Extracto
Las expresiones de las diferentes isoformas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) están asociados con el grado de invasión tumoral y el pronóstico del paciente en los cánceres humanos. La hipótesis de que las diferentes isoformas de VEGF pueden ejercer diferentes efectos en las características funcionales y estructurales de la angiogénesis tumoral. Utilizamos mejorada de contraste dinámico de resonancia magnética (RM-RT) y en estado estacionario con contraste de resonancia magnética (RM-SSCE) para evaluar
in vivo
funciones vasculares (por ejemplo, la perfusión y la permeabilidad) y las características estructurales (por ejemplo, tamaño vascular y densidad de los vasos) de la angiogénesis del tumor inducida por diferentes isoformas de VEGF (VEGF121, VEGF165, VEGF189 y) en un modelo de xenoinjerto murino de cáncer de pulmón humano. Los tumores que sobreexpresan VEGF189 eran más grandes que las que sobreexpresan las otras dos isoformas de VEGF. El
K
mapa trans obtenida de DCE-MRI reveló que las funciones de perfusión y la permeabilidad de los microvasos tumorales fue mayor tanto en las regiones de borde y centrales de tumores que sobreexpresan VEGF189-(
p
& lt; 0,001 tanto para el borde del tumor y el núcleo). La densidad de los vasos relativa y el tamaño del vaso índices relativos derivados de SSCE-MRI reveló que los tumores que sobreexpresan VEGF189-tenían la más pequeña (
p Hotel & lt; 0,05) y la más alta densidad (
p Hotel & lt; 0,01) microvasos, que penetraron profundamente desde el borde del tumor en el núcleo, seguido por el tumor VEGF165-overepxressing, cuyo microvasos se localizaron principalmente en el borde del tumor. Los microvasos de menor densidad se encuentran en el tumor que sobreexpresa VEGF 121; estos microvasos tenían un lumen relativamente grande y se encuentran principalmente en el borde del tumor. Llegamos a la conclusión de que entre las tres isoformas del VEGF evaluadas, VEGF189 induce los microvasos tumorales más densamente brotación y el más pequeño con la perfusión en Destinia.com funciones y permeabilidad in vivo más alto
. Estas características de los microvasos tumorales pueden contribuir a los efectos adversos reportados del sobreexpresión VEGF189 en la progresión tumoral, metástasis y supervivencia de los pacientes en varios cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y sugieren que la aplicación de una terapia agresiva puede ser necesaria en los cánceres humanos en VEGF189, que se sobreexpresa
Visto:. Un Yuan, Lin CY, Chou CH, Shih CM, Chen CY, Cheng HW, et al. (2011) Características funcionales y estructurales de la angiogénesis tumoral en el cáncer de pulmón que sobreexpresan diferentes isoformas de VEGF evaluadas por DCE- y SSCE-RM. PLoS ONE 6 (1): e16062. doi: 10.1371 /journal.pone.0016062
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Agosto, 2010; Aceptó 7 de diciembre de 2010; Publicado: 20 de enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio es financiado por el Consejo Nacional de Ciencia (http://web1.nsc.gov.tw), el número de concesión NSC 98-3112-B-001-019. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción se requiere
angiogénesis para el crecimiento tumoral y la metástasis [1], [2], y se ha demostrado que la actividad de la angiogénesis tumoral alta se asocia con el crecimiento avanzado tumor, metástasis a distancia, y un pronóstico adverso en los cánceres humanos [ ,,,0],3], [4]. factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un factor de angiogénesis potente, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas, y puede inducir la angiogénesis tumoral [5], [6]. El gen humano VEGF (
VEGF-A
), que se encuentra en el cromosoma 6p, contiene ocho exones [7]. El empalme alternativo del gen de VEGF da lugar a múltiples isoformas. Tres isoformas principales del VEGF-A (VEGF121, VEGF165 y VEGF189) se expresan en una variedad de tejidos humanos y de las muestras de tumor [5], [8], y tienen propiedades bioquímicas diferenciales y funciones biológicas en la angiogénesis fisiológica [9] - [13 ].
