Extracto
Objetivos
La invasión y la metástasis son las razones principales de muerte por cáncer de páncreas y la identificación de moléculas de señalización que se utilizan específicamente en la invasión tumoral es de gran importancia. El propósito de este estudio fue determinar el papel de GEP100 en la invasión de células de cáncer de páncreas y metástasis y el mecanismo molecular correspondiente.
Métodos
Las líneas celulares estables con GEP100 derribado se establecieron mediante la transfección GEP100 shRNA vector en células PaTu8988 y seleccionados por puromicina. QRT-PCR y Western blot se realizaron para detectar la expresión de genes. ensayo de Matrigel invasión se utilizó para detectar la invasión de células de cáncer
in vitro
. metástasis hepáticas
in vivo
se determinó mediante inyección esplénica de las líneas celulares indicadas seguido de la resección del bazo. estudio de inmunofluorescencia se utilizó para detectar la localización intracelular de la E-cadherina.
Resultados
Hemos encontrado que el nivel de expresión de la proteína GEP100 estaba estrechamente relacionada con la capacidad invasiva de un panel de 6 diferente humana líneas celulares de cáncer de páncreas. Baja regulación de GEP100 en las células PaTu8988 disminuido significativamente la actividad invasiva mediante el ensayo de invasión Matrigel, sin afectar a la migración, la invasión y la viabilidad. La actividad invasiva inhibido fue rescatado por la sobreexpresión de GEP100 ADNc.
In vivo
estudio mostró que la metástasis del hígado fue significativamente menor en las células PaTu8988 con GEP100 de forma estable derribado. Además, un cambio morfológico de tipo epitelial, imitando un mesenquimal epitelial de transición (MET) fue inducida por GEP100 baja regulación. La expresión de la proteína E-cadherina se aumentó 2-3 pliegues acompañados de su redistribución a los contactos célula-célula, mientras que no se observaron cambios obvios para E-cadherina ARNm. Inesperadamente, el ARNm de Slug se incrementó en GEP100 knock-down.
Conclusión
Estos hallazgos proporcionaron evidencia importante que GEP100 juega un papel importante en la invasión de cáncer de páncreas a través de la regulación de la expresión de E-cadherina y el proceso de MET, lo que indica la posibilidad de que se convierta en una potencial diana terapéutica contra el cáncer de páncreas
Visto:. Xie CG, Wei Sm, Chen Jm, Xu Xf, Cai Jt, Chen Qy, et al. (2012) baja regulación de GEP100 conduce a aumento de los niveles de E-cadherina y Inhibe celulares de cáncer pancreático invasión. PLoS ONE 7 (5): e37854. doi: 10.1371 /journal.pone.0037854
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Enero, 2012; Aceptado: 30 de abril de 2012; Publicado: 25 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Zhejiang Provincial Fundación de Ciencias naturales de China (Nº Y2080372; URL: http://www.zjnsf.gov.cn/1/xm/lx.aspx) Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (N ° 81101839; URL: http: //159.226 .244.22 /portal /proj_search.asp) y Qianjiang Talento Programe desde el Departamento de la provincia de Zhejiang (núm 2009R10057 Ciencia y Tecnología; URL: http://www.zjsts.cn/index/index.jspx). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Datos recientes estiman que 43.140 nuevos casos fueron diagnosticados, con aproximadamente 36.800 muertes asociadas en 2010 [2]. El cáncer de páncreas a menudo se diagnostica en las etapas avanzadas con invasión local y metástasis a distancia, por lo que la resección quirúrgica difícil y menos eficaz [3]. Por lo tanto, una enorme cantidad de esfuerzo se ha hecho para tratar de inhibir las actividades invasivas de las células de carcinoma. Para el desarrollo de la terapéutica, es de gran importancia para identificar las moléculas de señalización que se utilizan específicamente en la invasión tumoral [4], [5], [6].
