Extracto
La mayoría de los ensayos de eficacia analgésica preclínicos todavía implicar un análisis nociceptivo en roedores. Esto es a pesar de las preocupaciones en cuanto a la relevancia de estas pruebas para la evaluación de las propiedades dolor preventivo de drogas. métodos más apropiados apuntarían dolor en lugar de la nocicepción, pero éstos no están actualmente disponibles, por lo que aún se desconoce si el dolor de los animales equivale al estado afectivo negativo y subjetivo /emocional que provoca en los seres humanos. modelos de cáncer de ratón son comunes a pesar de la probabilidad de dolor considerable. Se utilizó la prueba preferencia de lugar condicionado (CPP), la evaluación de la hiperalgesia térmica y el comportamiento para determinar la probabilidad de que los impactos MBT-2 cáncer de vejiga negativamente sobre el bienestar de ratón, como por causar dolor. No hubo CPP a la solución salina, pero de preferencia la morfina en ratones portadores de tumor superó a la observada en los controles libres de tumor. Esto ocurrió hasta 10 días antes del estudio de punto final junto con la reducción de peso corporal, el desarrollo de los cambios de comportamiento y la hiperalgesia. Estos efectos indicados ratones experimentaron un estado de bienestar negativo causado por
malestar gratis (si no el dolor) antes de la eutanasia. Debido a la complejidad de las evaluaciones necesarias para demostrar esto, es poco probable que este enfoque podría utilizarse para la evaluación del bienestar de rutina en una base de estudio por estudio. Sin embargo, nuestros resultados muestran en los ratones son lo suficientemente propensos a beneficiarse de una mayor evaluación de la gravedad intensiva y reevaluación de los criterios de valoración con el fin de aplicar mejoras apropiadas estudios similares. En este caso particular, un refinamiento habría sido tener ratones sacrificados al menos 7 días antes o posiblemente mediante la provisión de alivio del dolor en fase terminal. Se encontró pruebas CPP ser un método útil para investigar las respuestas de los ratones a los analgésicos, posiblemente en un nivel subjetivo. Estos resultados y los de otros estudios recientes muestran que podría ser un valioso método de cribado de analgésicos candidatos para la eficacia contra el dolor por cáncer y posiblemente otros modelos de dolor o enfermedad
Visto:. Roughan JV, CA Coulter, Flecknell PA, Thomas HD, Sufka KJ (2014) El lugar condicionada por la prueba de preferencia para la evaluación de consecuencias sobre el bienestar y mejoras potenciales en un modelo de cáncer de vejiga del ratón. PLoS ONE 9 (8): e103362. doi: 10.1371 /journal.pone.0103362
Editor: Bradley Taylor, Universidad de Kentucky Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 10, 2013; Aceptado: 30 de junio de 2014; Publicado: 6 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Roughan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por el Centro Nacional del Reino Unido para las 3R (NC3Rs): http://www.nc3rs.org.uk/, número de concesión G0900763, PI: JV Roughan. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una serie de pruebas nociceptivas se utilizan para determinar la eficacia potencial de nuevos analgésicos y ratas y ratones de laboratorio son abrumadoramente los sujetos de prueba más ampliamente utilizados. Estas pruebas se clasifican típicamente según la duración y la intensidad del estímulo nocivo y la naturaleza de la respuesta. Los ensayos agudos o fásicos nociceptivas que se aplican calor o estimulación mecánica (por ejemplo, la retirada de la cola y prueba de Hargreaves; von Frey, respectivamente), debido a la naturaleza en gran parte reflexiva de las respuestas obtenidas, se consideran menos apropiados que las pruebas tónicas o sub-crónicos ( por ejemplo, formalina o carragenano) que suscitan la inflamación significativa y persistente [1]. Sin embargo, las deficiencias de ambos son bien conocidos [2]. A pesar del desarrollo de simulaciones animales de síndromes de dolor persistentes (por ejemplo, artritis o dolor neuropático), las preocupaciones prevalecen en cuanto a su relevancia clínica. Estos última instancia, se derivan de una continua falta de comprensión de cómo el dolor de los animales equivale a la experiencia humana; siendo un fenómeno multidimensional que incluye tanto los cambios de estado emocionales sensoriales y afectivos (cambios denominados colectivamente 'calidad de vida'). En teoría al menos, el dolor de los animales y los ensayos de analgésicos que informan sobre los cambios en estos Estados otorguen una mayor validez de traslación. Esta necesidad ha llevado a llamadas recientes para el desarrollo de más clínicamente relevante
in vivo en modelos
[3], [4] que proporciona un enfoque basado en sistemas más [5]. Esta razón explica por qué la evaluación del estado afectivo (subjetiva) cada vez está siendo considerado como un enfoque más pertinente para establecer las consecuencias sobre el bienestar de los modelos en los que los animales podrían estar expuestos al dolor [6] - [8]. modelos de cáncer son un área de investigación donde considerablemente más conocimiento sobre cómo ampliamente los impactos sobre el bienestar de dolor pueden ser desde hace mucho tiempo.
