ALDH.
A. Barra de escala = 20 micras. ** P & lt; 0,01. ** P & lt; 0,01.