Las funciones biológicas de diferentes isoformas de VEGF-A en la angiogénesis patológica, tales como la angiogénesis tumoral, aún no están claros. Varios estudios, incluyendo nuestro estudio anterior, han demostrado que la expresión de VEGF189 en un tumor se asocia fuertemente con un alto número de tumores de microvasos, la metástasis del cáncer y la supervivencia a corto paciente en varios cánceres humanos [14] - [16], y con la alta xenotransplantability de varias células de cáncer humano en ratones [17]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de estas actividades siguen siendo desconocidos. Pocos estudios han evaluado el papel de las diferentes isoformas principales del VEGF en la determinación de las funciones de la microvasculatura tumoral y en la facilitación de la tumorigénesis y metástasis tumoral a través de la angiogénesis tumoral.
dinámico con contraste de resonancia magnética (RM-RT) con la utilización de medio de contraste T1 Magnevist (Gd-DTPA, MW: 938 Dalton), es capaz de proporcionar un parámetro vascular funcional, la constante de transferencia vascular (
K
trans), lo que da una medida de la perfusión y la permeabilidad de los vasos [18] - [21]. Además, el estado de equilibrio con contraste de resonancia magnética (RM-SSCE) en combinación con el agente T2, Resovist (óxido de hierro súper paramagnético (SPIO) partículas, tamaño: 45-60 nm), puede proporcionar información estructural sobre la microvasculatura, a saber, la relativa índice de densidad de los vasos (rVDI) y el índice del tamaño del barco relativa (RVSI) [22] - [26]. MRI está emergiendo por lo tanto rápidamente como un método prometedor para la evaluación de la perfusión vascular y la permeabilidad, y la densidad de microvasos (MVD) y el tamaño
in vivo
en varios cánceres humanos [27] - [30].
la hipótesis de que las diferentes isoformas de VEGF pueden inducir la angiogénesis tumoral con diferentes funciones biológicas. Por lo tanto, hemos utilizado DCE- y SSCE-MRI para evaluar las características funcionales y estructurales de la angiogénesis tumoral en los cánceres de pulmón que sobreexpresan una de las tres isoformas de VEGF solo diferentes (VEGF121, VEGF165, VEGF189 o) en un modelo de xenoinjerto murino. El objetivo de este estudio fue comprobar si
K
trans, rVDI, y RVSI de la angiogénesis tumoral fue diferente entre los tumores de pulmón que sobreexpresan una de las tres diferentes isoformas del VEGF. Los resultados ayudarán a dilucidar el papel de diferentes isoformas de VEGF en la inducción de la angiogénesis tumoral, la interacción entre la estructura y función de la angiogénesis tumoral, y los mecanismos que subyacen a la asociación entre la expresión de una isoforma de VEGF específica en un tumor y el resultado clínico del paciente en los cánceres humanos.
resultados
Generación de líneas celulares estables que expresan CL1-0 diferentes isoformas del VEGF
La línea celular de cáncer de pulmón padres CL1-0 fue establemente transfectadas con VEGF 121, VEGF165, VEGF189 o isoforma de ADNc o el vector vacío (transfectadas de forma simulada). Se analizaron alrededor de 20 clones de cada célula VEGF-isoforma-expresión, y un panel (es decir, VEGF121-3, VEGF165-C12, y VEGF189-A3) se seleccionan en última instancia, para los experimentos, ya que mostraron niveles similares de expresión VEGF isoforma. El mRNA isoforma VEGF recombinante expresada por cada clon fue confirmada por tiempo real RT-PCR cuantitativa. La proteína recombinante también fue confirmado por Western Blot (Fig. 1A), con los pesos moleculares esperados son de 18 kDa (VEGF 121) expresado, 23 kDa (VEGF 165), y 26 kDa (VEGF189). La cantidad de cada isoforma de VEGF en el sobrenadante del cultivo, según lo determinado por ELISA, fue 1,14 × 10
2 a 2,9 × 10
2 ng /célula en un período de 48 h. El VEGF isoformas nivel de expresión
in vivo
en los tumores implantados determinados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR fue similar entre los tumores que sobreexpresan una de las tres isoformas del VEGF (p = 0,953, ANOVA de una vía) (fig. 1B ).
A. transferencias Western de VEGF expresión de la proteína isoforma de lisado celular de células de cáncer de pulmón CL1-0 humanos individuales transfectadas con diferentes construcciones de isoformas del VEGF. Cada proteína VEGF isoforma compone uno glucosilada (superior) y una proteína no glicosilada (inferior). Tubulina se utilizó como control interno. B. La cuantificación de la expresión de ARNm de VEGF
in vivo
en los implantes tumorales por cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa. El nivel de expresión de VEGF isoforma fue similar entre líneas celulares de cáncer de pulmón CL1-0 que sobreexpresan una de las tres isoformas del VEGF (p = 0,953, ANOVA de una vía).
