Extracto
La evidencia reciente sugiere que la madre de cáncer de próstata /células progenitoras (CSC) son responsables de la iniciación del cáncer, así como progresión de la enfermedad . Por desgracia, las terapias convencionales sólo son eficaces en la orientación de las células cancerosas más diferenciadas y piezas de la células madre cancerosas. En este caso, nos informan de que PSP, un componente activo extraído de la seta de cola de Turquía (también conocido como
Coriolus versicolor
), es eficaz en la selección de células madre cancerosas de la próstata. Se encontró que el tratamiento del cáncer de próstata línea celular PC-3 con PSP llevado a la baja regulación de marcadores CSC (CD133 y CD44) en un momento y de manera dependiente de la dosis. Mientras tanto, el tratamiento PSP no sólo suprime la capacidad de las células PC-3 para formar prostaspheres bajo condiciones de cultivo no adherentes, pero también inhibe su tumorigenicidad
in vivo
, demostrando además que PSP puede suprimir la próstata propiedades CSC. Para investigar si el efecto anti-CSC de PSP puede conducir a la quimioprevención del cáncer de próstata, los ratones transgénicos (TgMAP) que se desarrollan de forma espontánea tumores de próstata fueron alimentados por vía oral con PSP durante 20 semanas. Considerando que 100% de los ratones que se alimentan con agua solamente desarrollado tumores de próstata al final del experimento, no se detectaron tumores se podían encontrar en cualquiera de los ratones alimentados con PSP, lo que sugiere que el tratamiento PSP puede inhibir completamente la formación de tumor de próstata. Nuestros resultados no sólo demostraron el efecto intrigante anti-CSC de PSP, pero también revelaron, por primera vez, la propiedad quimiopreventivo sorprendente de consumo oral PSP contra el cáncer de próstata
Visto:. Luk SU, Lee TK-W , Liu J, Lee DT-W, Chiu YT, Ma S, et al. (2011) Quimiopreventivo Efecto de la PSP a través del enfoque de cáncer de próstata Células Madre-Como Población. PLoS ONE 6 (5): e19804. doi: 10.1371 /journal.pone.0019804
Editor: Kelvin Chan Kwong Yuen, Hospital Tsan Yuk, Dirección de Hospitales, China
Recibido: Diciembre 23, 2010; Aceptado: April 16, 2011; Publicado: 16-may 2011
Derechos de Autor © 2011 Luk et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Vicerrector Beca de investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más común masculina en los países occidentales y representa una carga de enfermedad importante en el mundo. Cuando se diagnostica en una etapa avanzada, donde la cirugía ya no es factible es, el único tratamiento disponible es en primera línea de terapia de ablación hormonal. Por desgracia, la mayoría de los pacientes con CaP eventual recaída y desarrollar CaP hormono-refractario (CPRH), una etapa fatal y el terminal considerado como incurable [1].
La quimioprevención es una estrategia ideal para luchar contra el cáncer de próstata, y una serie de agentes quimioterapéuticos o suplementos alimenticios naturales están siendo probados actualmente para su potencial de inhibir el desarrollo del cáncer de próstata. Por ejemplo, la finasterida, un inhibidor específico de la 5-alfa, se ha demostrado que reduce la incidencia de cáncer de próstata en un 25% en un ensayo clínico [2]. Del mismo modo, dutasterida, un análogo de la finasterida, se informó también de inhibir significativamente el desarrollo del cáncer de próstata [3]. A pesar de los resultados prometedores, los efectos secundarios asociados con el tratamiento finasteride sigue siendo la principal preocupación para que pueda ser ampliamente utilizado para la quimioprevención de próstata. Por lo tanto, los compuestos bioactivos de los alimentos tales como epigalocatequina-3-galato o resveratrol [4], [5], [6] representa una alternativa atractiva para la quimioprevención del cáncer de próstata, principalmente debido a su toxicidad relativamente baja. Desafortunadamente, la mayoría de los estudios anteriores han producido resultados poco concluyentes en cuanto a su potencial quimiopreventivo.