Un grande y cada vez mayor número de animales (principalmente ratones) se utilizan en las pruebas de cáncer (471.000 en el Reino Unido en 2012, un aumento del 16% respecto al año anterior [9]), con sólo un mínimo conocimiento sobre los impactos potencialmente negativos sobre el bienestar. Sin embargo, las directrices que están destinados a minimizar el sufrimiento en estos estudios [10], [11] no incorporan ninguna evaluación de los cambios en el estado subjetivo subyacente, y la obtención de evidencia de dolor por cáncer en los roedores se ha basado en gran medida en la evaluación de los cambios nociceptivo subyacentes [12 ] - [15], y parece que esto es todavía el caso hoy en día [16] - [19]. Nuestro grupo ha evaluado exhaustivamente los cambios en los comportamientos naturalistas como medio de evaluar el dolor postoperatorio en los roedores y otras especies utilizando ambos [20] manuales - [26] y métodos automatizados [27] - [30], o se utiliza una combinación de ambos tipos de análisis [31]. Sin embargo, el análisis de este tipo de comportamiento rara vez se ha utilizado para evaluar los efectos del cáncer, y los pocos estudios que se citan "el comportamiento del dolor" en realidad significa comportamientos nociceptivos o nocifensive (es decir, retirada o que guardan) en lugar de la verdadera conducta espontánea (por ejemplo, casa-jaula) ( ver por ejemplo [14], [32]). Sea cual sea el método de recolección de datos que se utilice, el establecimiento de vínculos entre el resultado y la causalidad en los estudios de comportamiento es difícil debido a que muchos factores pueden contribuir a los cambios observados. Los cambios podrían ocurrir como resultado indirecto de las influencias de procedimiento (por ejemplo, la anestesia, la hipotermia, deshidratación) o factores vinculados a éstos, como el miedo y la ansiedad asociados. Sin embargo, establecer si y cuando se presenta dolor en los estudios de cáncer tendría consecuencias significativas. En primer lugar sería fomentar un enfoque más riguroso para la toma de decisiones éticas permitiendo a los investigadores a aplicar coste-beneficio más eficaz analiza para determinar si se justifican los puntos finales. Mejorar los niveles de bienestar de esta manera también sería beneficioso para los estudios porque el dolor unalleviated también puede poner en peligro la validez del modelo. La prevención del dolor se ha demostrado que es beneficioso para la validez de al menos un ensayo del cáncer [33] y, posiblemente, otra
in vivo | Aplicaciones de investigación [34]. El dolor del cáncer es también un área donde se requiere con urgencia avances en los tratamientos humanos. El dolor es la consecuencia más común y temida de cáncer y entre el 30-60% de los pacientes oncológicos que siga informando dolor antes, a lo largo y después del tratamiento [35]. De hecho, parece que el panorama sigue siendo sombrío a pesar de 40 años de intentos de abordar el problema [36]. Claramente, el tratamiento del dolor del cáncer necesita ser refinado, y modelos de cáncer en animales proporcionan una plataforma ideal para un progreso paralelo en el avance del bienestar y el descubrimiento de fármacos. A pesar de esto, los modelos de cáncer no se utilizan generalmente para detectar posibles analgésicos, salvo excepciones raras [13], [37]. Esto puede ser porque la mayoría de los estudios de cáncer tienen objetivos alternativos, pero también podría ser debido a la falta de métodos de evaluación apropiados; es decir, aquellas que acomodar aspectos subjetivos.
