Extracto
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es el más mortal de los tumores malignos ginecológicos, debido en parte a su metástasis clínicamente oculta . Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan la difusión y la invasión EOC puede proporcionar nuevas dianas para terapias antimetastásicas o nuevos métodos para la detección de la enfermedad metastásica. La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) a menudo se desregula en la EOC. Por otra parte, la actividad de PKA y la localización subcelular de A-quinasa anclaje de proteínas (AKAPs) son importantes reguladores de la dinámica del citoesqueleto y la migración celular. Por lo tanto, hemos tratado de estudiar el papel de la función PKA y AKAP tanto en la migración celular y la invasión EOC. Usando el biosensor dirigida membrana plasmática PKA, pmAKAR3, y un ensayo de migración /invasión mejorada, mostramos que PKA se activa en el borde delantero de la migración de células SKOV-3 EOC, y que la inhibición de los bloques de la actividad de PKA SKOV-3 migración celular. Además, se muestra que si bien la actividad de PKA en el borde de ataque de estas células está mediada por el anclaje del tipo II reguladoras subunidades de PKA (RII), la inhibición de la fijación de cualquiera de RI o RII PKA subunidades la migración celular bloques. Es importante destacar que, también mostramos - por primera vez - que la actividad de PKA es hasta reguladas en el borde delantero de Skov-3 células durante la invasión de una matriz extracelular tridimensional y, como se ha visto para la migración, la inhibición de cualquiera de la actividad de PKA o AKAP mediada por PKA bloques de anclaje invasión de la matriz. Estos datos son los primeros en demostrar que la invasión de la matriz extracelular por las células de cáncer provoca la activación de PKA en el borde de ataque invasivo y que se requieren tanto la actividad de PKA y de anclaje para invasión de la matriz. Estas observaciones sugieren un papel de la actividad PKA y AKAP en EOC metástasis
Visto:. McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) la proteína quinasa A Actividad y anclaje son necesarios para la migración de las células del cáncer ovárico y la invasión. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10.1371 /journal.pone.0026552
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 16 Junio, 2011; Aceptado: September 28, 2011; Publicado: 19 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 McKenzie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la subvención#R01GM074204 (a AKH) de los Institutos nacionales de /Instituto Nacional de Ciencias médicas generales de la Salud (http://www.nigms.nih.gov) y de una beca postdoctoral (a SLC) desde el Centro de cáncer de Vermont y el lago Champlain Organización de Investigación del cáncer (http://www.vermontcancer.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) es la quinta causa más común de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos y tiene la tasa más alta de mortalidad de todos los cánceres ginecológicos [1]. Aproximadamente el 80% de los pacientes se presentan con enfermedad en etapa tardía y menos del 25% de esas mujeres se curan. EOC constituye la inmensa mayoría (& gt; 90%) de los tumores malignos de ovario y es único en su difusión clínicamente oculto y la metástasis [2]. En contraste con la mayoría de los otros tipos de carcinoma, la difusión de EOC través del sistema vascular y la formación de metástasis distales en verdad es un acontecimiento raro. células EOC arrojan desde el tumor primario en la superficie del ovario y exfoliar en la cavidad peritoneal. La colocación anatómica de los ovarios facilita la diseminación local de EOC, que puede ocurrir por la migración directa y la invasión de las células tumorales desde y hacia los órganos adyacentes, así como a través del transporte de las células tumorales exfoliadas por toda la cavidad peritoneal por el flujo de fluido peritoneal normal [2] , [3]. Debido a este modo de único y furtiva de difusión, los esfuerzos en el desarrollo de métodos para la detección precoz del COE no han tenido éxito [4], [5], [6]. A pesar de la cirugía, la quimioterapia citorreductora de combinación y estrategias para la determinación de biomarcadores séricos, locales y células chemoresistant difundidos persistir y, finalmente, florecer, lo que lleva a la alta recurrencia y & lt; 25% de tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con EOC [3], [5], [7], [8], [9]. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que regulan la difusión EOC y la invasión tiene el potencial de tener un impacto significativo en el curso de la enfermedad.
