Extracto
acumulación intracelular aberrante de β-catenina es un bien reconocido de varios tipos de cáncer: PLOS ONE , incluyendo el de próstata, colon y cánceres de hígado, y es un objetivo potencial para el desarrollo de terapias contra el cáncer. Aquí, se utilizó la detección de molécula pequeña basado en células para identificar CGK062 como un inhibidor de la señalización /β-catenina Wnt. CGK062 promovió la proteína quinasa Cα (PKCa) mediada por fosforilación de β-catenina en Ser33 /Ser37, marcándolo para la degradación proteasomal. Esto redujo los niveles de β-catenina intracelulares y, en consecuencia antagoniza β-catenina de transcripción de respuesta (CRT). La inhibición farmacológica o el agotamiento de PKCa abrogadas fosforilación y degradación de β-catenina mediada por CGK062. Además, CGK062 reprime la expresión de los genes que codifican la ciclina D1, c-myc, y axina-2, los genes diana β-catenina, y por lo tanto inhibe el crecimiento de células de cáncer de CRT-positivo. Además, el tratamiento de ratones desnudos portadores de tumores de xenoinjertos con PC3 CGK062 a dosis de 50 mg /kg y 100 mg /kg (i.p.) suprimió significativamente el crecimiento del tumor. Nuestros hallazgos sugieren que CGK062 ejerce su actividad contra el cáncer mediante la promoción mediada por PKCa β-catenina fosforilación /degradación. Por lo tanto, CGK062 tiene un potencial terapéutico importante para el tratamiento de cánceres CRT-positivo
Visto:. Gwak J, Lee JH, Chung YH, Song GY, Oh S (2012) promoción de la pequeña molécula-base de PKCa mediada β-catenina degradación Suprime la proliferación de las células de la CRT positivos de cáncer. PLoS ONE 7 (10): e46697. doi: 10.1371 /journal.pone.0046697
Editor: Manfred Jung, Albert Ludwig Universidad, Alemania |
Recibido: 30 Enero, 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 5 Octubre 2012
Copyright: © Gwak et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Corea Reserch (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2012R1A2A2A01002941). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la vía /β-catenina Wnt, que se activa por la interacción de Wnt1, Wnt3a, y Wnt8 con los receptores Frizzled (Fz) y relacionada con el receptor protein5 /6 co (LRP5 /6) lipoproteína de baja densidad receptores, juega un papel importante en la proliferación celular, la diferenciación y la oncogénesis [1]. Central para esta vía es el nivel de β-catenina citosólica, que regula sus genes diana. En ausencia de una señal de Wnt, β-catenina es fosforilada por tanto la caseína quinasa 1 (CK1) y glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK-3β), que forman un complejo con poliposis adenomatosa coli (APC) /Axin (complejo de destrucción) . Este es entonces reconocido por F-box β-transducina de la proteína que contiene la repetición-(β-TrCP), un componente del complejo de ubiquitina ligasa, lo que resulta en la degradación de β-catenina [2] - [4]. La activación del receptor por sus ligandos Wnt regula negativamente el complejo de destrucción y conduce a la estabilización β-catenina citoplasmática [5].
La activación anormal de la vía Wnt /β-catenina y la posterior regulación de β-catenina transcripción de respuesta (CRT) se cree que contribuyen al desarrollo y la progresión de ciertos cánceres [6]. mutación oncogénica en β-catenina o de otros componentes del complejo de la destrucción (APC o axina) se observó en el cáncer de colon, carcinoma hepatocelular y cáncer de próstata [6] - [8]. Estas mutaciones conducen a la acumulación excesiva de β-catenina en el citoplasma y luego β-catenina se transloca en el núcleo, donde se forma complejos con T factores factor de células /linfocitos factor de potenciador (TCF /LEF) de transcripción de la familia para activar la expresión de Wnt /β-catenina genes de respuesta, como
c-myc
,
ciclina D1
y metaloproteinasa-7 (
MMP-7
), que juegan un papel importante en la tumorigénesis y metástasis [9] - [11]. La acumulación de β-catenina se observa también en otros tipos de cáncer, como el cáncer de ovario, melanoma, cáncer de endometrio, meduloblastoma, y pilomatricoma [6] - [8]. Por lo tanto, la activación aberrante de la vía Wnt /β-catenina es una posible diana terapéutica para la quimioprevención y tratamiento de varios tipos de cáncer.