reciente identificación de las células madre del cáncer de próstata (CSC) [7], ha proporcionado una nueva visión de la carcinogénesis de próstata. La capacidad de estas células madre del cáncer a la auto-renovarse y diferenciarse en células cancerosas a granel sugerido que pueden ser el origen del cáncer de próstata [7]. Además, la naturaleza altamente resistente de estas células madre cancerosas a diferentes quimioterapias sugirió que los CAC también pueden contribuir al fracaso del tratamiento y la enfermedad de recaída [8]. Curiosamente, un número de compuestos bioactivos de los alimentos recientemente se ha demostrado que tiene efecto anti-CSC. Por ejemplo, recientemente hemos informado de que el tocotrienol gama extraído del aceite de palma inhibe la capacidad de formación de prostasphere y tumorigenicidad de las células de cáncer de próstata [9], lo que sugiere que el tocotrienol gama es eficaz en la supresión de la próstata propiedades CSC. Además, un triterpeno extraído de las frutas también se encontró que inhibe la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas hepáticas y sensibilizar el tumor de hígado para el tratamiento con cisplatino [10]. Estos resultados ponen de relieve el potencial de los compuestos bioactivos de los alimentos como CSC agente de dirección, ya sea para la prevención o para el tratamiento del cáncer de próstata.
A continuación, hemos demostrado que la polisacaropéptido (PSP) extraída de la cola de Turquía (conocido como
Coriolus versicolor o
Yun-zhi) se dirige a células madre cancerosas de próstata in vitro y suprime la formación de tumores in vivo. El tratamiento del cáncer de próstata línea celular PC-3 con PSP llevó a la baja regulación de marcadores CSC (CD133 y CD44) en un momento y de manera dependiente de la dosis. Mientras tanto, la formación de prostasphere, una importante característica de células madre cancerosas de próstata, fue completamente suprimida en las células PC-3 en presencia de PSP. Además, PSP pre-tratamiento suprimió significativamente la iniciación del tumor de las células PC-3 en ratones inmunocomprometidos, lo que sugiere que PSP suprime la tumorigenicidad de las células PC-3. Más importante aún, se encontró que la alimentación oral de ratones transgénicos (TgMAP) que se desarrollan espontáneamente tumores de próstata con PSP para inhibir completamente la formación de tumor de próstata. Nuestros resultados apoyan que la PSP puede ser un agente quimiopreventivo potente contra el cáncer de próstata, posiblemente a través de la orientación de la próstata población CSC.
Resultados
Efectos de PSP en la expresión de marcadores CSC
PSP ha demostrado previamente que poseen propiedades contra el cáncer [11], [12], [13], aunque los mecanismos subyacentes siguen sin estar claras. Para probar si el efecto anticancerígeno de PSP es a través de la orientación de las propiedades de CSC, lo primero que investigó si el tratamiento PSP afecta a la expresión de marcadores de próstata CSC en la línea celular PC-3, que se ha informado que contienen células madre cancerosas. Células PC-3 fueron tratados con 250 y 500 g /ml de PSP, ya sea para 48 o 72 horas, y la expresión de marcadores de CSC como CD133 o CD44 se examinó por transferencia de Western. Como se muestra en la Figura 1B, la expresión de proteína de CD133 fue significativamente reguladas por después del tratamiento PSP en un tiempo y manera dosis-dependiente. Regulación a la baja de CD44 también se observó después del tratamiento PSP, aunque el efecto era menos evidente. Sin embargo, el examen del nivel de mRNA tanto de CD133 y CD44 reveló que la regulación a la baja de ambas proteínas de PSP no es debido a la inhibición de la transcripción de genes (datos no mostrados). Sin embargo, estos datos sugieren que la PSP puede ser eficaz en la orientación de las células madre cancerosas de próstata putativos.