guanina proteína de intercambio de nucleótidos 100, GEP100 ( también llamado BRAG2) fue identificado como uno de los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que preferentemente se aceleró guanosina 5- [γ-tio] trifosfato (GTP? S) de unión para Arf6 y responsable de su después de la activación [7]. Se ha informado de que GEP100 estuvo implicado en diversos procesos biológicos incluyendo la expresión de la superficie celular del receptor, la fusión célula-célula, la adhesión, la fagocitosis, la apoptosis y la angiogénesis [8] - [15]. Estudios recientes demostraron que GEP100 jugó un papel importante en la invasión tumoral. GEP100 enlaces de señalización del receptor del factor de crecimiento epidérmico a la activación Arf6 para inducir el cáncer de mama y la invasión del cáncer de pulmón [16], [17]. En la actualidad, se desconoce la función de GEP100 en otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de páncreas,.
Un proceso llamado transición epitelial a mesenquimal (EMT) a menudo se produce durante la progresión del carcinoma. Durante este proceso, las células epiteliales superar las limitaciones físicas impuestas a ellas por uniones intracelulares y obtener el fenotipo mesenquimal y el aumento de la motilidad [18]. E-cadherina es una proteína transmembrana localizado en las uniones adherentes de la superficie basolateral y juega un papel importante en el mantenimiento de la morfología epitelial. La pérdida de la expresión y /o función de E-cadherina es un marcador bien reconocida de EMT y promueve la progresión de células de cáncer de páncreas y la invasión, en relación con el mal pronóstico de cáncer de páncreas [19] - [23]. Hasta la fecha, el efecto de GEP100 de EMT está poco estudiado.
Por lo tanto, en este estudio, se investigó la función de GEP100 en los procesos de invasión de células de cáncer de páncreas, metástasis y EMT. Se analizaron GEP100 expresión en diferentes líneas celulares y se encontró que el nivel de expresión GEP100 estaba estrechamente relacionada con la celda capacidades invasivas. ensayo de invasión de Matrigel
in vitro
y el hígado experimento metástasis en
in vivo
tanto reveló que la baja regulación de GEP100 inhibió significativamente la invasión y metástasis. La expresión de E-cadherina fue hasta reguladas por GEP100 knock-down. Nuestros hallazgos ayudarán a revelar aún más los mecanismos moleculares utilizados en los procesos de invasión y metástasis del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y anticuerpos
líneas celulares de cáncer pancreático humano BxPC- 3, CFPAC-1, SW1990, AsPC-1, Panc-1 y PaTu8988 fueron todos obtenidos de la Academia de Ciencias de china Banco de células (Shanghai, china) y se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 10% sin antibióticos en un 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C.
Los anticuerpos primarios para Arf6, vimentina, β-actina fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos para GEP100 y E-cadherina C36 fueron de Sigma y BD Biosciences, respectivamente. Todos los anticuerpos secundarios eran de Boster Tecnología (Wuhan, China).
Plásmidos y transfección
El plásmido pEGFP-GEP100 que codifica la longitud completa del cDNA y GEP100 pSuper-retro-puro-GEP100 plásmido que codifica GEP100 shRNA fueron regalos de tipo profesor Sabe Hisataka (Universidad de Hokkaido, Japón). Para la supresión mediada por GEP100 shRNA, 8 × 10
5 de las células PaTu8988 se transfectaron con 3 g de pSUPER-retro-puro-GEP100 o un plásmido que codifica una secuencia irrelevante usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) durante 48 horas. Se seleccionaron las células transfectadas con 1 mg /ml de puromicina (Invitrogen) y en lagunas de células seleccionadas se sometieron a
en experimentos Virto
incluyendo invasión, cicatrización de heridas, la adhesión y ensayos de viabilidad. Para la generación de líneas celulares estables, se seleccionaron las células transfectadas con 1 mg /ml de puromicina y en lagunas de células seleccionadas se diluyeron en serie en un medio de selección. Aproximadamente 20 clones se aislaron y se ensayaron con Western blot. El clon se presentan el más alto grado de supresión se utilizó para
in vivo
experimentos.