En el presente estudio, hemos identificado CGK062, que inhibe la ruta marcada /β-catenina vía y la proliferación celular de células de cáncer de CRT-positivo. CGK062 promueve la degradación intracelular de β-catenina través de la fosforilación β-catenina mediada por PKCa.
Resultados
Identificación de CGK062 como un inhibidor de la vía /β-catenina vía
Para identificar antagonistas de molécula pequeña de la vía /β-catenina vía, se utilizaron células HEK293 reportero de forma estable, que albergaban reportero TOPflash y Frizzled-1 (HFz-1) plásmidos humanos. Después de la incubación de estas células reportero con Wnt3a-CM y cada compuesto, se midió la actividad de luciferasa de luciérnaga utilizando un lector de microplacas y luego identificado que CGK062 (3- (3,4-dihidroxi-fenil) ácido acrílico 2,2-dimetil- 8-oxo-3,4-dihidro-2H, 8H-pirano [3,2-g] cromen-3-il) como un inhibidor de la vía Wnt /β-catenina (Figura 1A, B y S1). Como se muestra en la Figura 1C, el tratamiento de células informadoras HEK293 con diferentes concentraciones de CGK062 resultó en una disminución dependiente de la dosis en la transcripción de respuesta β-catenina (CRT) que había sido inducida por Wnt3a-CM (IC
50 = 12,3 M) . CGK062 no afectó a la actividad FOPFLASH en células de control HEK293 y la viabilidad celular en las células HEK293 reportero (Figura 1C y S2A). actividades reportero p53 NF-kB y no se vieron afectados por CGK062 (Figura S2 B y S2C). Estos resultados sugieren que CGK062 potentemente y, específicamente, inhibe la vía Wnt /β-catenina.
Screening
(A) de compuestos que inhiben la vía /β-catenina Wnt. Los compuestos que modulan la actividad de reportero TOPflash fueron seleccionados utilizando las células HEK293 reportero. Los controles se ensayaron en presencia o ausencia de Wnt3a-CM. (B) Estructura química de CGK062. la inhibición dependiente de la dosis (C) de la transcripción de respuesta β-catenina. reportero células HEK293 fueron incubadas con las concentraciones indicadas de CGK062 en presencia de Wnt3a-CM. Después de 15 h, se determinaron las actividades de luciferasa y se presenta como unidad de luz relativa (RLU) normalizada a título celular. Los resultados son el promedio de tres experimentos, y las barras indican las desviaciones estándar. *,
P
& lt; 0,05, y **,
P
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control tratado con Wnt3a-CM. (D) proteínas citosólicas se prepararon a partir de células HEK293 reportero tratados con vehículo (DMSO) o concentraciones indicadas de CGK062 en presencia de Wnt3a-CM durante 15 h y después se sometieron a transferencia Western con anticuerpo β-catenina. (E) Semi-RT-PCR cuantitativa para β-catenina, y GAPDH se llevó a cabo con ARN total preparado a partir de células HEK293 reportero vehículo (DMSO) o concentraciones indicadas de CGK062 en presencia de Wnt3a-CM durante 15 h. (F) proteínas citosólicas preparan a partir de células informadoras HEK293, que se incubaron con vehículo (DMSO) o CGK062 (25 mM) en presencia o ausencia de Wnt3a-CM, expuestos a MG-132 (10 M) durante 8 h, se sometieron a transferencia Western con anticuerpo anti-β-catenina. En (D) AMD (F), para confirmar la igualdad de carga, la transferencia se volvió a sondear con anticuerpo anti-actina.