Debido a la dependencia de la difusión EOC y metástasis en la migración celular y la invasión , nuestro laboratorio ha esforzado por comprender los mecanismos subyacentes a estos procesos en la EOC. La migración celular es un proceso altamente ordenado que requiere un esfuerzo coordinado entre numerosas proteínas en regiones subcelulares [10], [11], [12]. Hemos demostrado previamente que la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es importante para la migración celular y la dinámica de vanguardia en un número de células [13], [14], [15]. PKA es una quinasa heterotetrameric que puede existir en dos isoformas, de tipo I y de tipo II, dependiendo de la isoforma de la subunidad reguladora (RI y RII) asociado con la holoenzima. PKA tiene numerosos objetivos asociadas con el movimiento actomyosin basado en células [16] y los primeros estudios mostraron que la hiper-activación o inhibición de la PKA inhibieron la migración quimiotáctica de células [16], [17], [18]. Este papel aparentemente contradictoria para PKA se clarificó por la demostración de que, además de la actividad global, la localización de PKA en el espacio subcelular, mediada a través de la unión de subunidades de PKA R a A quinasa anclaje proteínas (AKAPs; [19], [20]) , regula la migración de células [13], [21], [22]. Específicamente, se ha demostrado que las subunidades y la actividad de PKA son ambos enriquecidos en estructuras de protrusión en el borde delantero de células que migran [13], [21], [22]. Por otra parte, la amplia inhibición de tipo I y tipo II anclaje (
es decir
anclaje a través de RI o subunidades RII) en general [13], [21], o la inhibición específica de proteínas de anclaje individuales (
por ejemplo,
AKAP-LBC; [22]), inhibe la migración. Estos y otros informes (revisado en [23], [24]), establecer la importancia de la localización de la actividad de PKA a diferentes localizaciones subcelulares durante los procesos migratorios celulares normales.
Para subrayar la importancia potencial de PKA en la patogénesis del cáncer de ovario son las observaciones de que la actividad de PKA y la expresión de la subunidad a menudo se dysregulated en EOC. La expresión de la subunidad catalítica de PKA [25] y regulatorio RI subunidad [26], [27], [28] se correlaciona con el estadio avanzado y /o EOC más agresivo. Además, los niveles de mRNA de AKAP3 (
aka
AKAP110 o proteínas vaina fibrosa de 90 kDa (FSP90)) en los tumores de ovario se correlaciona positivamente con el estadio de la enfermedad y el mal pronóstico [29], [30], mientras que otros dos AKAPs - AKAP1 (
aka
AKAP149) y AKAP13 (
aka
AKAP-LBC) - también parecen ser hasta reguladas en mucinosos EOC (A. Howe, observaciones no publicadas de Oncomine). A pesar de estas observaciones, el significado funcional de PKA y la señalización AKAP en las células metastásicas EOC no ha sido bien investigado.
Dada la importancia de la PKA y AKAP función para la migración celular y su desregulación en EOC, se determinó la regulación espacial de la actividad de PKA en la migración de las células EOC y determina si se requiere la actividad de PKA y anclaje para la migración celular EOC. En este caso, nos informan de que la actividad de PKA es hasta reguladas en el borde de ataque de las células EOC no sólo durante la migración, sino también durante la invasión de la matriz extracelular, también. Además, la inhibición de la actividad de PKA y la migración celular AKAP bloques de función EOC y la invasión. Estas observaciones demuestran, por primera vez, la importancia de la PKA de anclaje para la invasión de la matriz y establecer la importancia de la actividad PKA espacialmente regulado de la migración y la invasión - y por lo tanto quizás metástasis - de las células EOC
Materiales y Métodos.