A) transferencia de Western de próstata CSC marcadores CD44 y CD133 en células PC-3 después del tratamiento PSP. Tenga en cuenta que PSP significativamente regula a la baja tanto marcadores de células en una dosis y tiempo dependiente del tallo. B) La viabilidad de las células PC-3 después del tratamiento con 5, 25, 125, 250 y 500 g /ml de PSP para 48 o 72 horas se midió con el ensayo MTT. Los resultados se presentan como media ± s.d. C) La citometría de flujo análisis de las células PC-3 después del tratamiento con 250 g /ml de PSP para 72 hr. Tenga en cuenta que no se observó ninguna diferencia significativa en la distribución del ciclo celular. D) los resultados de Western Blot para los marcadores apoptóticos (panel izquierdo) y el tallo proteínas de mantenimiento celular (panel derecho) en células PC-3 después del tratamiento PSP. Tenga en cuenta que no se detectaron cambios en Bax y Bcl-2 o la escisión de PARP.
Para probar si la baja regulación de la expresión de marcadores de CSC por PSP se debe a una disminución de la viabilidad celular, PC- 3 células tratadas con PSP en diferentes dosis (0, 5, 25, 125, 250 y 500 mg /ml) durante 24, 48 o 72 hr fueron examinados mediante el ensayo de MTT. Curiosamente, 48 h de tratamiento PSP no tuvo efectos observables sobre la viabilidad celular, a pesar de que los mismos tratamientos se encontró para suprimir significativamente la expresión de marcadores de CSC (Figura 1B & amp; 1C). Mientras tanto, el tratamiento PSP también falló en inducir la detención del ciclo celular o la apoptosis, como se evidencia por la falta de población sub-G1 en el resultado de la citometría de flujo análisis (Figura 1D). Esto fue confirmado por el examen de las proteínas de apoptosis asociada (es decir, Bax, Bcl-2 y se escindió de la PARP) (Figura 1E). Sin embargo, la vía /β-catenina Akt, que es responsable para el enriquecimiento de células madre cancerosas en el cáncer de mama, se inhibió drásticamente mediante el tratamiento PSP. Como se muestra en la Figura 1D, la activación de AKT por la fosforilación en Ser 473 fue inhibida por PSP en ambas dosis, que fue acompañada por la desaparición completa de la expresión de β-catenina (Figura 1E).
PSP inhibe la formación de prostasphere de próstata las células cancerosas bajo condiciones de cultivo no adherentes
La capacidad de formar prostaspheres en la cultura no adherente es una de las características de las células madre cancerosas de próstata [14], [15], [16]. Para confirmar que el tratamiento puede inhibir la PSP de próstata propiedades CSC, la formación prostasphere de PC-3 se estudió en la presencia o ausencia de PSP. Como se muestra en la Figura 2A, el cultivo de ambas células PC-3 y DU145 durante 14 días en condiciones de resultados formación no adherente de prostaspheres, además de confirmar la presencia de una población de tallo como dentro de las dos líneas celulares. Sorprendentemente, la adición de PSP en el medio inhibió drásticamente prostasphere formación en ambas líneas celulares. En particular, no hay prostaspheres se encontró en ninguna de las líneas de células en presencia de 500 mg /ml de PSP, lo que sugiere que el tratamiento PSP elimina de forma significativa las células madre cancerosas de la próstata. Para demostró además que la PSP es eficaz en la inhibición de la formación prostasphere, prostaspheres primarias con población enriquecida CSC fueron disociadas y re-sembradas en condiciones de cultivo no adherente para permitir la formación de prostaspheres secundarias. De acuerdo con el resultado del ensayo de formación de esferoide primaria, los tratamientos PSP suprimen significativamente el número de prostaspheres que se encuentran en cada línea celular, aunque la dosis más alta de PSP (500 mg /ml) era capaz de eliminar totalmente todos los prostaspheres secundarias. No obstante, estos resultados sugieren que la PSP es eficaz en la supresión de las propiedades de CSC de células de cáncer de próstata.