preferencia de lugar condicionado prueba (CPP) es ampliamente utilizado para evaluar las propiedades psicoactivas (afectivos) de medicamentos en los animales [38], pero por lo general para identificar riesgo de abuso por los seres humanos. Los animales están condicionadas por estar confinado en un "lugar" y que el emparejamiento con el tratamiento farmacológico, mientras que en otro lugar en el que se dan sólo un placebo. Como los "lugares" tienen claramente diferentes señales (por lo general de color o textura) animales asocian progresivamente las drogas 'afectará con el lugar donde experimentaron la misma. Si esto es una experiencia gratificante, ya sea debido a los efectos de refuerzo positivo o negativo (analgésicos) de los medicamentos, los animales suelen pasar más tiempo en, o visitar el lugar emparejado con la sustancia con mayor frecuencia. Provisión de la analgesia es una experiencia positiva en los seres humanos dolorosas, por lo que si lo mismo se aplica a los animales entonces los estudios de CPP tienen potencial para evaluar tanto las propiedades aversivas de dolor y los efectos analgésicos de los fármacos. El enfoque cada vez se ha aplicado a la investigación sobre el dolor después de la primera demostración de que las causas de artritis CPP mejoradas a la morfina y el antagonista de N-metil-D-aspartato MK-801 [39]. Posteriormente se demostró que un antagonista de la bradiquinina B
1 receptor tiene un potencial terapéutico contra el dolor inflamatorio crónico [40]. Un tiempo considerable después, King et al. mostró CPP es también un método eficaz para evaluar analgésicos contra el dolor neuropático [41]. Qu et al. se ilustra la relevancia de CPP a la evaluación de los aspectos subjetivos de dolor neuropático en ratas, demostrando que la corteza cingulada anterior rostral es esencial para mediar el dolor afecta [42]. Rutten et al. También fueron capaces de utilizar CPP para disociar entre las consecuencias positiva y negativamente gratificantes de analgésicos con opioides como afecta en comparación con otros mecanismos en un modelo de rata inflamatoria (carragenina) [43]. Davoody et al. a continuación, mostraron un aumento de CPP a la clonidina (un agonista α-2) en ratas utilizando lesión de médula espinal como un modelo de dolor centralizado [44]. Okun et al. utilizado un enfoque similar para mostrar CPP a varios medicamentos diferentes en un modelo con osteoartritis [45], y, más recientemente, Park et al. mostró ausencia de refuerzo positivo (recompensa) a la gabapentina en ratones normales, pero CPP en un modelo de dolor causado por polyneuropathic antineoplásico (cisplatino) de tratamiento [46]. En conjunto, estos resultados demuestran claramente que el paradigma CPP es capaz de proporcionar los animales con un medio para informar sobre su conciencia del dolor, por lo que podría ofrecer un método más apropiado de la evaluación de su centralizado (afectivo /subjetiva) en oposición a nociceptivo (efectiva)
propiedades.
la noción de que el dolor puede ser tan compleja en los animales (por lo menos en los mamíferos), ya que es en los humanos está subrayada por el hecho de que no hay un criterio único de medición puede (hasta ahora) evaluar de manera efectiva la misma. Bateson et al. originalmente aplicado a múltiples medidas de acercamiento a la solución de problemas científicos (más tarde denominado "triangulación") [47], citando que si bien "las pruebas obtenidas mediante diferentes enfoques era ambigua", "cuando se considera el conjunto de pruebas, tanto mayor confianza podría ser colocado en un sentido particular ". Al abordar el problema del sufrimiento de los animales, y aceptando que "no podemos observar directamente los sentimientos de un animal", Bateson recomienda que "debemos usar una variedad de tareas para ganar confianza en las conclusiones" [48]. En consecuencia, los estudios están aplicando cada vez varias medidas diferentes en un intento de caracterizar el dolor de forma más fiable [49], [50]. En este estudio se adoptó un enfoque similar, mediante la evaluación de un parámetro estándar del bienestar (peso corporal), junto con las pruebas de