Reactivos y la célula Cultura y
Skov-3 y células COS-7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en libre de antibióticos medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (vol /vol) de suero bovino fetal (FBS). células HIO-80 fueron un generoso regalo del Dr. Andrew Godwin (Departamento de Oncología Molecular, Fox Chase Cancer Center) y se mantuvieron en una mezcla 01:01 de antibióticos Medio 199 libre: MCDB-105 suplementado con FBS al 4% y 0,2 U /ml de insulina porcina. Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2. DMSO, citocalasina D y azul de tripano se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). GM6001 fue obtenida de Millipore (Billercia, MA). Rojo fenol libre de Matrigel y fibronectina humana fueron adquiridos de BD Biosciences (Bedford, MA). La inhibición farmacológica de la actividad de PKA se consiguió usando H89 o MPKI (Biomol). H89 es un isoquinolona que compite con ATP por la unión a PKA; a pesar del uso generalizado y la potencia considerable, exhibe sólo una modesta especificidad para PKA [31]. MPKI, un inhibidor altamente específico de PKA, es un péptido myristoylated, permeable a las células que comprende las inhibidora región pseudo-sustrato (aminoácidos 14-27) de la proteína endógena de la proteína quinasa A inhibidor (PKI) [14]. La inhibición farmacológica de la PKA de anclaje se logró utilizando StHt31 (Promega), un péptido de estearato de que comprende el dominio de unión de PKA R-subunidad de HT31 (
aka
AKAP-LBC); Por lo tanto, StHt31 actúa como un inhibidor competitivo de células permeable de la interacción entre AKAPs endógenas y tanto RII y, a concentraciones algo más altas, las subunidades RI PKA [32], [33]. inhibidores genéticos de la actividad de PKA y de tipo I o de tipo II de anclaje PKA se describen a continuación.
Plásmidos y transfección
El plásmido que codifica mCherry-fusionado a la proteína PKI inhibidor de PKA (ver arriba ) ha sido descrito previamente [14], mientras plásmidos que codifican GFP fusionado al inhibidores de anclaje de tipo I o de tipo II (RI disruptor de anclaje (RIAD; [34]) y superAKAP
-en silico gratis (sAKAP
es
; [32], respectivamente), así como su correspondiente revueltos (
scr
) controles negativos, se generaron utilizando oligonucleótidos fosforilados en 5 '(Invitrogen) listados en la Tabla S1 Específicamente,. oligos complementarios fueron recocidas, generando 5 '
Sal
I y 3'
BamH I
extremos pegajosos, después se ligó directamente en
Sal
I /
BamH
I-digerido pEGFP-C1 (Clontech). mCherry versiones de la RIAD y sAKAP
se
se generaron mediante la sustitución de la
Nhe
I-
BamH I
fragmento que codifica la EGFP en el respectivos plásmidos con el
Nhe
I-
BamH I
fragmento del pmCherry-C1. Para la transfección y la expresión transitoria de proteínas, las células fueron transfectadas utilizando Fugene6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 6 l de Fugene6 a 100 l de suero y DMEM libre de antibiótico, se agitan brevemente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Se añadió un total de 1,5 g de ADN a la mezcla, sometió a vórtice brevemente y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se añadió gota a gota a una placa de 35 mm que contiene células a entre el 80-90% de confluencia, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos, la mezcla, y luego regresó a la incubadora. Todos los experimentos se realizaron entre 24 a 48 h después de la transfección.
inmunofluorescencia
Para la visualización de la actina, la fibronectina, paxilina, y subunidades de PKA RIα y RIIα, las células se fijaron en 3,7% de formaldehído en PBS durante 10 min, se permeabilizaron por 10 min en PBS que contenía 0,25% de Triton x 100, se bloquearon con PBS que contenía 3% de BSA ya sea durante 1 h a RT o durante la noche a 4 ° C y luego se incubaron con anti-fibronectina (1:400, BD Transduction) , anti-paxillin (1:500, BD Transduction), anti-PKA RIα o RIIα (Genetex 1:200 y BD Transduction 1:200 respectivamente) anticuerpos primarios para 1 h a TA. Después de lavar 3 x 5 min con PBS, las células se incubaron con Alexa-594 burro acoplado anti-ratón anticuerpo secundario (Invitrogen, 1:400) y Alexa-488 faloidina conjugada (Invitrogen, 1:100) durante 1 h a TA. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio para microscopio (Fisher) con un pequeño volumen de medio de montaje PermaFluor (Thermo Scientific). imágenes de epifluorescencia fueron capturados, aunque 10, 20, 40, y los objetivos de 60X Plan de Apo en un microscopio Nikon Eclipse TE-2000E invertida utilizando los filtros adecuados fluoróforo específica (Chroma Technology Corp, Rockingham, VT) y una cámara CoolSnap HQ (Fotometría, Tucson , AZ) controlado por software de los elementos (Nikon).