Viabilidad, la adhesión, la cicatrización de heridas y la invasión de Matrigel Ensayos
viabilidades celulares se midieron con un MTT kit de ensayo colorimétrico (Promega) según las instrucciones del fabricante.
para el ensayo de adhesión, una placa de cultivo de 35 mm se revistió con 10 g /ml de colágeno I (Sigma-Aldrich) y luego 1 × 10
se sembraron 5 células. 1 hora más tarde, el plato se lavó con PBS suavemente durante 3 veces. El número de células adheridas a la placa se contó.
Para el ensayo de curación de la herida, 1 × 10
6 células fueron sembradas en una placa de cultivo de 35 mm y se dejaron formar una monocapa. Una herida fue hecha por el rascado de la monocapa con una punta de pipeta de 100 l. Las células se cultivaron hasta que la herida se cubrió
.
El ensayo de invasión de Matrigel se realizó con un transwell recubierto con 25 mg Matrigel (Sigma). 1 × 10
5 células en RPMI-1640 con solución salina de tampón fosfato 1% (PBS) se sembraron en el pocillo superior. Como un quimioatrayente, RPMI-1640 con FBS al 10% se añadió en el compartimiento inferior. Después de la incubación durante 24 horas, las células se fijaron en metanol durante 15 min y se tiñeron con violeta cristal al 1% (Sangon, China) para 10 min. Las células de la superficie superior del filtro fueron borradas con un hisopo de algodón y el número de células que migraron a la superficie inferior de las membranas fue contados en 10 campos seleccionados al azar.
Análisis RT-PCR
ARN total fue aislado de las células cultivadas por Trizol (Invitrogen) y transcrito de forma inversa de M-MLV transcriptasa inversa (Promega), utilizando oligo dT a 42 ° C durante 60 min. ADNc se sometieron luego a 35 ciclos de amplificación por PCR. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: GEP100, cebador directo (5'-GCCTTTAGCAACGATGTCATC-3 ') y cebador inverso (5'-CACATGGTCCTCATTGGTCTT-3'); Arf6, cebador directo (5'-ATGGGGAAGGTGCTATCCAAAATC-3 ') y el cebador inverso (5'-GCAGTCCACTACGAAGATGAGACC-3'); E-cadherina, cebador directo (5'-TCCCATCAGCTGCCCAGAAA-3 ') y cebador inverso (5'-TGACTCCTGTGTTCCTGTTA-3'); Vimentina, cebador directo (5'-GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT-3 ') y el cebador inverso (5'-TCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT-3'); Slug, cebador directo (5'-AGATGCATATTCGGACCCAC-3 ') y el cebador inverso (5'-CCTCATGTTTGTGCAGGAGA-3'); Twist, cebador directo (5'-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ') y el cebador inverso (5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3'); ZEB1, cebador directo (5'-AGCAGTGAAAGAGAAGGGAATGC-3 ') y cebador inverso (5'-GGTCCTCTTCAGGTGCCTCAG-3'); Caracol, cebador directo (5'-TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG-3 ') y cebador inverso (5'-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3'). Los cebadores utilizados para β-actina fueron adquiridos de Sangon, China.
Western Blot Analysis
Las células se lisaron en tampón de lisis RIPA (NaCl 150 mM, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 5 mM, 1% NP-40, 1% de Na-desoxicolato, 0,1% SDS, PMSF 1 mM, 20 mg /ml de leupeptina, 20 mg /ml Aprotini, se determinó 3 mg /ml de pepstatina A) y la concentración de proteína usando el kit BCA (Keygen, china). Las proteínas totales se fraccionaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en 5% de BSA en tampón TBST que contiene 0,1% de Tween 20 y después se incubaron con anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C. Conjugado con HRP secundaria de anticuerpos se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora y se detectaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (Amersham Pharmacia Biotech).
inmunofluorescencia Estudio
Las células transfectadas se lavaron PaTu8988 con PBS caliente una vez e inmediatamente se fijaron con metanol frío a -20 ° C durante 6 min. La muestra se dejó secar a temperatura ambiente durante 30 min y se bloqueó con 2% de BSA en PBS durante 30 min. El E-cadherina endógena fue reconocido con un anticuerpo monoclonal anti-E-cadherina durante 1 hora a RT. Después se añadieron 5 lavados con 0,5% de BSA-PBS, un anticuerpo secundario marcado con FITC anti-ratón (Boster, China) y se incubaron durante 30 min a TA. Luego, las células se lavaron con PBS durante 5 veces de nuevo, a continuación, se montaron con glicerol al 50% en PBS y se observaron con un microscopio de fluorescencia.