En la vía /β-catenina vía, CRT depende en gran medida del nivel de intracelular β-catenina, que es controlado por la proteolisis dependiente de ubiquitina [12]. Para investigar el efecto de CGK062 en el nivel intracelular de β-catenina, se analizó la cantidad de citoplasma de β-catenina por transferencia de Western con anticuerpo anti-β-catenina en células HEK293 reportero tratados con CGK062. El nivel de citoplásmica β-catenina, que se había acumulado por Wnt3a-CM, se redujo drásticamente mediante el tratamiento de CGK062 (Figura 1D), que es coherente con el resultado de CRT. Para examinar si la reducción de la proteína β-catenina citoplasmática por este compuesto se debió a la disminución del nivel de ARNm de β-catenina en las células HEK293 reportero, se realizó un semi-cuantitativos RT-PCR para determinar la cantidad de β-catenina ARNm. Como se muestra en la Figura 1E, el nivel de mRNA β-catenina no cambió en respuesta a diferentes concentraciones de CGK062 en células HEK293 reportero.
A continuación, para explorar si la baja regulación de β-catenina por CGK062 está mediada por el proteasoma, que utiliza MG-132 para inhibir la degradación de proteínas mediada por proteasoma en células HEK293 reportero. Como se muestra en la Figura 1F, CGK062 llevó constantemente a una disminución en el nivel de proteína β-catenina; sin embargo, la adición de MG-132 abrogó el efecto de CGK062 en la reducción de la β-catenina. El cloruro de amonio, un inhibidor de lisosoma, no afectó a la degradación mediada por CGK062 β-catenina (Figura S3). Tomados en conjunto, estos resultados indican que CGK062 suprime la vía /β-catenina Wnt a través de un mecanismo que implica la degradación intracelular de β-catenina.
mediada por CGK062 degradación β-catenina requiere β-TrCP pero no GSK-3βactivity
Dado que la fosforilación de la β-catenina por GSK-3β y su posterior asociación con β-TrCP conduce a la degradación de ß-catenina [13], se examinó si la actividad de GSK-3β es necesario para la degradación de β catenina inducida por CGK062. Cuando se incubaron células HEK293 reportero con LiCl o 6-bromoindirubin-3'-oxima (BIO), inhibidores de GSK-3β, se estimuló CRT (Figura 2A y 2B), en consonancia con los informes anteriores [14], [15]. Como se muestra en la Figura 2A y 2B, el tratamiento con CGK062 resultó en la supresión de CRT en una forma dependiente de la dosis. Además, el análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-β-catenina mostró consistentemente que CGK062 llevó a una regulación a la baja de los niveles de β-catenina intracelulares, que acumuló con LiCl (Figura 2C), lo que sugiere que mediada por CGK062 degradación de β-catenina es independiente de GSK-3β.
reportero células HEK293 (a) se incubaron con CGK062 en presencia de LiCl 20 mM. (B) células reportero HEK293 fueron incubadas con CGK062 en presencia de 0,75 M BIO. En (A) y (B), después de 15 h, se determinaron las actividades de luciferasa y se informaron como unidad de luz relativa (RLU) normalizado a título de célula. Los resultados son el promedio de tres experimentos, y las barras indican las desviaciones estándar. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con el grupo de control o LiCl- BIO-tratada. (C) proteínas citosólicas se prepararon a partir de células HEK293 reportero tratados con vehículo (DMSO) o el aumento de cantidades de CGK062 en presencia de LiCl 20 mM durante 15 h y después se sometieron a transferencia Western con anticuerpo β-catenina. (D) células HEK293 se transfectaron con el plásmido de expresión Δβ-TrCP y después se incubaron ya sea con el vehículo (DMSO) o CGK062 (25 mM) en presencia de Wnt3a CM durante 15 h. proteínas citosólicas se sometieron a transferencia de Western con β-catenina y anticuerpos? -TrCP. En (C) y (D), las manchas de transferencia se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina como control de carga.
A continuación, determinamos si β-TrCP es necesario para la degradación inducida por CGK062 ofβ-catenina. Como se muestra en la Figura 2D, la expresión ectópica de una forma dominante negativa de β-TrCP (Δβ-TrCP), que interactúa con fosforilados β-catenina pero es incapaz de formar un SCF
β TrCP-ubiquitina ligasa complejo [16] , abrogada la degradación inducida por CGK062 de β-catenina. Además, CGK062 no afectó CRT que había sido activada por la sobreexpresión de los mutantes de β-catenina, S45A y S37A (Figura S4). Estos resultados indican que β-TrCP y los residuos N-terminales de la β-catenina se requiere para mediada por CGK062 degradación β-catenina.