migración de curación de heridas ensayo
cubreobjetos de vidrio se esterilizaron por inmersión consecutiva en intervalos de 30 min en concentraciones crecientes (70, 95, 100%) de EtOH. Los cubreobjetos se retiraron de EtOH y se secaron al aire en la campana de cultivo de tejidos. Una vez secos, los cubreobjetos estériles se recubrieron en 20 mg /ml de fibronectina humana diluida en PBS estéril o bien durante la noche a 4 ° C o 2 horas a 37 ° C. Una monocapa confluente de células se sembró en cubreobjetos de ECM conjugados y se deja que se adhieran durante la noche. Una herida se hizo en la monocapa por raspado de una punta de pipeta estéril p200 través de las células, y los cubreobjetos se lavaron una vez con PBS estéril para eliminar los residuos de células. Las imágenes se adquirieron usando un objetivo 10x plan Apo en el microscopio invertido Nikon Eclipse TE-2000E como se describe anteriormente.
Trypan Blue exclusión Ensayo
Para evaluar la viabilidad celular, una mezcla 01:01 de tripano azul (0,4%, Sigma) y medio libre de suero que contiene 1% de BSA se añadió a las células y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min ya sea inmediatamente después de la eliminación de la rosquilla o la creación de la herida en la monocapa. Las imágenes fueron tomadas de la periferia de la rosquilla y a lo largo de todo el margen de la herida utilizando un objetivo 10X Plan de Apo en la Nikon Eclipse TE-2000E como se describió previamente.
La fabricación de juntas de silicona
Cuarenta g de Sylgard 184 de elastómero de silicona (Ellsworth Adhesives) y 4 g de Sylgard 184 elastómero de agente de curado se mezclaron rigurosamente hasta nublado con burbujas. La mezcla turbia se vertió en una placa de 10 cm de cultivo de tejido estéril a una profundidad de 2-4 mm de altura. Las burbujas se eliminaron colocando el plato en un 850 ml recipiente Desi-Vac (Fisher) y la evacuación de la cámara de 60 veces y permitiendo que la cámara en reposo durante 10 min. Esta etapa se repitió dos veces o hasta que la mezcla estaba libre de burbujas. La mezcla de silicona se dejó curar a temperatura ambiente durante 48 horas o durante una hora en una placa caliente 84 ° C hasta que esté completamente polimerizada. La plantilla de silicona se retiró suavemente de la placa y se coloca sobre una superficie limpia y seca adecuada para el corte. Para fabricar la junta en forma de rosquilla, un punzón de biopsia de 6 mm se utilizó para generar un cilindro de silicona, y un punzón de biopsia 2 mm se utilizó para hacer un agujero más pequeño en el centro del cilindro de 6 mm. Los "anillos de espuma de silicona" se lavaron entonces en Liquinox (diluido 1:10 en agua nanopura) durante 15 min, se aclaró 10 veces con agua nanopura, se lavó con EtOH al 70% durante 15 min, luego se almacena en fresco 70% EtOH hasta que se necesite.