Los volúmenes tumorales y curvas de crecimiento del VEGF Los tumores que sobreexpresan isoforma, según lo medido por T2WI
Los volúmenes de VEGF121-, VEGF165-, y VEGF189- sobreexpresan tumores, como se determina en las imágenes ponderadas en T2 (Fig. 2) se incrementaron desde el día 7 al día 35 después de la inoculación, mientras que los tumores simulados no mostraron ningún aumento significativo en el volumen del tumor (el tumor simulado indica el tumor derivado de línea celular de cáncer de pulmón CL1-0 transfectadas con un vector vacío). La curva de crecimiento tumoral mostró que los tumores que sobreexpresan VEGF189- y VEGF165- crecieron más rápido que los otros (
n = 6
,
p Hotel & lt; 0,0001 por ANOVA de dos vías; todo
p & lt
valores; 0,001 por Fisher
post hoc
prueba; Fig. 3). La curva de crecimiento también mostró que el VEGF189- y tumores que sobreexpresan VEGF165-crecieron rápidamente y de manera exponencial después de día 21 (
p
& lt; 0,05, por Fisher de
post hoc
prueba; Fig. 3).
El crecimiento del tumor de las células cancerosas que sobreexpresan CL1-0 una de las tres isoformas del VEGF en diferentes puntos temporales en ratones SCID, estimada a partir de T2WI. #, VEGF189 VEGF121 contra los tumores y simulacros; +, Frente VEGF165 VEGF121 y los tumores simulados; *, La comparación entre los diferentes tumores de isoformas que expresan y simuladas. Las diferencias entre los tumores que sobreexpresan VEGF y tumores simulados fueron significativas en el
p Hotel & lt; 0,05 (un símbolo),
p Hotel & lt; 0,01 (dos símbolos),
p
& lt; 0,001 (tres símbolos), y
p
. & lt; 0,0001 niveles (cuatro símbolos) guía empresas
al final del día 35, los volúmenes de los xenoinjertos de tumores fueron 141,1 ± 22.4 mm
3, 610,8 ± 87,8 mm
3, y 738,0 ± 116,1 mm
3 para el VEGF121-, VEGF165-, y VEGF189 tumores que sobreexpresan, respectivamente, mientras que la del simulacro de xenoinjerto de tumor fue de 37,4 ± 7,9 mm
3. Los volúmenes de la VEGF165- y tumores VEGF189 que sobreexpresan el día 35 fueron significativamente mayores que los de los tumores transfectadas de manera simulada y VEGF 121 que sobreexpresan (Fig 3;. Toda
p Hotel & lt; 0,001 por Fisher de
post hoc
prueba). El volumen del tumor VEGF189 con sobreexpresión tendía a ser mayor que la del tumor que sobreexpresa VEGF 165, pero la diferencia no alcanzó significación estadística.
perfusión y la permeabilidad de los microvasos tumorales evaluadas por la
K
mapa trans en la RM-RT
Figura 4A muestra lo temporal
K
mapa trans para los tres tumores VEGF-isoforma-sobreexpresan desde el día 7 hasta el día 35. varios patrones angiogénicos de
K
trans se observaron en los diferentes tumores que sobreexpresan VEGF y simulacros. En el día 35, el
K
se observó señal de trans principalmente en el borde del tumor en los tumores transfectadas de manera simulada y VEGF 121 que sobreexpresan, mientras que en el tumor que sobreexpresa VEGF 165, el
K
señal de trans se encuentran principalmente en el borde, con algunos en el núcleo. Una cantidad sustancial de la señal que se extiende desde el borde hasta el núcleo se observó en el tumor que sobreexpresa VEGF189.