CGK062 induce PKCa mediada por fosforilación de β-catenina /degradación
los informes anteriores han demostrado que activa PKCa cataliza la fosforilación de β-catenina en Ser33 /37 y su posterior asociación con β-TrCP conduce a la degradación de ß-catenina [17], [18]. Para obtener más información sobre el mecanismo, se analizó en primer lugar si PKCa se activa mediante el tratamiento con CGK062. Desde activado PKCa mueve desde el citoplasma a la membrana plasmática [19], aislamos fracciones de membrana de las células tratadas con CGK062 y -untreated, y se midió la cantidad de PKCa por análisis de transferencia Western. tratamiento CGK062 condujo a la acumulación de PKCa en la membrana plasmática en las células HEK293 (Figura 3A). También se observó la translocación de membrana inducida por CGK062 de PKCa en células HEK293 por análisis de inmunofluorescencia (Figura S5). Consistentemente, CGK062 potenció la actividad quinasa de PKCa
in vitro
, cuando utilizamos péptido sintético que contiene sitio de fosforilación PKCa como sustrato (Figura 3B). Por otra parte, BIM I, un inhibidor específico de la PKC abolió el efecto de CGK062 (Figura 3B), lo que sugiere que CGK062 es un
de buena fe
activador de la PKCa.
fracciones (A) citosólicos y de membrana se prepararon a partir de células HEK293 tratadas con vehículo (DMSO) o CGK062 (25 y 50 mM) en presencia o ausencia de Wnt3a-CM para transferencia de Western con anticuerpo anti-PKCa. Las transferencias se volvieron a sondar con anti-tubulina o anticuerpos anti-MDR como controles de fracciones. (B) péptido indicado se incubó con PKCa purificada y CGK062 (12,5 y 25 mM) o BIM (0,5 M). Las cantidades de ATP en la reacción fueron detectados por quinasa KIT-Glo ™ luminiscentes de ensayo (Promega). Los resultados son el promedio de tres experimentos, y las barras indican las desviaciones estándar. *,
P
& lt; 0,05, en comparación con el grupo control del vehículo. (C) proteínas citosólicas se prepararon a partir de células HEK293 reportero tratados con CGK062 (25 M) o BIM (10 M) en ausencia o presencia de Wnt3a-CM para transferencia de Western con anticuerpo anti-β-catenina. (D) células reportero HEK293 se transfectaron con el control negativo (NC) siRNA (40 nM) o PKCa siRNA (40 nM), y luego incubadas con CGK062 (25 M) durante 15 h en ausencia o presencia de Wnt3a-CM. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-β-catenina anti-PKCa y. En (C) y (D), las manchas de transferencia se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina para confirmar la igualdad de carga. (E) GST-β-catenina (100 ng) se incubó con PKCa purificada y CGK062 (12,5 y 25 mM) o BIM (0,5 M). Las muestras se analizaron por transferencia de Western con anticuerpo anti-fosfo-p33 /37-β-catenina. células reportero (F) HEK293 fueron incubadas con CGK062 (25 M) y BIM (10 M) durante 15 h en ausencia o presencia de Wnt3a-CM. fracciones citosólicas se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia de Western con anti-fosfo-p33 /37-β-catenina o anticuerpo anti-β-catenina. células reportero (G) HEK293 se transfectaron con el control negativo (NC) siRNA (40 nM) o PKCa siRNA (40 nM), y luego incubadas con CGK062 (25 M) durante 15 h en ausencia o presencia de Wnt3a-CM. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-beta-catenina y anti-p33 /37-ß-catenina. En (F) y (G), la misma cantidad de β-catenina se cargó en cada carril.