In vivo
Metástasis Ensayo
A ensayo de metástasis hepática se llevó a cabo como se describe anteriormente [24], [25] con modificaciones. Brevemente, ratones Balb /c ratones desnudos (5-6 semanas) se dividieron en 3 grupos con 12 para cada uno: un grupo de control que recibe las células PaTu8988, un grupo scramble recibir la células derribado con sramble shRNA y un grupo experimental de recibir las células con GEP100 de forma estable derribado. Los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral. La cavidad abdominal se expuso y 5 × 10
6 celdas indicadas en 0,1 ml de PBS se inyectaron en el tejido del bazo a través de una aguja de calibre 27. El sitio de inyección se presionó ligeramente con algodón solución salina durante 5 min seguido de la ligación de la arteria gástrica izquierda y la arteria esplénica. A continuación, se resecó el bazo. 4 semanas más tarde, el hígado fue eliminado quirúrgicamente y se fija con 10% durante la noche en formalina. El hígado se cortó en rebanadas de 2 mm y 5 secciones de aproximadamente la misma posición para cada hígado se estimaron con un microscopio. Los protocolos utilizados para todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Zhejiang.
Análisis estadístico
Los experimentos y los ensayos se realizaron al menos tres veces. La significación estadística se supone si
P
≤0.05 por T-test.
Resultados
correlación entre la expresión GEP100 y celulares de cáncer pancreático invasiva Capacidad
El invasiva la capacidad de un panel de 6 líneas celulares de cáncer de páncreas humanos diferentes se examinó por el ensayo de invasión de Matrigel como se muestra en la Fig. 1A. Las líneas celulares en este grupo se obtuvieron a partir tanto de la primaria (BxPC3, Panc-1, y SW1990) y metastásico (AsPC-1, CFPAC-1, y Patu8988) sitios [26], [27]. Estas líneas celulares mostraron un continuo de diferentes capacidades invasivas. Las células PaTu8988 ASPC-1 y mostraron la capacidad más alta invasivos, seguido por el SW1990, las células CFPAC-1 y Panc-1. La célula BxPC-3 era el más débil. El nivel de expresión de la proteína GEP100 estaba estrechamente correlacionada con la capacidad invasiva de este panel de líneas de células, con las células ASPC-1 y PaTu8988 que muestran la expresión más fuerte, seguido por el SW1990, CFPAC-1 y células Panc-1, mientras que casi no detectada en la línea celular BxPC-3. No se detectó ninguna relación obvia entre la expresión de la proteína Arf6 y la capacidad invasiva. También determinamos los niveles de expresión de las proteínas asociadas con epitelial (E-cadherina) o fenotipo mesenquimal (vimentina). la expresión de E-cadherina podría ser fácilmente detectado en las líneas celulares de baja invasiva, pero sólo se detectó una expresión muy débil en las líneas celulares altamente invasivos. Vimentina se expresa en la línea celular altamente invasiva (Fig. 1B)
.
(A) habilidades invasoras de un panel de 6 líneas celulares de cáncer pancreático se analizaron mediante un ensayo de invasión de Matrigel durante 24 horas. ASPC-1 y PaTu8988 mostraron capacidades invasivas altas. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de GEP100, Arf6, E-cadherina y proteína vimentina en diferentes líneas celulares. ASPC-1 y PaTu8988 mostraron la expresión más fuerte de la proteína GEP100, seguido por SW1990, CFPAC-1, Panc-1 y BxPC-3, lo que demuestra una estrecha relación entre el nivel de expresión GEP100 y la capacidad invasiva de células. No se detectó ninguna relación obvia entre la expresión de la proteína Arf6 y la capacidad invasiva. la expresión de E-cadherina podría ser fácilmente detectado en las líneas celulares de baja invasiva, pero sólo se detectó una expresión muy débil en las líneas celulares altamente invasivos. La vimentina se expresó en las líneas celulares altamente invasivos. (C) Análisis de RT-PCR de la expresión de GEP100, Arf6, E-cadherina y vimentina mRNA. La expresión de mRNA GEP100 se pudo detectar en todas las seis líneas celulares y no se encontró correlación obvia con la capacidad invasiva. Este fue el mismo caso para Arf6 y ARNm vimentina. E-cadherina ARNm mostró una estrecha relación con la capacidad invasiva de las diferentes líneas celulares. mRNA β-actina se utilizó como control.