En vivo
temporal
K
mapa trans y cuantitativa curva para xenoinjertos de tumores de células cancerosas que sobreexpresan CL1-0 una de las tres isoformas de VEGF en diferentes puntos de tiempo, evaluada por DCE-MRI. (A) Representante
K
mapa de color trans en los diferentes tumores que sobreexpresan VEGF-y-transfectadas de manera simulada (dentro del círculo de puntos) en diferentes momentos, desde el día 7 al día 35 después de la implantación. El color varió de azul (0 /min, bajo
K
trans) a rojo (0,8 /min, más alto
K
trans). B) Análisis cuantitativo de
K
valores de trans largo del tiempo en las regiones de todo el tumor (superior), el borde del tumor (en el centro), y el núcleo del tumor (inferior). #, VEGF189 frente a otras isoformas y los tumores simulados; +, VEGF165 frente a VEGF121 y tumores simulados. Las diferencias entre los tumores que sobreexpresan VEGF y tumores simulados fueron significativas en el
p Hotel & lt; 0,05 (un símbolo),
p Hotel & lt; 0,01 (dos símbolos),
p
& lt; 0,001 (tres símbolos), y
p Hotel & lt; 0,0001 (cuatro símbolos) los niveles. (C)
K
valores trans en el día 35 en el borde del tumor (superior) y el núcleo del tumor (en el centro), y la relación de
K
valores de trans entre la núcleo del tumor y el tumor de llanta (inferior). Las diferencias entre los tumores que sobreexpresan VEGF y tumores simulados fueron significativos al *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001, y ****
p
. & lt; 0,0001 niveles
el cambio temporal en la
K
valores trans en todo el, borde, y el núcleo de tumor aumentó significativamente después día 14 en el VEGF189- y tumores que sobreexpresan VEGF165, mientras que no hubo aumento significativo en
K
valores trans para los tumores transfectadas de manera simulada y VEGF121 sobreexpresan (Fig . 4B). El temporal
K
curvas trans fueron significativamente mayores en los tumores que sobreexpresan VEGF189-en todo el tumor (Fig. 4B, parte superior), el borde del tumor (Fig. 4B, centro), y el núcleo del tumor (Fig . 4B, menor) que en los otros (todo el
p Hotel & lt; 0,001 por
post hoc
test de Fisher)
en el día 35, el
K
valores trans en el borde y el núcleo de los tumores fueron 0,25 ± 0,07 /min y 0,06 ± 0,03 /min, respectivamente, para los tumores que sobreexpresan VEGF121-, 0,53 ± 0,08 /min y 0,28 ± 0,05 /min para VEGF165- sobreexpresa tumores, 0,88 ± 0,1 /min y 0,66 ± 0,12 /min para los tumores que sobreexpresan VEGF189-, y 0,19 ± 0,05 /min y 0,06 ± 0,02 /min para xenoinjertos de tumores simulados (Fig. 4C).
K
trans el día 35 fue significativamente mayor en los tumores que sobreexpresan VEGF189-que en los otros tres tipos (todo el
p Hotel & lt; 0,01 para la llanta y
p
& lt; 0,001 para el núcleo de Fisher por
post hoc
prueba; Fig. 4C, superior, medio). La relación núcleo /borde de
K
trans en los tumores VEGF189 que sobreexpresan el día 35 fue de 0,73 ± 0,09, que fue significativamente mayor que los de la VEGF165- (0,53 ± 0,03) y VEGF121- (0,26 ± 0,08), los tumores que sobreexpresan y en los xenoinjertos tumorales maqueta (0,25 ± 0,05;
p Hotel & lt; 0,05,
p Hotel & lt; 0,0001 y
p Hotel & lt; 0,0001, respectivamente, por
post hoc
test de Fisher). Esto indica que la señal de la
K
mapa trans se distribuye más profundamente desde el borde de las regiones centrales de los tumores que sobreexpresan VEGF189-(Fig. 4C, inferior).
características estructurales vasculares de la angiogénesis tumoral evaluados por el rVDI y RVSI en SSCE-RM
Figura 5A y B muestran mapas representativos de rVDI y RVSI, respectivamente, en los tumores simuladas y las diferentes VEGF sobreexpresan en el día 36. la mapa rVDI muestra sólo unas pocas señales de densidad de los vasos esparcidos en el borde del tumor en un tumor transfectadas de manera simulada. El tumor VEGF189-overexpressing muestra una alta densidad de microvasos distribuidos desde el borde hasta el núcleo del tumor. Por el contrario, el tumor VEGF121 con sobreexpresión exhibe una baja densidad de microvasos que se limita a la llanta, y el tumor VEGF165 con sobreexpresión tiene un mixto de baja densidad y alta de microvasos que se distribuye principalmente en el borde, con algunos en el núcleo ( Fig. 5A). Como se muestra en el panel superior de la figura. 5C, la rVDI de todo el tumor fue mayor en los tumores que sobreexpresan VEGF189-(0,26 ± 0,03 /s
1/3), intermedia en los tumores que sobreexpresan VEGF165-(0,17 ± 0,01 /s
1/3), y más bajo en VEGF121 sobreexpresan (0,11 ± 0,01 /s
1/3) y transfectadas de manera simulada (0,07 ± 0,02 /s
1/3) tumores (todos los
p Hotel & lt; 0,01 por Fisher de
post hoc
prueba). Tanto en el borde y el núcleo, los tumores que sobreexpresan VEGF189-exhibieron los valores más altos rVDI entre todos los tumores VEGF-isoforma sobreexpresan y simulacros de infectados (Fig. 5C, medias y paneles inferiores).