A continuación, examinamos si la actividad PKCa es esencial para la degradación mediada por CGK062 β-catenina. La inhibición de la actividad PKCa utilizando BIM I abolió la baja regulación de la β-catenina por CGK062 (Figura 3C). En particular, la depleción selectiva de PKCa endógenos utilizando interferentes pequeños ARN (siRNA) también anuló la degradación inducida por CGK062 ofβ-catenina (Figura 3D), lo que indica que PKCa es responsable de la degradación de β-catenina por CGK062.
a continuación, para comprobar si CGK062 promueve directamente la fosforilación mediada por PKCa β-catenina en Ser33 /37, se realizó un
in vitro
ensayo de quinasa en el uso de bacterias que expresaban la β-catenina y PKCa purificada. PKCa fosforilada fácilmente β-catenina en presencia de CGK062 y BIM I inhibida esta fosforilación (Figura 3E). También se examinó si CGK062 promueve la fosforilación mediada por PKCa β-catenina en Ser33 /Ser45 37 y en las células HEK293 reportero. El análisis de transferencia Western mostró que Wnt3a-CM inhibe la fosforilación de la β-catenina en Ser33 /37 y Ser45 (Figura 3F, S6 y S7). Además, CGK062 indujo la fosforilación de β-catenina en Ser33 /37 y Ser45 (Figura 3F, S6 y S7), y Ser33 /37 fosforilación fue abrogada por la adición de BIM I (Figura 3F). Consistentemente, el tratamiento CGK062 rescató la fosforilación de β-catenina en Ser33 /37, que fue inhibida por Wnt3a-CM, y la caída de PKCa marcadamente suprimida inducida por CGK062 Ser33 /37 fosforilación en células HEK293 reportero (Figura 3G).
CGK062 también promueve la degradación de β-catenina en las células cancerosas CRT-positivo
a continuación se probó si CGK062 activa en las células cancerosas PKCa CRT-positivas, tales como PC3 (cáncer de próstata), SNU475 (hepatoma), y SW480 (cáncer de colon). Consistente con los resultados de las células HEK293, CGK062 promueve la translocación de PKCa a la membrana plasmática en las células cancerosas (Figura 4A). Para determinar si CGK062 también inhibe la función de β-catenina en células de cáncer de CRT-positivo, TOPflash plásmido se transfectó en células de cáncer de CRT-positivo seguido de tratamiento con concentraciones crecientes de CGK062. Como se muestra en la Figura 4B, CGK062 reprimido constantemente CRT en PC3, SNU475, y las células SW480. En paralelo con este experimento, se determinó el efecto de CGK062 en el nivel de citosólico β-catenina en estas células de cáncer de CRT-positivas por análisis de transferencia de Western. Consistentemente, el tratamiento de CGK062 dio como resultado la baja regulación de nivel de β-catenina intracelular de una manera dependiente de la concentración en el PC3, SNU475, y las células SW480 (Figura 4C). También se encontró que CGK062 promueve la fosforilación de β-catenina en Ser33 /37, y esta fosforilación fue abolida por BIM I en las células SW480 (Figura S8). Estos resultados indican que CGK062 también induce la degradación de β-catenina en células de cáncer de CRT-positivo
.
(A) las fracciones citosólicas y de membrana se prepararon a partir PC3, SNU475, y las células SW480 tratadas con vehículo (DMSO) o CGK062 para transferencia de Western con anticuerpo anti-PKCa. Las transferencias se volvieron a sondar con anti-tubulina o anticuerpos anti-MDR como controles de fracciones. (B) PC3, SNU475, y células SW480 se co-transfectaron con TOPFLASH y pCMV-RL plásmidos y se incubaron con CGK062 para 15 h. Las actividades de luciferasa se midieron 39 horas después de la transfección y se presenta como unidad de luz relativa (RLU) normalizada a
Renilla
actividades de luciferasa. Los resultados son la media de tres experimentos, y las barras indican las desviaciones estándar. *,
P
& lt; 0,05, y **,
P
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control del vehículo. (C) proteínas citosólicas se prepararon a partir PC3, SNU475, y las células SW480 tratadas con el vehículo (DMSO) o CGK062 durante 15 h y después se sometieron a transferencia Western con anticuerpo β-catenina. Las transferencias se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina para confirmar la igualdad de carga.