A) ensayo de la formación de esferoides se realizó con DU145 células PC-3 y. Doscientos de las células fueron sembradas en placas de poliHEMA pre-recubiertas y se trató con o bien 500 mg /ml de PSP o vehículo durante 14 días. Se contó el número de prostaspheres formados, y el resultado se presenta como la media ± s.d. Tenga en cuenta que el tratamiento γ-T3 suprime eficientemente la capacidad de formación de esferoides de células PC-3. Imagen de los prostaspheres fue capturado bajo el microscopio. Tenga en cuenta que no hay prostaspheres se pueden encontrar en las células tratadas con 500 mg /ml de PSP. (B) PSP inhibe la formación de prostaspheres secundarias. prostaspheres primarias fueron disociadas y re-sembraron en placa poliHEMA pre-revestido. PSP se añadió 24 horas después de la chapa. Tenga en cuenta que la formación de prostasphere se inhibió en más de un 70% y 90% en presencia de 250 mg /ml y 500 mg /ml de PSP respectivamente. *
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prueba
PSP reduce significativamente la tumorigenicidad de próstata células de cáncer de
in vivo
Desde CSC es responsable de la iniciación del cáncer, es posible que el tratamiento PSP puede inhibir la capacidad de formación de tumores de las células PC-3 in vivo. Para probar esta hipótesis, se trataron primero células PC-3 que expresan de forma estable la proteína luciferasa (PC-3-Luc) con PSP durante 72 horas antes de ortotópicamente las inyectaron en los ratones SCID. Como examinado por imágenes de bioluminiscencia, todos los ratones que fueron inyectados con células PC-3-luc con vehículo pre-tratada tumores formados dos semanas después de la implantación (Figura 3A). Curiosamente, tres de los ocho ratones que fueron inyectados con células PC-3-luc PSP pre-tratados no desarrolló tumores, incluso en la cuarta semana después del implante (Figura 3A & amp; B). La falta de los tumores en el grupo de PSP-pre-tratado fue confirmado por el examen de las glándulas de la próstata del ratón en el final del experimento (Figura 3C). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la PSP fue eficaz en la reducción del potencial tumorigénico de las células de cáncer de próstata, que es una característica esencial de los CAC.
A) imágenes bioluminiscentes de ratones SCID ortotópicamente inyectados con células PC-3-luc por dos semanas. ratones SCID en la fila superior fueron inyectados con células PC-3-luc tratados con vehículo, mientras que los ratones en la fila inferior fueron inyectados con células PC-3-luc tratados con PSP. B) Tabla resume los porcentajes de ratones que desarrollaron tumores detectables en la semana 2. Aproximadamente el 40% de los ratones en el grupo pretratado PSP no formaron tumores detectables, mientras que la formación de tumores 100% se encontró en el grupo de control (p = 0,07). C) se selecciona
ex vivo
imágenes de la próstata a partir de los dos grupos. Tenga en cuenta que en ratones con señal de luciferasa negativo PSP tratados, no hay tumor visible se encuentra en el tejido de la próstata.
La administración oral de PSP falla para inhibir el desarrollo de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en ratones TgMAP
el efecto de PSP sobre la próstata CSC apoya la hipótesis de que puede tener un efecto quimiopreventivo contra el cáncer de próstata. Para probar esta hipótesis, hemos empleado un modelo de ratón transgénico que desarrolla espontáneamente adenocarcinoma de la próstata (TgMAP) [17], [18]. Los ratones desarrollan TgMAP PIN de entre 16-20 semanas de edad y el progreso de adenocarcinoma de próstata después de la semana 24 (Figura 4A). Debido a que el PIN es considerada como la lesión pre-maligna y el factor de riesgo más importante de cáncer de próstata [19], primero a prueba si la administración PSP afectado el desarrollo PIN en ratones TgMAP. Cinco ratones TgMAP (14 semanas de edad, por lo menos 2 semanas antes del desarrollo PIN) fueron alimentados con 200 mg /kg de PSP durante 4 semanas. Cuatro ratones de la misma edad fueron alimentados con agua solamente para el mismo período de tiempo. Todos los ratones fueron sacrificados a las 20 semanas de edad los tejidos prostáticos y se recogieron y se seccionaron para histología. Como se muestra en la Figura 4B & amp; C, no se observaron diferencias entre el control y los ratones tratados con TgMAP PSP con respecto a la anatomía y la histología de la glándula prostática. A menor aumento de energía, secciones de tejido de ambos grupos retenidos estructuras glandulares, y a alta potencia, PIN fue detectable en el control y en ratones tratados con PSP. Estos resultados sugieren que el consumo de 4 semanas de PSP fue incapaz de detener el desarrollo de PIN.