La expresión de mRNA GEP100 se pudo detectar en todas las líneas de células 6 y no se encontró correlación obvia con la capacidad invasiva. Este fue el mismo para Arf6 y ARNm vimentina. el nivel de ARNm E-cadherina mostró una estrecha relación con la capacidad invasiva de diferente línea celular (Fig. 1C).
El descenso de regulación de GEP100 Disminución de la capacidad invasora de las células del cáncer pancreático
Para evaluar si GEP100 contribuye a la celda invasión, elegimos las células PaTu8988 altamente invasivos y hacia abajo-regulado la expresión GEP100 con shRNA. inhibición Más de 80% de la síntesis de proteínas GEP100 fue confirmada por Western blot en dos clones (Fig. 2A). Clon#1 fue elegido para el ensayo de invasión. El ensayo de invasión de Matrigel mostró que GEP100 knock-down disminuyó el número de células que penetran a través de Matrigel a aproximadamente 35% en comparación con el grupo control (Fig. 2B). Re-expresión de GEP100 restaurado la capacidad de invasión a aproximadamente 60%. actividad migratoria se evaluó por el ensayo de curación de la herida y cicatrización de la herida se muestran los períodos de tiempo de tres grupos. GEP100 derribo inhibió ligeramente la migración (Fig. 2C), sin significación estadística. Por otro lado, GEP100 knock-down no inhibió la adhesión celular en el colágeno (Fig. 2D). En las condiciones anteriores, la viabilidad celular no se vio afectada (Fig. 2E).
(A) Una línea celular estable con GEP100 derribado se obtuvo mediante la transfección de pSUPER-retro-puro-GEP100 en células PaTu8988 y seleccionado en 1,5 g /ml de puromicina. Baja regulación de GEP100 fue confirmada por Western blot. β-actina se utilizó como control. ensayo (B) Invasion mostró que GEP100 baja regulación disminuyó el número de células penetrado a través de la membrana recubierta con Matrigel. Los datos se presentaron y se representan como porcentajes calculados por la normalización de los valores obtenidos para las células no tratadas como 100%. GEP100 knock-down disminuyó el número de células penetrado a través de Matrigel a aproximadamente 35% en comparación con el grupo control. Re-expresión de GEP100 en shRNA células tratadas restauran la capacidad de invasión a aproximadamente 60%. (C, D, E) GEP100 baja regulación no mostró efectos significativos sobre la migración celular, invasión y viabilidad. Ctrl, control.
El descenso de regulación de GEP100 Disminución del hígado metástasis de células de cáncer de páncreas en ratones Balb /c ratones desnudos
A continuación, se examinó si knock-down de GEP100 metástasis hepática bloques de las células tumorales en ratones. Hemos inyectado PaTu8988 o PaTu8988 /scramble shRNA o células PaTu8988 /GEP100 shRNA en el bazo de ratones Balb /c ratones desnudos. Doce ratones de cada grupo fueron sacrificados después de la inyección 4 semanas después. Para el control y los grupos inyectados con shRNA scramble, el hígado se ha hecho pequeña y áspera, con áreas blanqueados ven en la superficie. Para el grupo con inyección de shRNA GEP100, también se encontraron pequeñas manchas en la superficie del hígado. metástasis hepática que muestra nidos pobremente diferenciados de células se confirmó microscópicamente en 9 de 10 ratones (90%) en el grupo de control y 10 de 12 ratones (83%) en el grupo sramble, mientras que se encontró solamente 4 de 11 ratones (36%) en el grupo experimental (Fig. 3). Se observó un efecto inhibidor significativo sobre la metástasis del hígado (
P
≤0.05). El número de nódulos metastásicos se calcularon y se promediaron. En comparación con el control y los grupos de mucho revuelo, GEP100 baja regulación disminuyó significativamente los nódulos metastásicos (
P
≤0.05).