En vivo
rVDI y RVSI mapas y curvas cuantitativos para xenoinjertos de tumores de células cancerosas que sobreexpresan CL1-0 una de las tres isoformas del VEGF, evaluados por SSCE-RM. Los mapas de representación de alta resolución de la (A) rVDI y (B) RVSI en los diferentes tumores que sobreexpresan VEGF y simulacros en el día 36 después de la implantación del tumor. En el mapa rVDI, el color azul varió de 0 (S
-1/3, rVDI más bajo) a rojo (0,4 S
-1/3, más alto rVDI). En el mapa RVSI, el color varió de azul (0, RVSI más bajo) a rojo (30, más alto RVSI) Análisis .Quantitative de (C) rVDI y (D) RVSI en todo el tumor (superior), el borde del tumor (en el centro), o núcleo del tumor (inferior). Las diferencias entre los tumores que sobreexpresan VEGF y tumores simulados fueron significativos al *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001, y ****
p
. & lt; 0,0001 niveles
el mapa muestra RVSI unas cuantas señales en el borde del tumor en el tumor simulado. El mapa RVSI también indica que los microvasos tumorales eran casi todos los grandes vasos en los tumores VEGF 121 que sobreexpresan (en el borde), se mezcló grandes y pequeños en los tumores VEGF165 sobreexpresan (principalmente en el borde con algunos en el núcleo), y casi todos los pequeños en los tumores que sobreexpresan VEGF189-(desde el borde hasta el núcleo; Fig. 5B).
Como se muestra en el panel superior de la figura. 5D, la RVSI de todo el tumor fue mayor en los tumores VEGF 121 que sobreexpresan (37,24 ± 4,88), intermedia en los tumores VEGF165 sobreexpresan (28,84 ± 1,46), y la más baja en el VEGF189 sobreexpresan (18,82 ± 2,27) y la maqueta ( 9,84 ± 2,25), los tumores (todos los
p Hotel & lt; 0,05 por
post hoc
test de Fisher). Tanto en el borde y el núcleo, el tumor que sobreexpresa VEGF189 tuvo la menor RVSI entre los tumores VEGF-isoforma sobreexpresan (Fig. 5D, medias y paneles inferiores).
fenotipo angiogénesis de tumores que sobreexpresan distintas isoformas del VEGF por tinción inmunohistoquímica
a baja potencia (Fig. 6A, × 100), la tinción inmunohistoquímica reveló un pequeño número de microvasos distribuidos en la periferia de los nidos tumorales de los tumores simulados, y microvasos tumorales más densas distribuido principalmente en el periferia de los nidos tumorales o células tumorales en el VEGF121- y los tumores que sobreexpresan VEGF165. En los tumores VEGF189 sobreexpresan, microvasos muy densas se observaron tanto en el borde y en el núcleo.
angiogénesis fenotipos de microvasos evaluados por tinción inmunohistoquímica de xenoinjertos de tumores que sobreexpresan diferentes isoformas de VEGF. (A) La tinción inmunohistoquímica de microvasos tumorales (de color marrón, × 100 en el panel principal, × 400 en el recuadro) en xenoinjertos tumorales. (B) La densidad de microvasos fue mayor en los tumores VEGF189 sobreexpresan, intermedia en los tumores que sobreexpresan VEGF165, y más baja en los tumores VEGF 121 que sobreexpresan. (C) El número de vasos con un diámetro mayor que 15 micras en la sección del tumor en el xenoinjerto de tumor fue mayor en los tumores VEGF 121 que sobreexpresan, intermedia en los tumores que sobreexpresan VEGF165, y menor en los tumores que sobreexpresan VEGF189-. Las diferencias entre los tumores que sobreexpresan VEGF y simulados fueron significativos al *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001 y ****
p
. & lt; 0,0001 niveles
a alta potencia (Fig. 6A, × 400, placa), los tumores VEGF 121 que sobreexpresan tenían más grandes con microvasos lúmenes dilatadas, además de los microvasos de pequeña lumen, y tumores que sobreexpresan VEGF165-tenían microvasos de tamaño intermedio. En cambio, en el VEGF189-overexpressing y los tumores transfectadas de manera simulada, casi todos los microvasos tenía un pequeño lumen.