CGK062 reprime la expresión de genes de β-catenina que dependen
Para determinar si CGK062 afecta a la expresión de β- genes catenina-dependientes, de la actividad del promotor de
ciclina D1
, que es un gen β-catenina dependiente conocido, se evaluó. Un constructo indicador que contiene el
ciclina D1
promotor, que contiene una región de respuesta β-catenina /TCF-4, se transfectó en PC3, SNU475, y células SW480, seguido de tratamiento con diferentes concentraciones de CGK062. Como se muestra en la Figura 5A,
ciclina D1
actividad promotora fue reprimida por CGK062 en estas células cancerosas CRT-positivo. También se evaluó el nivel de proteína de la ciclina D1 en las células cancerosas CRT-positivos tratados con CGK062. De acuerdo con nuestro resultado para el
ciclina D1
promotor, una disminución dependiente de la dosis en la ciclina D1 expresión de la proteína se observó en respuesta a CGK062 (Figura 5B) en PC3, SNU475, y las células SW480. Además, la expresión de
c-myc
y
axina-2
, abajo objetivos establecidos de la β-catenina [9], fueron también redujo significativamente en estas células cancerosas CRT-positivas después de la incubación con CGK062 (Figura 5B). En estas condiciones, el nivel de PKCa no cambió en respuesta a diferentes concentraciones de CGK062 (Figura S9).
PC3, SNU475, y células SW480 (A) fueron co-transfectadas con ciclina D1-RL y pSV40- FL y, a continuación, se incubaron con cantidades indicadas de CGK062 para 15 h. Las actividades de luciferasa se midieron 39 h después de la transfección. la actividad del promotor de ciclina D1 se reporta como unidad de luz relativa (RLU) normalizó a la actividad de la luciferasa de luciérnaga. Los resultados son el promedio de tres experimentos, y las barras indican las desviaciones estándar. *,
P
& lt; 0,05, y **,
P
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control del vehículo. (B) PC3, SNU475, y células SW480 se incubaron con el vehículo (DMSO) o CGK062 durante 15 h y luego se prepararon extractos celulares por transferencia Western con anti-Axin, anti-ciclina D1 y anticuerpos anti-myc. Para confirmar la igualdad de carga, las transferencias se volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina.
CGK062 inhibe la proliferación de CRT-positivas las células cancerosas
in vitro
y
in vivo
estudios recientes han demostrado que la interrupción de la función β-catenina por antisentido, ARNsi, o estrategias de antagonistas de Wnt secretadas se ha demostrado que inhibe específicamente el crecimiento de células de cáncer de CRT-positivas [20] - [22] . Dado que CGK062 promovió la degradación intracelular de β-catenina, la hipótesis de que CGK062 también suprime la proliferación de células de cáncer de CRT-positivo. Para explorar esta hipótesis, se evaluó el efecto de CGK062 sobre el crecimiento de diversas células de cáncer de CRT-positivo. Como se muestra en la Tabla 1 y la Figura S10, CGK062 inhibe eficazmente el crecimiento de células de cáncer de colon CRT-positivas (células PC3 DLD-1, SW480, HCT15, SNU475, y) con IC
50 valores de 1,62 M a 18,60 M. Tomados en conjunto, estos resultados indican que CGK062 inhibe notablemente la proliferación celular de las células cancerosas CRT-positivo.
A fin de evaluar la actividad antitumoral de CGK062
in vivo
, Teniendo Establecida ratones desnudos atímicos Carolina del Sur tumores de xenoinjertos PC3 se trataron diariamente con inyecciones i.p. administración de CGK062 durante 5 semanas a 50 y 100 mg /kg. En comparación con el vehículo (control), el tratamiento de ratones con CGK062 el crecimiento del tumor PC3 inhibió significativamente (Figura 6A). Una dosis de 100 mg /kg CGK062 indujo una inhibición casi completa del crecimiento del tumor. Incluso en la dosis de 50 mg /kg, CGK062 inhibió el crecimiento del tumor por ~ 70% con respecto al grupo control. Todos los ratones toleraron el tratamiento sin pérdida significativa del peso corporal (Figura 6B).