A) Plazo del PIN y el desarrollo del CaP en ratones TgMAP y el horario del tratamiento PSP. De catorce semanas de edad ratones TgMAP fueron tratados con 200 mg /kg de PSP por sonda oral de alimentación durante 4 semanas y se sacrificaron en el momento de PIN ha desarrollado (20 semanas de edad). La tabla resume los resultados del examen de histología de la próstata del vehículo- y los ratones tratados con TgMAP PSP. C) fotos representativas de la hematoxilina & amp; Eosina de los tejidos prostáticos de los ratones TgMAP. Tenga en cuenta que tanto en ratones TgMAP Control- y tratados con PSP desarrollan neoplasia intraepitelial prostática (PIN), según lo indicado por las flechas.
Prolongar el consumo de PSP inhibe el desarrollo del cáncer de próstata en ratones TgMAP
el fracaso para inhibir la formación de PIN mediante el tratamiento de PSP pueden debido a la insuficiente dosis o la duración del tratamiento. Por lo tanto, a prueba si una dosis más alta y el período de consumo de PSP ya pueden afectar a la formación de tumores de próstata usando el mismo modelo. Cinco ratones TgMAP (8-semanas de edad) se alimentaron con 300 mg /kg de PSP para un total de 20 semanas (Figura 5A). Cuatro ratones de la misma edad se alimentaron de nuevo con agua solamente para el mismo período de tiempo. Todos los ratones fueron sacrificados a las 28 semanas de edad cuando se formaron tumores de próstata, con tejidos prostáticos recolectados y se seccionaron para histología. Como se muestra en la Figura 5B, los tumores fueron encontrados en diferentes secciones de la glándula de la próstata de todos los ratones que fueron alimentados sólo con agua. Sorprendentemente, el examen de la totalidad de la sección de próstata reveló que ninguno de los ratones que fueron alimentados con PSP al descubierto ningún tumores de próstata (Figura 5C), lo que sugiere que el tratamiento PSP la formación de tumores de próstata inhibió completamente en los ratones TgMAP. Mientras tanto, mientras que tres de los ratones alimentados-PSP se encontró que tenían PIN, se encontró que los otros dos ratones para tener próstatas completamente normales (Figura 5D). Además, de acuerdo con la baja toxicidad de PSP, el consumo a largo plazo parece no tener ningún efecto secundario en los ratones, como se juzga por los cambios de peso corporal y signos físicos (datos no mostrados) (Figura 5E). Estos resultados sugieren fuertemente que la ingesta oral de PSP puede ser un agente quimiopreventivo segura y eficaz contra el cáncer de próstata.
A) Esquema de la programación para el tratamiento de PSP. Ocho semanas de edad ratones TgMAP fueron tratados con 300 mg /kg de PSP por sonda oral de alimentación durante 20 semanas y se sacrificaron a la edad de 28 semanas. B & amp; C) fotos representativas de la hematoxilina & amp; Eosina tinción de los tejidos de la próstata desde el vehículo y los ratones tratados con TgMAP PSP. Tenga en cuenta que los tumores se encontraron en todos los ratones que fueron tratados sólo con vehículo, pero estaban ausentes en todos los ratones tratados con PSP. D) La tabla resume los resultados del examen histológico de los tejidos de la próstata desde el vehículo y los ratones tratados con TgMAP PSP. * P & lt; 0,05 en comparación con el tratamiento de control por la prueba exacta de Fisher. E) el peso corporal medio de los ratones durante el tratamiento PSP.