MVD y el número de grandes microvasos en xenoinjertos de tumores en la tinción inmunohistoquímica
Como se muestra en la Fig. 6B, el MVD medida a partir de la tinción inmunohistoquímica de CD31 fue más alta en los tumores VEGF189 sobreexpresan (100.00 ± 13.30 /mm
2), intermedia en los tumores VEGF165 sobreexpresan (70,66 ± 6,84 /mm
2), y la más baja en VEGF121 sobreexpresan (40.07 ± 10.15 /mm
2) y transfectadas de manera simulada (29.98 ± 4.24 /mm
2) tumores (todos los
p Hotel & lt; 0,05 por Fisher de
post hoc
prueba).
Como se muestra en la Fig. 6C, el número de vasos con un diámetro mayor que 15 micras en la sección del tumor en el xenoinjerto de tumor fue mayor en los tumores VEGF 121 que sobreexpresan (13,21 ± 0,95 /mm
2), intermedia en los tumores VEGF165 sobreexpresan (8.58 ± 1.11 /mm
2), y la más baja en VEGF189 sobreexpresan (5,58 ± 0,76 /mm
2) y transfectadas de manera simulada (3,21 ± 0,47 /mm
2) tumores (todo el
p & lt
; 0,05 por
post hoc
test de Fisher)
Discusión
Es mucho lo que se explicará acerca de las anormalidades vasculares asociados a tumores.; Por lo tanto, la recogida de datos más completos sobre los cambios en la estructura microvascular angiogénico y la función puede facilitar la comprensión de los mecanismos subyacentes a la angiogénesis del tumor y por lo tanto proporcionar implicaciones terapéuticas. El
K
trans, parámetros rVDI, y RVSI obtenidos por DCE- y SSCE-RM son capaces de proporcionar datos sobre la perfusión vascular y la permeabilidad, densidad de los vasos, y el tamaño del buque, respectivamente. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que han utilizado resonancia magnética con contraste para evaluar las características funcionales y estructurales de microvasos tumorales inducidas por diferentes isoformas del VEGF
in vivo
, ya han correlacionado la funcional y características estructurales de la angiogénesis en tumores VEGF-isoforma sobreexpresan.
Las diferentes isoformas de VEGF según los informes exhiben diferentes propiedades bioquímicas. VEGF121 es una proteína ácida más corto, no de unión a heparina y es libremente difusible, mientras que VEGF165 y VEGF189 se pueden unir la heparina y los proteoglicanos heparán sulfato (HSPGs) [13]. VEGF189 se asocia frecuentemente con la superficie de la célula y la matriz extracelular, mientras que VEGF165 es a la vez una proteína secretada y es HSPG asociado a [13]. VEGF165 y VEGF189 cada uno tiene diferentes afinidades por diferentes correceptores, tales como neuropilina 1 y neuropilina 2, y para HSPGs, tales como sindecano [14]. Estudios recientes han demostrado que las diferentes isoformas de VEGF pueden inducir la angiogénesis del tumor que presenta diferentes características morfológicas [31] - [34]. VEGF121- y microvasos tumorales VEGF165 inducida se asociaron con la vasodilatación, la erupción de los microvasos, y hemorragia [32]. Por el contrario, VEGF189 puede inducir la angiogénesis tumoral intensa que consiste en microvasos pequeños, recién formados [31], [33]. En este estudio, los datos de SSCE-RMN fueron consistentes con estos hallazgos morfológicos. Además, demostró que diferentes isoformas de VEGF pueden inducir microvasos con diferentes
in vivo
funciones vasculares, y que la angiogénesis inducida por VEGF189 en los cánceres de pulmón se caracteriza por las más altas características de perfusión y de permeabilidad. Estos resultados sugieren que VEGF189 puede inducir a los microvasos tumorales más pequeños brotación más densos y que tienen las más altas características de perfusión y la permeabilidad entre los tres tumores VEGF-isoforma sobreexpresan examinados.