hipersensibilidad periférica, vigilar el comportamiento exploratorio espontánea y la realización de pruebas de CPP. A pesar de varias limitaciones, hiperalgesia pruebas (hipersensibilidad) todavía proporciona una valiosa indicador secundario del dolor de diversas modalidades diferentes, incluyendo el cáncer [12], [16], [19]. Los cambios de comportamiento son también una respuesta común al dolor, pero la recogida y análisis de datos son a menudo mucho tiempo, especialmente si se aplica en los estudios, que suelen durar varias semanas; Como suele ser el caso en estudios de cáncer. La interpretación de estos datos también puede ser problemático, ya que, como ya se ha descrito, siempre hay explicaciones alternativas para cualquier cambio de comportamiento que se detectan. Una posibilidad es citado a menudo que los signos de incapacidad en los roedores podrían estar ocultos como una respuesta adaptativa para reducir la probabilidad de depredación; a pesar de que sabemos, éste nunca se ha demostrado de manera inequívoca. Para superar al menos en parte, la limitación de tiempo se utilizó el software automatizado de registro de la conducta (HomeCageScan; Clever Systems Inc., VA, EE.UU. (HCS)). Con ello se reconoce un rango (& gt; 20) estados de ratón con una precisión comparable al análisis manual por parte de un observador entrenado [27], [28]. En este estudio hemos contrastado los resultados sobre los cambios de comportamiento y la hiperalgesia con los resultados de las pruebas de CPP para evaluar las consecuencias de cáncer de vejiga en el bienestar de los ratones; aplicar el concepto de triangulación. Por lo que sabemos, se ha hecho ningún intento anterior para evaluar el enfoque de CPP como se describe aquí durante el desarrollo del tumor; acondicionar y comprobar con ciclos consecutivos. También trató de medir (por lo menos hipotéticamente) si esto podría ser un enfoque útil para rastrear fármacos candidatos para el tratamiento del dolor por cáncer en los seres humanos. Encontramos ratones tumorales ganaron menos peso, desarrollamos la hiperalgesia y mostraron cambios de comportamiento que fueron tiempo ligada a una mayor búsqueda de la morfina en ratones portadores de tumores en los 7 días anteriores a la eutanasia. Llegamos a la conclusión de que la explicación más probable de estos cambios fue el dolor. Si no es así debido al dolor, al menos, los resultados indicaron un impacto negativo en el bienestar, posiblemente incluyendo
malestar
. Ordinariamente ratones sólo se eliminan de estudios después de este tiempo, indicando la necesidad probable de punto final refinamiento en este modelo de ratón de cáncer de vejiga. Nuestro método de aplicación de las pruebas de CPP también podría ser un método potencialmente útil de probar la eficacia de los analgésicos destinados para el cáncer y otras condiciones, especialmente aquellos en los que el dolor puede aumentar con el tiempo.
Métodos
Declaración de Ética
Todo el trabajo se realizó de conformidad con la Ley de 1986 Animales (Procedimientos científicos) y fue objeto de revisión ética local. Los experimentos también se adhirieron a las directrices del Comité para la Investigación y Cuestiones éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Ministerio del Interior del Reino Unido (Proyecto de licencia PPL 60/4431).
Sujetos y Cría
Todos los ratones fueron C3H hembra /gallina, pesaban 25 a 30 g de entrega (Charles river Laboratories Inc., UK) y tenía libre acceso a una dieta comercial en pellets (R & amp;. M no.3 SDS LTD, Whitham, Reino Unido) y agua del grifo en grupos de 10 para una semana de aclimatación. Posteriormente fueron alojados individualmente (Makrolon 2 jaulas; Norte Kent plásticos, Reino Unido) para una semana antes de la inscripción. Aserrín y virutas de madera fueron usados como ropa de cama y jaulas fueron suplementados con 'Nido del chisporroteo', un bloque de masticar-álamo y un tubo de cartón (B & amp; K universal). La temperatura ambiente se mantuvo a 21 ± 1 ° C con 15-20 cambios de aire por hora bajo un ciclo de 12 horas de luz (luces apagadas a las 19:00 h). Todas las pruebas se llevó a cabo 10 a.m.-3 p.m.