Discusión
PSP ha sido previamente demostrado para inducir apoptosis e inhibir el crecimiento de una amplia gama de células de cáncer que incluye cáncer de próstata [24] de mama [20], [21], [22], el hígado [23] y, aunque los mecanismos que subyacen a sus efectos contra el cáncer siguen siendo poco conocidos. Aquí, hemos demostrado por primera vez que la PSP tiene efectos anti-CSC, como lo demuestra la regulación por disminución de los marcadores de CSC y la supresión de la formación prostasphere y tumor.
próstata CSC se identificaron primero por Collins et al. en 2005 el uso de CD44 + /alpha2beta1hi /CD133 + como los marcadores de superficie celular [25]. Utilizando métodos similares, células madre cancerosas también se han identificado en líneas celulares de cáncer de próstata como LNCaP [26], DU145 [26], [27] y PC-3 [28], [29]. Estas células madre cancerosas de la próstata no sólo expresan alto nivel de CD133 y CD44, pero también son muy tumorigénicas cuando se compara con la población no CSC. El hecho de que PSP puede suprimir significativamente la expresión de tanto CD133 y CD44, así como la tumorigenicidad de células PC-3, indica claramente la eficacia de PSP en la selección de células madre cancerosas de la próstata. Como se ha demostrado por Hsieh et al [24], PSP es eficaz en la inducción de la apoptosis y la inhibición de la proliferación celular en las células LNCaP. Sin embargo, su efecto fue mucho menos prominente en líneas celulares de cáncer de próstata independientes de andrógenos, tales como PC-3. Este es de hecho consistente con nuestro hallazgo, que mostró que la PSP puede suprimir propiedades CSC sin inducir la detención del ciclo celular detectable o apoptosis. Sin embargo, el descubrimiento de que tanto la fosforilación de Akt y la expresión de β-catenina fueron también las reguladas por el PSP (Figura 1E) sugiere que la PSP puede actuar mediante la inactivación de la vía /Akt /β-catenina PTEN para inhibir la renovación CSC. Esta vía de mantenimiento de células madre identificado recientemente ha demostrado desempeñar un papel clave en la regulación de la próstata y poblaciones de células madre mamarias [16], [30]. se encontró la activación aberrante de la vía /β-catenina Akt a través de la caída de PTEN para enriquecer la población de células madre de mama, lo que lleva a la inducción de las lesiones hiperplásicas en el ratón [30]. Del mismo modo, también se encontró desmontables de PTEN en las células de cáncer de próstata para mejorar prostasphere capacidad de formación de y la tumorigenicidad de las células [16]. Por lo tanto, la pérdida de la "troncalidad" de células madre cancerosas de la próstata después del tratamiento PSP puede ser debido a la baja regulación de la vía de PTEN /AKT /β-catenina.
Una de las propiedades fundamentales de las células madre es su capacidad para formar esferas en no adherentes, condiciones libres de suero [31]. De hecho, los ensayos de formación de esferoides recientemente se han utilizado para identificar y enriquecer células madre cancerosas putativas [16], [32], [33], [34]. De acuerdo con estudios anteriores, las dos líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 y DU145 fueron capaces de formar prostaspheres en cultivo no adherente [16], lo que sugiere la presencia de células madre cancerosas dentro de estas líneas celulares. Estos prostaspheres primarios, que son resistentes a los fármacos quimioterapéuticos [9], son muy sensibles al tratamiento PSP (Figura 2A). Además, los prostaspheres secundarias se inhibieron significativamente de una manera dependiente de la dosis (Figura 2B), apoyando que la PSP es eficaz en la eliminación de células madre cancerosas de próstata
in vitro
.