(A) los hallazgos macroscópicos del hígado resecado. PaTu8988 células estables desde el punto splenicly fueron inyectados seguida de resección del bazo. 4 semanas más tarde, los hígados fueron retirados para la observación. La mayoría de los hígados de los Grupos de shRNA scramble control y se ha hecho pequeña y áspera, con grandes áreas blanqueados ven en la superficie. Para el grupo con inyección de shRNA GEP100, sólo pequeñas manchas fueron encontrados en algunos de la superficie del hígado. La metástasis se confirmó con un microscopio y los sitios de metástasis se indica por las flechas (hematoxilina y eosina, x100). (B) se enumeran los porcentajes de metástasis hepática en los ratones desnudos Balb /c. Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa entre el control y el grupo experimental (
P
≤0.05). (C) promedio de número de nódulos metastásicos en el hígado y se calcularon graficó. En pocas palabras, después de una fijación con formalina al 10% durante la noche, el hígado se cortó en rebanadas de 2 mm y 5 secciones de aproximadamente se estimaron las mismas posiciones para cada hígado bajo microscopio. Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa entre el control y el grupo experimental (
P
≤0.05). Ctrl, control.
Expresión
E-cadherina se reguló y se redistribuyen a la célula de la célula Contactar por GEP100 descenso de regulación
Por último, hemos investigado los posibles mecanismos implicados en la la inhibición de la invasión de células de cáncer de páncreas por GEP100 baja regulación. Se encontró que la baja regulación de GEP100 provocó un cambio morfológico de las células PaTu8988 de tipo mesenquimal a epitelial (Fig. 4A). Y en consecuencia, la expresión de la proteína E-cadherina, que es un marcador epitelial, se aumentó aproximadamente 3 veces en comparación con el grupo control (Fig. 4B). La expresión de E-cadherina mRNA se examinó también, pero sin cambios significativos podría ser detectado (Fig. 4C). A continuación, se determinó además la localización intracelular de la proteína E-cadherina. estudio de inmunofluorescencia mostró que en las células GEP100 abatidos, E-cadherina se concentró en el contacto célula-célula (Fig. 4D). Aunque ningún cambio significativo se encuentra en el nivel de ARNm de E-cadherina, que todavía examinado la expresión de varios principales factores de transcripción para E-cadherina. Curiosamente, se encontró un aumento de Slug en las células GEP100 abatidos, mientras que no hubo cambios para Twist, ZEB1, Snail (Fig. 4C).
(A) Se observó una mesenquimal epitelial cambio en las células establemente derribado por GEP100. Los paneles superior e inferior mostraron las apariencias morfológicas a una densidad celular baja y cuando las células alcanzaron la confluencia, respectivamente. En comparación con los grupos de control y revueltos, la célula en el grupo experimental se convirtió epitelial y el adhesivo. (B) transferencia de Western mostró que el nivel de expresión de la proteína E-cadherina se aumentó alrededor de 3 veces en el grupo experimental en comparación con el grupo control. análisis (C) RT-PCR de ARNm de E-cadherina y sus reguladores de la transcripción. La expresión de E-cadherina ARNm no se vio afectada por GEP100 baja regulación. Un aumento de Slug ARNm se encontró en las células derribados GEP100, mientras que no hubo ningún cambio de la torcedura, ZEB1 y Caracol. (D) La tinción de inmunofluorescencia de E-cadherina. En comparación con el grupo scramble, GEP100 baja regulación redistribuye la E-cadherina en los contactos célula-célula.