Recogida de datos
Los resultados de los estudios que utilizaron 3 grupos separados de ratones se describen.; (1) Estudio de Hargreaves (pruebas nociceptivo), (2) Estudio de Comportamiento y pruebas (3) preferencia de lugar condicionado (CPP) que consiste en un piloto de dosis que varía investigación y luego un estudio principal. Los datos obtenidos en los estudios 1 y 2 eran de ensayos exploratorios realizados por colegas del Instituto del Norte de Investigación del Cáncer (NICR) utilizando células singénicas MBT-2 (ratón) de vejiga tumorales derivadas de ratones C3H /ave /J (células donadas por el Prof. Michael O'Donnell (Universidad de Iowa, Iowa City, IA, EE.UU.) y el Dr. William A. Larchian (EMH /Cleveland Clinic Centro de próstata, Cleveland, OH, EE.UU.)). Los datos de CPP se obtuvieron a partir de ratones obtenidos específicamente para la prueba. los objetivos de nuestros colegas fueron; inicialmente para caracterizar el perfil de crecimiento de los tumores de vejiga ortotópicamente implantados (Estudio 1) y luego para perfeccionar la metodología implante (Estudio 2). Sin embargo, ambos estudios fueron una oportunidad para recopilar datos complementarios sobre los efectos patológicos (posiblemente incluyendo el dolor) que ayudarían en el diseño del estudio principal (CPP); reduciendo de este modo el uso de animales a un nivel tan bajo como sea posible.
Estudio Hargreaves
Este fue un estudio piloto llevado a cabo para establecer las características de crecimiento de las células MBT-2 ortotópica implantados que informar sobre la eventual diseño del estudio de CPP. El tamaño del grupo se determinaron por colegas NicR en función de sus requisitos del estudio. Los ratones se asignaron aleatoriamente a tres grupos de 5 que se sometieron a laparotomía para la implantación ortotópica de 100 l de Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS), o el mismo volumen de DPBS que contenía 2 × 10
4 o 2 × 10
5 MBT -2 células. Un cuarto grupo de 5 ratones fueron únicos controles de anestesia. Ocho ratones a los que se sometieron a cirugía fueron elegidos al azar para recibir 5 mg /kg de meloxicam (por vía subcutánea; s /c) para aliviar el dolor post-quirúrgico [27], mientras que el resto recibió solución salina (0,3 mls S /C, n = 7). Se indujo la anestesia con 5% de isoflurano en oxígeno (5 l /min.) En una cámara Perspex. Los ratones luego se quedó en decúbito dorsal sobre una manta de calentamiento para mantener la temperatura corporal entre 34,5 y 37,5 ° C y se mantuvo la anestesia con isoflurano en 1,5-2% de oxígeno (500 ml /min.). Profundidad se controló mediante la observación de la frecuencia respiratoria y la evaluación periódica de los reflejos del dedo del pie-pellizco. pomada ocular simple (Pliva Pharma Ltd., Reino Unido) se utilizó para evitar el secado de la córnea. La cirugía fue de una incisión en la línea media 0,5 cm en la piel y los músculos que recubren la vejiga. Una vez expuesto, se inyectaron 0,1 ml de solución salina o de la suspensión de células tumorales apropiada por vía intramuscular en la pared de la vejiga usando una jeringa de insulina. Los músculos abdominales y la piel se cerraron por separado utilizando 5/0 poliglactina 910 ( "Vicryl", Ethicon Ltd., Edimburgo, Reino Unido) y adhesivo tisular ( 'Nexaband', los laboratorios Abbott, Chicago). Anestesia duró aproximadamente 10 minutos
latencias de retirada térmicos se obtuvieron en la línea base, y en 1 hora y 1 día (24 horas) después de la cirugía y, a continuación, en días.; 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 utilizando la prueba plantar (Modelo 37370; Ugo Basile, Italia) de acuerdo con el método de Hargreaves [51]. Los animales fueron colocados en cámaras de acrílico transparente en un piso de vidrio y habituaron durante 10 minutos. Una fuente de calor infrarrojo se aplica alternativamente a la zona central de la planta de cada pata trasera (70% de la capacidad máxima de calentamiento; equivalente a 253 ± 7 mW /cm
2; 30 segundos de corte). Esto proporcionó una gama adecuada de las latencias de respuesta en ratones normales (~between 3 y 8 segundos). Tres respuestas se obtuvieron de cada pata trasera con un intervalo mínimo de 1 minuto entre grabaciones ipsilaterales. Los datos sólo se obtuvieron de los ratones de control anestesia hasta día 3 cuando se requiere otra parte. Los pesos corporales se registraron diariamente hasta el día 4, y luego en los días de prueba nociceptivo. A medida que los tumores eran internos, etapa de crecimiento se estimó por palpación diaria por un técnico experimentado que clasifica los tumores en una escala de 3 puntos; desde 1 (apenas está presente) a 3 (obvio, sin manipulación). Estas inspecciones también incluyen un registro de las actividades asociadas con el dolor abdominal en roedores [21], [31] y otros signos de mala salud tales como hematuria, letargia, deshidratación y pelaje pobre y la condición corporal.