buñuelo de la migración /invasión de ensayo
cubreobjetos de vidrio estériles se revistieron con 20 mg /ml de fibronectina como se describe anteriormente. , buñuelos de silicona estériles limpias se dejaron secar al aire antes de colocar a los cubreobjetos recubiertos. Un cambio en la refracción en la interfaz de rosquilla cubreobjetos puede ser visto como la rosquilla se adhiere por contacto conforme. Las células subconfluentes se privaron de suero la noche antes del ensayo. Las células se trataron con tripsina y se resuspendieron en el medio libre de suero apropiado que contiene 1% de BSA y se contaron usando un hemocitómetro. Las células se colocaron en placas a confluencia (6000 células /donuts para SKOV-3, COS-7, y HIO-80) en un volumen 10 l usando una punta de carga de gel estéril en el centro de la junta en forma de rosquilla de manera que contenga las dentro de un área confinada. El número de células requeridas para formar una monocapa confluente depende de la ECM elegido, el diámetro del pozo interior de la rosquilla, y la capacidad de difusión de las células, y por lo tanto necesita ser determinado empíricamente para cada línea celular. PBS estéril se añadió alrededor de la junta para evitar la evaporación del pequeño volumen de medios de comunicación. Después de adherir durante la noche, el PBS se aspiró, y los donuts se retiraron cuidadosamente usando pinzas estériles. Los núcleos se tiñeron utilizando Hoescht 33342 tinción nuclear (Invitrogen, 1:2000 en medios) durante 15 min a 37 ° C. Los medios de comunicación tinción fue removido y reemplazado con medio completos o medios que contienen agentes farmacológicos como se describe en las leyendas de las figuras. Para ensayos de invasión, la monocapa con tinción de Hoescht se cubrió con rojo fenol libre de Matrigel y se incubó durante 15 min a 37 ° C para permitir la polimerización. Las células fueron entonces embebidos complementan con medio completo o tratadas como en el ensayo de migración. imágenes iniciales se adquirieron a través de un objetivo 2X PlanApo en un microscopio invertido Nikon Eclipse TE-2000E como se describe anteriormente. Las células se trataron con 10 ng /ml de EGF o alta en suero (10%) para estimular la migración. Imágenes adicionales fueron adquiridos después de los tiempos indicados y pares de imágenes de estado inicial y final fueron analizados utilizando la configuración predeterminada de una macro ImageJ encargo por escrito (DonutQuant disponibles como texto S1). En pocas palabras, los centros de macro y los umbrales de las dos imágenes iniciales y finales estatales, entonces elimina las células de extrema atípicos, es decir,
células fuera del monocapas circulares que son demasiado para ser atribuible a la migración (por ejemplo,
células que han soltado y flotaba en el de otra área del plato). a continuación, se crea una máscara de la imagen inicial centrado y superpone sobre la imagen final sobre el estado y todos los núcleos fuera de la frontera de la máscara de la imagen inicial, se cuentan como células migradas.
FRET Imaging
SKOV-3 células que expresan la actividad PKA biosensor, pmAKAR3 [35], [36], se enjuagaron y se mantuvieron en Leibovitz L-15 medio para obtener imágenes de FRET. Las células fueron imágenes en un microscopio TE-2000E Nikon Eclipse con una lente de objetivo 60 × /1.4 NA Plan de Apo de inmersión en aceite y se enfrió cámara CCD. PPC, YFP y las imágenes FRET fueron adquiridos 10 horas después del inicio del ensayo. La adquisición se estableció con la exposición de 700 ms y 2 × 2 de agrupación de las tres adquisiciones. Las imágenes de cada canal se sometieron a la sustracción del fondo, y las relaciones de color amarillo a cian se calcularon usando el plugin de FRET Analizador de ImageJ. Pseudocolor imágenes se generaron utilizando 'Relación' ImageJ la tabla de consulta. Las imágenes quedaron fondo-resta utilizando la función de "fondo Reste" en ImageJ, con un radio de balanceo de la bola 500.