Discusión
Los resultados actuales demostrado por primera vez que juega un GEP100 papel fundamental en la invasión de células de cáncer de páncreas. Baja regulación de GEP100 inhibió significativamente la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas, posiblemente a través de la regulación de la expresión de E-cadherina y la restauración del fenotipo epitelial. GEP100 podría ser una diana molecular potencial en la terapia génica contra el cáncer de páncreas.
En este estudio, en primer lugar, hemos demostrado que GEP100 se expresa en las células del cáncer pancreático. GEP100 pertenece a la familia de BRAG Arf GEF, que consiste en tres isoformas, BRAG1 /IQsec2, BRAG2 /IQsec1 /GEP100, y BRAG2 /IQsec3 /synArfGEF [28]. La expresión de BARG2 /GEP100 es ubicuo [7]. Dentro del grupo de 6 líneas celulares de cáncer pancreático que utilizamos, BxPC-3, SW1990 se obtuvieron de tumores primarios y Panc-1 se deriva de extensión intraductal invasivo del tumor primario, mientras que el otro 3 fueron todos derivados de sitios de metástasis [26], [27]. ASPC-1 y PaTu8988 mostraron la expresión más fuerte de GEP100, seguido por SW1990, CFPAC-1 y Panc-1, mientras que el tumor primario de BxPC-3 células mostró los más débiles. La expresión de la proteína GEP100 está estrechamente relacionada con la capacidad invasiva de cada línea celular, lo que sugiere que GEP100 podría estar implicada en la invasión de células de cáncer de páncreas.
Se han encontrado, además, que GEP100 baja regulación con shRNA inhibe significativamente la invasión de Matrigel capacidad de las células PaTu8988, pero no tuvo efecto sobre la viabilidad celular, la migración y la adhesión, lo que indica que GEP100 es particularmente responsable de la capacidad invasiva de las células.
In vivo
experimento también demostró que GEP100 knock-down, inhibió la metástasis hepática de las células de cáncer de páncreas en ratones Balb /c desnudos. Este resultado está en línea con los datos previos que demuestran que en las células de cáncer de mama GEP100 fue altamente expresado en los invasivos y que GEP100 baja regulación inhibe la invasión celular y la metástasis de pulmón [16], [17]. Estos resultados indicaron que GEP100 no sólo es un objetivo para el cáncer de mama, que podría ser un mecanismo general utilizado por otros tipos de cáncer
.
Se han reportado varios otras funciones biológicas para GEP100. En las células HeLa, GEP100 regula la adhesión celular a través de controlar la endocitosis y el reciclaje de la integrina [9] β. En una línea celular de carcinoma de hígado HepG2, GEP100 interactuaba directamente con α-catenina y jugó un papel en la remodelación del citoesqueleto de actina [10]. En mioblastos y macrófagos, GEP100 estaba involucrado en la fusión célula-célula [11]. También se ha informado para participar en la regulación de la arquitectura nucleolar y la fagocitosis [12], [13]. En este estudio, no se observó ningún efecto significativo de GEP100 sobre la adhesión celular a la matriz de colágeno o la actividad de migración. Dado que no hay ningún informe sobre el papel de GEP100 en las células de cáncer de páncreas, esto puede ser debido a la diferencia en el tipo de célula.
A diferencia del informe anterior sobre una estrecha relación entre la expresión Arf6 y células de cáncer de mama invasivo capacidad [29], pero no hemos podido detectar que en el panel de líneas celulares de cáncer pancreático que utilizamos. Las funciones biológicas mencionadas de GEP100 se han encontrado para ser dependiente de la activación de Arf6, pero se cree que GEP100 es una proteína multifuncional que regula las funciones celulares, tanto en una manera dependiente de Arf y -independiente. Por ejemplo, GEP100 estaba involucrado en la apoptosis independiente de la muerte celular de la actividad Arf6 [12]. Otros estudios que incluyen la determinación del estado de activación de Arf6 será necesario revelar el papel de Arf6 en el proceso de invasión de células de cáncer de páncreas.