Los mecanismos moleculares y biológicos exactos que subyacen a la diferente características morfológicas y funcionales de la angiogénesis tumoral inducidos por diferentes isoformas del VEGF siguen sin estar claros; Se requiere más investigación para aclarar esto. Algunas investigaciones recientes han proporcionado explicaciones posibles para estas diferencias. Ruhrberg
et al.
Mostró que en el
VEGF
188/188
cerebro de ratón, hubo un aumento en las extensiones filopodios endoteliales, lo que puede conducir a un aumento vascular de ramificación y el brote de la angiogénesis [ ,,,0],35]. Por el contrario, VEGF121 se demostró que carecen de la capacidad para inducir la germinación de la angiogénesis [35], pero sólo coopta vasos preexistentes peritumoral e induce la vasodilatación. Nuestros datos proporcionan pruebas de resonancia magnética sólida de las diferencias de comportamiento biológico de las células endoteliales estimuladas por diferentes isoformas del VEGF
in vivo
en la angiogénesis tumoral. También hay evidencia de que la señalización molecular difiere entre estas isoformas. VEGF165 y VEGF189 se pueden unir a correceptores de VEGF, tales como neuropilina 1 y HSPG, y estos enlaces puede modificar la señalización de VEGF en las células endoteliales, el control de la biodisponibilidad de VEGF a receptores de VEGF [36] - [38]. Las actividades de VEGF189 en la translocación nuclear [34] y la interferencia de las vías de señalización de VEGF-con integrinas [39] también pueden afectar a las funciones biológicas de diferentes isoformas de VEGF en la angiogénesis tumoral. El diferencial de células funciones biológicas y transducción de señales moleculares también se traducen en los diferentes
in vivo
morfológica y características funcionales de la angiogénesis tumoral inducidos por diferentes isoformas del VEGF en los cánceres humanos.
K
mapeo trans reveló que el
K
trans de los microvasos fueron más altos en los tumores VEGF189 sobreexpresan. La alta
K
valor trans de los tumores que sobreexpresan VEGF189-puede ser atribuible a la mayor densidad de microvasos que penetran profundamente desde el borde hasta el núcleo del tumor, que puede proporcionar una función de alta perfusión vascular. Estudios anteriores demostraron que VEGF189 puede mejorar la permeabilidad vascular de los vasos de la piel y la proliferación de vasos intratumorales, tal como se evaluó mediante el ensayo de la permeabilidad vascular y Milla Ig G tinción [13], [31]. Nuestros datos son consistentes con estos resultados, y sugieren que el aumento de la permeabilidad puede contribuir a la más alta
K
valor trans observado en tumores VEGF189 sobreexpresan. Además, nuestro informe anterior ha demostrado que el flujo sanguíneo (Fρ), la permeabilidad microvascular (PSρ) y el volumen de sangre (Vb) determinada por RM-RT se incrementaron significativamente en todos los tumores que sobreexpresan VEGF isoforma 189 [40]. Tozer
et al.
Recientemente demostró que VEGF188 ratón puede inducir microvasos estrechos con la mayor longitud de los microvasos, la resistencia a la hemorragia y la resistencia a la terapia antiangiogénico, pero se asocia con la madurez vascular del tumor [34]. Esto puede surgir de diferentes líneas celulares que se utilizará para sobreexpresan la isoforma VEGF (línea celular de fibrosarcoma vs línea celular de adenocarcinoma de pulmón), diferente del método de ensayo y diferente modelo utilizado. Sin embargo, ambos estudios mostraron los diferentes isoforma VEGF tiene una función diferente y esto puede determinar las diferentes características de microvasos en los tumores en diferentes órganos. Aunque los tumores VEGF 121 que sobreexpresan tienen diámetros mayores de microvasos, como lo demuestra la alta RVSI, el
K
valor trans correspondiente es baja. Esto puede indicar que
K
trans depende principalmente de la rVDI en lugar de la RVSI. La relación precisa entre
K
trans y RVSI o rVDI puede ser difícil de determinar debido a la complicada fisiología microambientales tumor con sobreexpresión de diferentes isoformas del VEGF. Sin embargo,
K
trans se ha demostrado previamente para ser asociado con la densidad de vasos. Los datos anteriores también han demostrado que la estasis de la sangre se producirá en los espacios vasculares dilatados y tortuosos.