Próstata células madre cancerosas se cree que es origen del tumor de próstata, que tienen la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en el tumor mayor [35]. El hecho de que PSP pretratamiento puede inhibir significativamente la tumorigenicidad de células PC-3 (Figura 3) no sólo pone de relieve la anti-CSC efecto de PSP, pero también sugiere que PSP puede tener efectos quimiopreventivos contra el cáncer de próstata. Pusimos a prueba esta hipótesis utilizando un modelo de ratón transgénico desarrollado recientemente de cáncer de próstata (TgMAP) [17], [18]. El desarrollo gradual del tumor de próstata (PIN de bajo grado de tumor macroscópico) en el TgMAP ratón altamente imita la patogénesis del cáncer de próstata humano, aunque puede no reflejar totalmente la naturaleza compleja de la carcinogénesis de próstata. Sin embargo, nos ha permitido desarrollar una dosificación de tratamiento y el calendario PSP óptima. Considerando cuatro semanas de consumo oral PSP a 200 mg /kg no produjo ninguna diferencia en el desarrollo de PIN, se logró la inhibición completa de la formación de tumores de próstata después de 20 semanas de PSP oral de alimentación en 300 mg /Kg. Mientras tanto, la supresión de la formación PIN por PSP sugirió además que el efecto quimiopreventivo de PSP puede debido a la supresión de la iniciación del tumor en estadio temprano. La toxicidad extremadamente baja y el efecto altamente potente anti-CSC de PSP justifica una mayor evaluación de su efecto quimiopreventivo en ensayos clínicos en humanos.
En resumen, hemos demostrado, por primera vez, que el tratamiento PSP no sólo inhibe CSC propiedades, pero también suprime eficazmente la formación de tumores de próstata. Nuestros resultados sugieren que la PSP puede ser un agente eficaz para la quimioprevención del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
polisacaropéptido (PSP)
PSP extraído de Yun-zhi fue proporcionado amablemente por Wonder de hierbas productos de salud, Ltd. El polvo de PSP se disolvió en autoclave de agua Milli Q a una concentración de 30 mg /ml mediante la mezcla en un rotador a 4 ° C durante la noche. La solución de PSP se almacenó a 4 ° C. Para el estudio de cultivo celular, PSP de stock se esterilizó con 0,2 micras de filtración antes de su uso. En el estudio en animales, PSP se alimentó directamente a ratones.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 y DU145 (ATCC, Rockville, MD) se mantuvieron en RPMI 1640 medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 1% (w /v) de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 5% de suero bovino fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de CO
2 medio ambiente. Luciferasa que expresan línea celular PC-3 se ha generado en nuestro estudio anterior.
TgMAP modelo de tumor de próstata
TgMAP C57 /BL6 ratones en la semana 8 y 14 se administraron con PSP, a 200 mg /kg durante 4 semanas (n = 5) o 300 mg /kg durante 20 semanas (n = 5), respectivamente, por sonda nasogástrica de alimentación (5 días a la semana). El grupo de control fueron alimentados con agua solamente para el mismo período de tiempo. Los ratones fueron sacrificados (a la edad de 20 semanas de 200 mg grupo de tratamiento /Kg y 28 semanas para los 300 mg /kg de grupo de tratamiento) los tejidos de la próstata y se recogieron, se fijaron en 10% de formalina y embebidos en parafina. toda la próstata se cortó en secciones de 4 micras y una de cada cinco secciones consecutivas se tiñó con H & amp; E. Histología examen se realizó por el Dr. K. W. Chan (patólogo, Universidad de Hong Kong). La diferencia estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher y se consideró como significativo si p & lt; 0,05. ética animal fue aprobado por el Comité para el uso de animales vivos para la Enseñanza y la Investigación (CULATR) con la aprobación no. de 1694 a 1608. Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR), la Universidad de Hong Kong.