Encontramos GEP100 knock-down provocó un cambio morfológico de las células del mesénquima a epitelio fenotipo. En el cáncer pancreático, el cambio de sus características epiteliales hacia un fenotipo mesenquimal aumenta la motilidad celular y se considera que es un requisito previo para la invasión tumoral. E-cadherina es el mejor marcador molecular caracterizado en las células epiteliales y localizada en las uniones adherentes. La pérdida de la expresión y /o función de E-cadherina es un marcador bien reconocida de EMT y promueve la invasión [18]. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de la proteína E-cadherina. tratamiento GEP100 shRNAs aumentó el nivel de expresión de E-cadherina 2 a 3 -fold. Esto es consistente con el informe del Hiroi lo que demuestra que en células HepG2, la baja regulación de GEP100 aumentó la expresión de E-cadherina [10]. Además, también demostraron que GEP100 interactuó con α-catenina.
E-cadherina expresión podría ser regulada por múltiples mecanismos que incluyen la metilación del promotor, la regulación transcripcional de los factores de transcripción incluyendo Snail, Slug, Twist, Zeb-1 , Sip1 y adecuada localización intracelular [30], [31]. Entre los factores de transcripción que hemos examinado, la expresión de Slug se incrementó por la baja regulación de GEP100, lo cual fue inesperado. Slug es un miembro de la superfamilia Snail y primero identificado como una proteína de desarrollo crítico para la formación de la cresta neural en embriones de pollo [32]. Slug está inversamente correlacionada con la expresión de E-cadherina y es un factor crítico en la promoción de la EMT-muchos tipos de tumores [33], [34]. Un estudio reciente mostró que la expresión de Slug no siempre se asoció con E-cadherina baja regulación [35]. Se ha demostrado claramente que la expresión de Slug se incrementó en el cáncer de páncreas en comparación con el parénquima de los alrededores. Sin embargo, en los 36 casos de adenocarcinoma ductal analizado, no se encontró relación obvia entre la E-cadherina y la expresión de Slug [36]. En este estudio se encontró que GEP100 baja regulación indujo una expresión de E-cadherina, así como una mayor incremento en la expresión de Slug. Una interpretación es que la expresión de la proteína E-cadherina no depende de Slug en este tipo celular y de hecho el mRNA de la E-cadherina no se cambió. Aunque la expresión de Slug se asocia con muchos el pronóstico del tumor, No está claro aún cómo Slug en sí está regulada. Nuestros datos indican que GEP100 podría estar implicada en la regulación de la expresión de Slug.
Una correcta localización de E-cadherina es también crítica para su funcionamiento adecuado. De la superficie celular de E-cadherina en células epiteliales está parcialmente internaliza y se recicla de nuevo a la membrana plasmática por múltiples mecanismos, incluyendo las rutas mediadas dependiente de clatrina, caveolae-dependiente, lípidos balsa o macropinocytosis [31]. En las uniones epiteliales, la dinámica de la E-cadherina fue también íntimamente reguladas por las proteínas ARF [37], [38]. Arf6 GTPasa es crucial para la endocitosis E-cadherina y el reciclaje. Se ha demostrado que la expresión de una forma inactiva de la proteína bloques Arf6T27N internalización de E-cadherina HGF inducida, mientras que la expresión de una forma activa constitutiva de Arf6Q67L hace que el desmontaje de las uniones adherentes [39]. En las células HepG2, GEP100 agotamiento causado inactivación de Arf6 seguido de internalización deteriorado de E-cadherina y su acumulación en la membrana plasmam [10]. Con el estudio de inmunofluorescencia, se encontró que GEP100 knock-down aumentó la acumulación de E-cadherina a las uniones adherentes. Especulamos que GEP100 regulado hasta la expresión de E-cadherina a través de la inhibición de su endocitosis y degradación de la siguiente. será necesaria una mayor investigación para aclarar esta cuestión.
En resumen, nuestros resultados presentan evidencia experimental de que la expresión GEP100 correlacionada con la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas y podría ser considerado como una nueva diana para el desarrollo de terapias para prevenir páncreas invasión de células cancerosas.
Reconocimientos
agradecemos al profesor Sabe Hisataka por la amabilidad de compartir y de ADNc shRNA construcciones utilizadas en estos estudios.