Debido a que VEGF121 es un más corto, de no unión a heparina proteína ácida que es libremente difusible, se secreta a partir de células de el ambiente exterior una vez que se sintetizan. La cantidad de proteína VEGF121 permanecido en la celda se supone que es menor en comparación con otras isoformas de VEGF que tienen mayor proporción de proteínas de VEGF en las células restantes. Por lo tanto, la densidad de la banda de proteína VEGF121 en Western blot obtenido a partir de lisado de células de células de cáncer CL1-0 no puede soportar por la cantidad total de proteínas sintetizadas VEGF121 o la cantidad que se secretan al medio ambiente. Hemos cuantificó la cantidad de isoformas de VEGF que son secretadas de las células en el sobrenadante por ELISA, y los resultados mostraron que la cantidad de proteína VEGF121 en el sobrenadante fue similar a la cantidad de los otros dos isoformas de VEGF. Además, su cuantificación aún más el nivel de expresión de VEGF
in vivo
en los implantes tumorales resecados de ratones SCID utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR, y el resultado mostró el nivel de expresión de VEGF isoforma fue similar entre los tumores de líneas celulares de cáncer de pulmón CL1-0 que sobreexpresan una de las tres isoformas de VEGF (p = 0,953, ANOVA de una vía) (Fig. 1B). Por lo tanto, las diferencias en el crecimiento del tumor y las propiedades angiogénicas entre isoformas de VEGF en este estudio son debido a diferentes funciones de las isoformas de VEGF, en lugar de como resultado de la diferente nivel de expresión de VEGF entre las diferentes isoformas de VEGF en tumores.
En nuestro estudio, la angiogénesis inducida por VEGF189 tuvo el mayor MVD, penetrado profundamente desde el borde del tumor al núcleo del tumor, y tenía las más altas funciones de perfusión y la permeabilidad entre los tres tipos de tumores VEGF-isoforma sobreexpresan diferentes. Sin embargo, el tamaño del tumor no difirió significativamente entre VEGF165- y tumores VEGF189-overepxressing. Se observó la viabilidad de los tumores utilizando técnicas de inmunohistoquímica y tinción de hematoxilina-eosina, y hemos encontrado que la necrosis central es mayor para los tumores que sobreexpresan VEGF165-que para los tumores VEGF189 sobreexpresan. Esto indica que a pesar de tener volúmenes tumorales totales similares, la parte viable del tumor es más grande en VEGF189- que en los tumores que sobreexpresan VEGF165. Esto también implica que los microvasos VEGF189 inducida funcionan mejor que los microvasos VEGF165 inducida en el mantenimiento de la viabilidad de los tumores.
Clínicamente, una asociación se ha encontrado entre la expresión de diferentes isoformas de VEGF en tumores humanos y las diferentes características clínico-patológicos y el resultado del paciente. Tokunaga
et al.
[14], [41] demostraron que en pacientes con cáncer de colon, los tumores con expresión VEGF189 mRNA tienen una mayor incidencia de metástasis de hígado, una mayor participación de las venas, y están asociados con un paciente más pobre pronóstico que los que carecen de la expresión de VEGF189 mRNA. En nuestro propio estudio [15] y otros [14] - [16], [41], [42], una expresión alta de tumores de VEGF189 se correlacionó significativamente con tumores grandes, estadio clínico avanzado y metástasis sistémica, y era una organización independiente factor de pronóstico en el cáncer colorrectal, de células renales y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Además, Tokunaga
et al.
[17] mostró que la expresión de VEGF189 se asocia con el aumento de la xenotransplantability de cáncer de esófago humano en la piel de ratones. En el presente estudio, el DCE-MRI reveló una alta función de la perfusión y la permeabilidad de los microvasos tumorales, y SSCE-resonancia magnética reveló una muy alta densidad de microvasos pequeñas que penetran desde el borde del tumor hasta la médula en los tumores VEGF189 sobreexpresan. Estas características de la angiogénesis tumoral pueden proporcionar un buen suministro de nutrientes y O
2 para el crecimiento del tumor, y los microvasos, densas altamente permeables pueden facilitar la metástasis de las células cancerosas. Estas características funcionales y estructurales específicos de la angiogénesis tumoral VEGF189 inducida pueden contribuir al aumento de la tumorigénesis informado, la alta incidencia de metástasis sistémica y pronóstico adverso de los pacientes y el alto xenotransplantability de los cánceres humanos que sobreexpresan VEGF189 [14] - [17], [ ,,,0],41], [42].
Uno de los métodos tradicionales utilizados para evaluar la angiogénesis tumoral es una técnica histológica llamada MVD contando en las secciones de las muestras de tumor.