(A y B) CGK062 inhibe el crecimiento del cáncer de próstata xenoinjerto de tumor
in vivo
. xenoinjertos de tumores PC3 subcutáneos se establecieron y los tratamientos se administraron como se describe en Materiales y Métodos. (A), la media de los volúmenes tumorales (n = 6) (B), significan cambios medios de peso corporal durante el tratamiento. *,
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con el grupo control del vehículo
Discusión
aberrante sobre regulación de β-catenina intracelular está implicado en el desarrollo. de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata, cáncer colorrectal y carcinoma hepatocelular [6] - [8]. En este informe, se utilizó una proyección basada en células para identificar CGK062 como un potente inhibidor de la vía /β-catenina vía. CGK062 proporcionado considerable ventaja terapéutica con respecto a la potencia antitumoral en diversos transcripción respuesta β-catenina (CRT) células de cáncer de -positivos, tales como células de cáncer de colon (SW480, DLD-1, y HCT15), carcinoma hepatocelular (SNU475), hormona-refractario las células de cáncer de próstata (PC3).
PKCa activado por CGK062 catalizada por la fosforilación de β-catenina en Ser33 /Ser37, y por lo tanto reducen el nivel de β-catenina intracelular por la degradación proteasomal β-TrCP-dependiente. Además, la inhibición farmacológica y PKCa siRNA abrogadas inducida por CGK062 β-catenina fosforilación /degradación, indicando que PKCa es responsable de la inhibición mediada por CGK062 de la vía /β-catenina Wnt. Los resultados de varios estudios, entre ellos algunos realizada previamente en nuestro laboratorio, sugieren un papel clave para PKCa en la regulación de la señalización /β-catenina vía. Wnt5a participa en la movilización de Ca intracelular
2 +, la activación subsiguiente de PKCa, y la inhibición de la vía Wnt /β-catenina [23], [24]. Orford
et al.
[25] informó de que los inhibidores de PKC causan acumulación de β-catenina en las células de cáncer de mama humano. Recientemente, huérfanos α del receptor nuclear relacionadas con el ácido retinoico (alfa ROR) se muestran para atenuar la señalización Wnt /β-catenina en el cáncer de colon mediante la estimulación de la fosforilación dependiente de PKCa [26]. Anteriormente, hemos demostrado que PKCa regula negativamente la señalización de Wnt /β-catenina en las células HEK293, que tienen la función normal de la vía Wnt /β-catenina [17] y que PKCa regula el nivel de β-catenina intracelular en las células de cáncer de colon [18]. El presente estudio se extiende estos resultados anteriores, mostrando que la activación de PKCa por un nuevo agonista, CGK062, promueve la degradación de β-catenina en tres líneas celulares de cáncer - PC3 (cáncer de próstata), SNU475 (hepatoma), y SW480 (cáncer de colon) - que muestran aberrante regulación del nivel de β-catenina intracelular
.
los inhibidores de molécula pequeña que antagonizan CRT han sido descubiertos por cribado de alto rendimiento. Las moléculas pequeñas que bloquean la asociación entre las actividades de β-catenina impair β-catenina-dependientes TCF4 y, como la proliferación celular y la duplicación del eje dorsal embrionaria en
Xenopus laevis
[27]. Otra molécula pequeña, ICG-001, que bloquea la interacción entre β-catenina y la respuesta cíclica AMP elemento vinculante proteína (CBP), específicamente induce la apoptosis en células de cáncer de colon [28]. Otros dos moléculas pequeñas, IWR-3 y XAV939, se muestran recientemente para estimular la degradación de β-catenina mediante la estabilización de axina y inhibiendo de este modo la proliferación de células de cáncer de DLD-1 de colon, que llevan una mutación en [29], [30 APC ]. En contraste con las moléculas pequeñas previamente estudiados, CGK062 redujo el nivel intracelular de β-catenina a través de la fosforilación mediada por PKCa /degradación. En particular, era capaz de promover la degradación de β-catenina en células de hepatoma SNU475, que llevan una mutación axina, así como en células de cáncer de colon SW480 con APC mutación, y suprimió el crecimiento de células de cáncer de CRT-positivo. CGK062 claramente suprimida el crecimiento de los tumores de próstata PC3 en un modelo de ratón con xenoinjerto, en consonancia con los resultados de nuestro
in vitro
análisis.