Resultados
PKA actividad se incrementa en el borde delantero de la migración al azar Skov-3 células
trabajos anteriores habían demostrado la activación de PKA discreta en el borde de ataque migratoria de muchos [13], [21], [22], pero no todos [37] tipos de células. Para determinar si PKA se activó en el borde delantero de la migración de células de EOC, células SKOV-3 EOC humanos se transfectaron con pmAKAR3, una membrana dirigida biosensor FRET plasma para la actividad de PKA [21], [36], a continuación, chapados en FN-revestido cubreobjetos de vidrio, estimuladas con 10 ng /ml de EGF durante 4-6 horas (para promover el azar, la migración chemokinetic), y supervisados por imágenes de células vivas. la actividad de PKA (tal como se indica por razones de FRET elevadas) era, en efecto, de forma discreta y dinámicamente elevada dentro del borde de ataque de la migración de células SKOV-3 (Figura 1 y de la película S1). Esto sugiere que aumentos locales en la actividad de PKA juegan un papel en la regulación de la dinámica de los principales de borde, y por lo tanto la migración de la migración de células activamente EOC. Esta hipótesis fue apoyada por los principios, los experimentos exploratorios en el que Skov-3 células fueron objeto de la curación de heridas ensayos de migración o cero en la ausencia o presencia de inhibidores ampliamente utilizados de la actividad de PKA (H89 y MPKI; véase Materiales y Métodos)) y de anclaje (StHt31; véase Materiales y Métodos). El examen de la morfología celular poco después del inicio de estos ensayos mostró efectos significativos de estos inhibidores en los más importantes morfología borde y la migración (Figura S1). En concreto, las células no tratadas emigraron a áreas heridas de manera eficiente y con un amplio, agitando lamelipodia (Figura S1 A y D). En contraste, las células en las que la actividad de PKA se inhibió con la H89 inhibidor de PKA no selectivo o el inhibidor altamente selectivo MPKI no migran de manera eficiente y apenas entró en el espacio de la herida, mostrando que lleva estructuras de borde desprovistos de volantes pero plagados de adhesiones focales - evocando un adhesivo, la difusión de fenotipo más de una de la migración (Figura S1B y D). Las células en las que PKA anclaje fue interrumpido por StHt31 entraron en el espacio de la herida en un grado mayor que H89- o células tratadas con MPKI pero, a diferencia de las células de control, expuesta múltiple, de forma errática-espaciados bordes por célula (Figura S1c y D) agitando. En conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que la migración de células EOC podría requerir la actividad de PKA y anclaje requiere y queda investigación adicional utilizando enfoques más sofisticados y reactivos específicos.
Skov-3 células fueron transfectadas con pmAKAR3, chapados a la fibronectina recubierto platos durante la noche, se estimularon con 10 ng /ml de EGF durante 4-6 horas, y luego imágenes de microscopía FRET. Las imágenes fueron capturadas cada 30 segundos, a continuación, pseudocoloreada de acuerdo a la proporción de FRET (escala de color se muestra en el cuadro 0 '): este montaje representa marcos de 2 minutos de diferencia. Para toda la secuencia, ver vídeo S1. Barra de escala = 5 micras.
EOC migración celular está regulada por la actividad y el anclaje de PKA
ensayos de migración de curación de heridas, mientras que barato y fácil de implementar, sufren de varias limitaciones, no menos de la que son lesión fatal a las células a lo largo de la parte delantera de ensayo y la eliminación de la matriz extracelular subyacente (ECM). Por lo tanto, una condición experimental que resulta en la migración ineficiente en este ensayo puede reflejar, por ejemplo, aumento de la sensibilidad al daño del espectador o el fracaso para producir
de novo matriz
en el que migrar. Por lo tanto, para promover y explorar mejor el requisito de la actividad de PKA y anclaje específicamente para la migración de células EOC, hemos desarrollado una versión mejorada de un ensayo de migración descrito anteriormente [38] que mide fácilmente y con precisión el número de células que migran de manera radial a partir de una monocapa definido circular (Figura 2; véase Materiales y Métodos para detalles). Nuestro ensayo - acuñado el "ensayo de rosquilla ', después de que las juntas de silicona en forma de rosquilla utilizados para establecer la monocapa - es fiable, de bajo costo, fácil de implementar, aplicable a casi cualquier tipo de célula, y escalable para lograr relativamente alto rendimiento y los resultados por medio un pequeño número de células (~6000), en relación con otros ensayos comparables 'liberación' (
por ejemplo
de cicatrización de heridas ensayos). Además, a diferencia de los ensayos de curación de heridas, nuestro enfoque reduce significativamente tanto la denudación de la proteína de ECM que cubre la superficie de migración (Figura S2) y la lesión fatal a las células en la periferia de ensayo (Figura S3). Para aumentar la utilidad y facilidad de implementación del ensayo, hemos desarrollado una macro ImageJ ( 'DonutQuant'; véase el texto S1) para cuantificar la migración rápida y automática. En pocas palabras, la macro resta un "tiempo = 0 'imagen inicial (tomada inmediatamente después de la eliminación de rosquilla) a partir de una imagen posterior o final y cuenta los núcleos fuera del" tiempo = 0' zona (Figura 2C y D). Los experimentos utilizando citocalasina D de inhibir la dinámica de la actina (Figura 2C y D), así como mitomicina C para inhibir la progresión del ciclo celular (datos no mostrados) han confirmado que el ensayo mide la migración y no simplemente el desplazamiento de la monocapa por la división celular. Hemos usado este ensayo para medir la migración en una amplia variedad de tipos de células (incluyendo células CHO-K1, COS7, HIO-80, HUVEC, MCF7, MCF10A, MDA-MB-231, MDCK, NIH3T3, REF52, y SKOV-3) con facilidad y efecto comparable (A. McKenzie, S. Campbell, A. Howe, observaciones no publicadas).