esferoide ensayo de formación de
La ensayo de la formación de esferoides se modificó a partir de un protocolo previamente informado [36]. Brevemente, las células PCA (200 células por línea) fueron sembradas en 12 pocillos poliHEMA (Sigma) placas recubiertas. Las células se cultivaron en medio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 14 días suplementado con 4 mg /ml de insulina (Sigma), B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF (Sigma), y 20 ng /ml de FGF básico (Invitrogen) con PSP en cualquiera de 250 mg /ml y 500 mg /ml. Para el paso en serie de esferas primarias, las esferas primarias fueron tratados con PSP para las dosis anteriores durante 72 h y posteriormente se recogió, se disociaron con tripsina, y se resuspendieron en medio DMEM /F12 con los suplementos mencionados. Cada experimento se repitió por triplicado, y cada punto de datos representa la media y la desviación típica. La diferencia estadística se determinó por el estudiante de
t-test
y fue considerado como significativo si p. & lt; 0,05
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular tras el tratamiento de PSP se midió por un 3 - (4,5-dimetil-tiazol-2 il) bromuro (MTT) ensayo de tetrazolio -2,5-difenil como se describe anteriormente [37]. Brevemente, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de PSP para el tiempo indicado. Al final del tratamiento, MTT (Sigma, St. Louis, MO) se añadió a cada pocillo, y los pocillos se incubaron durante 4 horas a RT. a continuación, DMSO se añadió a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. La placa se incubó durante 5 minutos más a temperatura ambiente, y la densidad óptica (DO) se midió a una longitud de onda de 570 nm en un lector de microplacas Multiscan Labsystem (Merck Eurolab, Dietikon, Suiza). Todos los pocillos individuales se analizaron por triplicado. El porcentaje de viabilidad celular se presenta como la relación de OD entre las células tratadas y no tratadas a las concentraciones indicadas.
Western Blotting
procedimientos experimentales detallados se han descrito anteriormente [37]. Brevemente, las células se lisaron con tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico al 0,5%, 1% NP-40, 0,1% SDS) con inhibidores de proteasa (1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml leupeptina, PMSF 1 mM) y las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un D
C Kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). Las proteínas se resolvieron en SDS-gel de poliacrilamida por electroforesis y después se transfirieron a una membrana Hybond-P PVDF (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las membranas fueron bloqueadas por la leche en polvo 10% no grasa en TBS-T o leche en polvo 3% no grasa en TBS y se incubaron con anticuerpos primarios a temperatura ambiente contra Akt (ser 473), Bcl-2, la señalización de PARP (Cell, Technology Inc, Beverly, MA), CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), CD44, β-catenina y β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpos anti-ratón o anti-IgG de conejo secundaria de anticuerpos, y las señales se visualizaron utilizando la ECL plus sistema de transferencia de Western (Amersham, Piscataway, NJ).
análisis
Las células del ciclo celular se fijaron con 1 ml de hielo frío etanol al 70% a 4 ° C. Después de la fijación, los sedimentos celulares se recogieron por centrifugación, se resuspendieron con 500 l de PBS, y después se incubaron a 4 ° C un día antes de realizar citometría de flujo. En el día siguiente, las células se tiñeron con yoduro de propidio (50 g /ml) y RNasa (1 mg /ml) durante 30 min. El análisis del ciclo celular se realizó en un citómetro de flujo analizador de perfil EPOPEYAS y analizados utilizando el software ModFit LT2.0 (Coulter, Miami, FL).
ortotópico la implantación de las células PC-3-luc
el modelo ortotópico se estableció con los procedimientos descritos anteriormente [38]. En pocas palabras, de ocho semanas de edad CB-17 ratones SCID fueron anestesiados y colocados bajo un microscopio de disección. Se hace una incisión en la línea media del abdomen fue hecho, la exposición de la próstata dorsal en la base de la vejiga. Igual cantidad de células PC3-luc viables (2,5 × 10
4) con o sin tratamiento previo PSP se inyectaron en las próstatas dorsal de los ratones. Los órganos fueron reemplazados, y se cerró el abdomen. desarrollo tumoral se controló mediante la medición de la señal bioluminiscente cada dos semanas durante seis semanas después de la implantación del tumor. Los ratones fueron sacrificados al final del experimento los tejidos de la próstata y se recogieron para su examen físico. La diferencia estadística se determinó por una de dos colas
t-test
y fue considerado significativo si p & lt; 0,05. Todos los procedimientos de manejo quirúrgico y animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR), la Universidad de Hong Kong.