En conclusión, hemos identificado CGK062 que promueve β- mediada por PKCa fosforilación catenina y su degradación. CGK062 reprime la expresión de sus genes diana, incluyendo los que codifican la ciclina D1, c-myc y axina-2, suprimiendo así el crecimiento del tumor
in vitro
y
in vivo
. Tomados en conjunto, CGK062 representa un tratamiento prometedor candidato de los cánceres CRT-positivo.
Materiales y Métodos
Cultivo de células, plásmidos, transfección y luciferasa ensayo
HEK293, PC- 3, SNU475, DLD-1, HCT15, SW480, y Wnt3a secretoras de células L se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 120 g /ml de penicilina, y 200 mg /ml de estreptomicina. Wnt3a-medio condicionado (Wnt3a-CM) se preparó como se describe anteriormente [31]. Se estableció el reportero y control de la línea celular HEK293 como se describe anteriormente [32]. Los plásmidos informadores pTOPFlash y pFOPFlash se obtuvieron de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EE.UU.). El negativo β-TrCP (Δβ-TrCP) plásmido de expresión dominante fue un regalo de M. Davis (Escuela de Medicina de la Universidad Hebrea de Hadassah, Israel). pCMV-RL y pSV-FL plásmidos se adquirieron de Promega. PKC siRNA fue diseñado como se describe anteriormente [17]. La transfección se realizó con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El ensayo de luciferasa se realizó utilizando un kit de ensayo de luciferasa dual (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
La detección de un inhibidor de molécula pequeña de Wnt /β-catenina señalización
El reportero HEK293 las células se inocularon en placas de 96 pocillos a 15.000 células por pocillo en duplicado y se cultivaron durante 24 h. Se añadió Wnt3a-CM, a continuación, los compuestos (800 compuestos) incluyendo cumarinas, flavonoides, naftoquinonas, y se añadieron terpenoides a los pocillos a una concentración final de 30 mM. Después de 15 h, las placas se sometieron a ensayo para actividad de luciferasa de luciérnaga y la viabilidad celular.
Preparación de la fracción de membrana
Las células cultivadas en placas de cultivo de 100 mm se lavaron con PBS enfriado en hielo. Después las células se suspendieron en 1 ml de tampón de extracción enfriado con hielo (Tris 20 mM (pH 7,5), EDTA 0,5 mM, y EGTA 0,5 mM); homogeneizaron usando una jeringa (26G); y se incubaron en hielo durante 30 min. El homogeneizado se centrifugó a 13.400 ×
g
durante 2 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se centrifugó a 100.000 x
g
durante 30 min a 4 ° C en un rotor 100Ti (Beckman, EE.UU.). El sedimento se suspendió en tampón de extracción que contiene 0,5% (w /v) de Triton X-100.
Western blotting
La fracción citosólica se preparó como se describe anteriormente [33]. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en un gel de gradiente de 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las membranas fueron bloqueadas con 5% de leche descremada y se sondearon con anti-β-catenina (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EE.UU.), anti-fosfo-β-catenina (Ser33 /Ser37 /Thr41) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), anti-fosfo-β-catenina (Ser45) (Cell Signaling Technology), anti-ciclina D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology), anti-PKCa (BD Transducción Laboratories), anti-axina (BD Transducción Laboratories), anti-β-TrCP (Santa Cruz Biotechnology), anti-MDR1 (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpos anti-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.) . Las membranas fueron incubadas con IgG anti-ratón peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG o anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology) y se visualizaron usando el sistema ECL (Santa Cruz Biotechnology).
extracción de RNA y semi-cuantitativo RT -PCR
el ARN total se aisló con reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la síntesis de ADNc, la transcripción inversa y la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se realizaron como se describe anteriormente [32]. El ADN amplificado se separó en geles de agarosa al 2% y se tiñó con bromuro de etidio.
Inmunofluorescencia análisis
HEK293cells fueron cultivadas en portaobjetos de cámara de vidrio y después se trataron con DMSO o CGK062 para 15 h. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído al 4%, se permeabilizaron en 0,3% de Triton X-100, y se bloquearon en 4% de albúmina de suero bovino durante 1 h. durante 4 semanas.