(a) una representación esquemática del ensayo de migración de rosquilla en el que se siembran las células en confluencia en una matriz extracelular cubreobjetos de vidrio recubierta dentro de una junta de silicona con forma de rosquilla. Después de que las células se han adherido de forma estable, se retira la junta, permitiendo que las células migren radialmente. Imágenes de la monocapa son capturados inmediatamente después de la eliminación de rosquilla y en cualquier punto de tiempo a partir de entonces que es adecuado para permitir la migración de una línea celular dada. Una macro ImageJ personalizada utiliza la imagen inicial como una máscara de sustracción para determinar el número de células migradas en la imagen final se toma al final del ensayo. Los detalles se dan en Materiales y Métodos. (B) Una imagen de cinco juntas de donuts en una sola cubreobjetos de 25 mm; esto permite una fácil configuración de análisis repetidos para aumentar el rendimiento y generar datos estadísticamente significativos. (C) células COS-7 fueron sometidos al ensayo de migración de rosquilla en presencia de 2 M citocalasina D (cytoD) o DMSO como un control del vehículo. se muestran imágenes representativas tomadas al principio (0 h) y el final (20 h) del ensayo, así como imágenes enmascarados (final menos iniciales) que representan las células migradas. (D) El número de células COS-7 células migradas se calculó utilizando la macro ImageJ como se describe en Materiales y Métodos. Los datos representan la media ± S.E. de cinco rosquillas por cubreobjetos con tres cubreobjetos separadas por tratamiento. (* = P & lt; 0,001).
Utilizando este ensayo, se investigaron los efectos de la inhibición de PKA o función AKAP sobre la migración celular EOC mediante la transfección Skov-3 células con plásmidos que codifican proteínas fluorescentes (EGFP, mCherry ) fusionada al péptido inhibidores de la actividad PKA o de anclaje (ver Materiales y Métodos). En concreto, se utilizó el mCherry fluorescente proteína fusionada a la PKA proteína inhibidora de PKI (mCherry-PKI) para inhibir la actividad de PKA [14], y EGFP fusionada con el disruptor anclaje RI (RIAD) [34] y superAKAP
es
(sAKAP
es
) [32] péptidos para interrumpir específicamente de tipo I y tipo II-PKA anclaje, respectivamente. Los plásmidos que codifican mCherry solos o fusionados con EGFP RIAD revueltos o sAKAP
es
secuencias se utilizaron como controles negativos. Estos reactivos codificados genéticamente permiten exquisita especificidad en la inhibición de la actividad PKA [14] o la inhibición de anclaje a través de RI y RII subunidades [32], [34] mientras que permite la detección y el seguimiento de las células tratadas a través de microscopía de fluorescencia. Distinguir entre de tipo I y de tipo II de anclaje es apropiado y necesario, como de tipo I y la actividad de tipo II PKA puede regular distintas vías de señalización [19], [20] y, aunque ambos tipos de PKA se han implicado en la migración en otros sistemas [13], [21] - [23], [39], ni se han evaluado en el contexto de la migración cáncer de ovario
después de la transfección, las células se sometieron al ensayo de migración de donut y, después. 24 horas, el número de células transfectadas que migraron, así como el número total de células transfectadas y número total de células migradas (transfectadas y no transfectadas) se cuantificó (Figura 3). Adquisición de estos tres números permite la expresión de la migración como el porcentaje de, células transfectadas migrado más de las células totales migrado ( 'MX /TM') o, para controlar las diferencias en la eficiencia de transfección entre plásmidos, el porcentaje de migrado, las células transfectadas más de el número total de células transfectadas ( 'MX /TX'). Usando este método, la migración SKOV-3 fue significativamente atenuada cuando cualquiera de la actividad PKA (Figura 3A y B) o de anclaje (Figura 3C) se inhibió utilizando los reactivos genéticos descritos anteriormente. Curiosamente, la migración se inhibió casi por igual por la ruptura de anclaje a través de ya sea RI o subunidades RII (Figura 3C), consistente con informes anteriores que establecen la importancia tanto de tipo I y de tipo II PKA anclaje en la migración de otros tipos de células [13] , [21], [22], [39]. En resumen, estos datos establecen la necesidad de actividad de PKA y el anclaje para la migración de las células de EOC.
células SKOV-3 (A) fueron transfectadas con cualquiera de los plásmidos mCherry vacío o mCherry-PKI, a continuación, sujeta a la migración de rosquilla ensayos. Representante thresholded imágenes de las células migradas (migrados, con núcleos pseudocoloreada verde), la población total de las células transfectadas (transfectadas), y una superposición de estas dos imágenes se muestran. Inserciones representan ampliaciones de las áreas indicadas por las plazas en los paneles superiores. Por lo tanto, el total de células migraron ( "TM") se representan en verde, el total de células transfectadas ( "TX") se representan en rojo, y los núcleos amarillas representan las células que migraron, es decir, emigraron y se transfectaron células transfectadas ( 'MX') . (B) Para las células transfectadas con cualquiera de vacío mCherry (MCH) o mCherry en PKI (PKI), el porcentaje promedio (± S. E.) de las células transfectadas emigrado sobre el número total de células que migraron ( 'MX /TM') se calculó. Para normalizar la eficiencia de transfección, el porcentaje de la media (± S.E.) de las células transfectadas migrado más el número total de células transfectadas ( 'MX /TX') también se calculó. (* = P & lt; 0,05) (C) Skov-3 células fueron transfectadas con plásmidos que codifican EGFP fusionados a los inhibidores de tipo I (RIAD) o de tipo II de anclaje de PKA (EFS), o sus respectivos controles revueltos (RIAD scr, las EFS scr), entonces sujeto a ensayos y análisis de migración de rosquilla como se describe en (a y B). (** = P & lt; 0,001) guía empresas
Tipo II-PKA es responsable de dirigir la actividad de PKA borde durante la migración
Dado que la actividad de PKA se enriqueció en el borde de ataque de la migración SKOV- 3 células y que la inhibición de la actividad de PKA y el anclaje a través de RI y RII atrofian la migración, hemos tratado de determinar si el borde de ataque actividad de PKA fue mediado a través ya sea de tipo I o tipo II de anclaje. Para evaluar el efecto de RI- o RII-AKAP anclaje interrupción en la localización de la actividad PKA durante la migración EOC, SKOV-3 células fueron co-transfectadas con pmAKAR3 y plásmidos que expresan inhibidores genéticos de tipo I y de anclaje de tipo II R-subunidad (RIAD y sAKAP
es
, respectivamente) fusionado a mCherry. Los espectros de fluorescencia mCherry no se superpone con las de cualquiera de YFP o CFP y por lo tanto permite que estos disruptores de anclaje marcados con fluorescencia para ser utilizadas en conjunción con microscopía FRET. Una vez transfectadas, las células estaban sujetos al ensayo de migración de rosquilla durante 10 horas, donde sobre las células fueron imágenes a través de microscopía FRET como se describe anteriormente. Las células que expresan tanto el disruptor de anclaje y PKA reportero transfectadas plásmidos fueron imágenes y las imágenes PPC, YFP, traste, y mCherry fueron adquiridas. Para cuantificar el porcentaje de células que muestran que conduce la actividad de PKA borde, la relación media FRET en el borde delantero (FRET
LE; mide 5-25 micras desde la parte frontal de la célula) se midió en proporción a la relación de FRET en el citoplasma (FRET
cito; mide 25 a 50 micras de la parte delantera de la célula (Figura 4E)). valores de relación se binned en alto (FRET
LE /FRET
cito ≥1.5), moderada (FRET
LE /FRET
cito entre 1,2 y 1,5), y no (FRET
LE /FRET
cito & lt; 1,2) de borde de ataque actividad de PKA.