Estudio de Comportamiento
Los datos de comportamiento fueron recolectados como parte de un estudio de seguimiento (de nuevo sin uso adicional de animales) para evaluar un método potencialmente más refinado (no quirúrgico) de la implantación de células [52]. Nuestros colegas buscaron establecer si el injerto del tumor podría mejorarse con este método, mientras que deseábamos para evaluar los efectos a largo plazo del crecimiento del cáncer en el comportamiento. Al igual que antes, se pre-determinados tamaños de grupo; 20 ratones se asignaron al grupo de DPBS y 20 al grupo de tumor. Se indujo la anestesia como se describe anteriormente, pero en lotes de 5 ratones utilizando un sistema de suministro de gas-máscara abierta a medida. El procedimiento de implante ya se ha descrito, pero brevemente, se accedió a la vejiga de cada ratón a través de una cánula pediátrica de calibre 27 colocada en la uretra. La orina fue anulada por una suave presión suprapúbica y aspiración, y la mucosa de la vejiga acondicionado con un enjuague ácido suave (50 l de HCl 0,1 M) durante 20 segundos. Esto también se aspiró y después se neutralizó con 50 l 0,1 M de KOH, y tres lavados DPBS. La vejiga se vació antes de infundir 50 l de 5 × 10
6 MBT-2 células o el mismo volumen de DPBS a través de una jeringa atado a la cola. La concentración de células fue mayor en previsión de una fracción celular desconocido, dado que carece en la orina después de la recuperación. Las células se dejaron
in-situ
durante 30 minutos, después de lo cual los ratones se colocaron en una incubadora a 37 ° C durante 20 minutos. el desarrollo tumoral se controló diariamente como antes y los pesos corporales también se registraron diariamente. Los ratones fueron filmadas individualmente durante 10 minutos utilizando una cámara de vídeo (Sony DCR-HC96, Sony, Japón) colocado sobre un trípode 30 cm desde la parte frontal de 1284'cages Borrar '(35 × 20 × 14 cm; TECHNIPLAST, UK Ltd) que contienen Sólo ropa de cama (Aspen serrín). El procedimiento para la recolección de datos comportamiento fue descrito anteriormente [28], salvo que era en días alternos antes de la detección del tumor, y después diariamente. El rodaje fue siempre durante la fase de luz, pero fue al azar la hora del día se filmó cada ratón dentro de los grupos de tumores y de control.
Estudios acondicionado lugar de preferencia
El trabajo CPP se llevó a cabo en 2 etapas. El primero fue un estudio piloto para explorar el desarrollo de CPP a la morfina bajo acondicionar y comprobar ciclos repetitivos, y para identificar una dosis de morfina para el estudio principal de CPP. La dosis elegida sería una que admite sólo modesto lugar preferencia, pero retiene suficientes propiedades analgésicas para obtener el refuerzo negativo en ratones portadores de tumores. Los números se determinaron mediante un análisis de poder retrospectiva de anteriores resultados morfina CPP a través de una gama de tasas de dosis en ratones normales (1 y 5 mg /kg s /c) [53], que también deben provocar efectos analgésicos significativos [54], [55] . Se encontraron retrospectivamente tamaños de las muestras de 8 o 10 para alcanzar 79% o 91% de la potencia en la detección significativa CPP para un medicamento (3 o 5 mg /kg de morfina) versus compartimento con placebo emparejado. El aparato consistía en CPP (barra de acero con piso) negro y blanco (solados de rejilla de acero) compartimentos separados por una (con piso sólido de color gris) start cámara. Se han utilizado 4 unidades idénticas de ensayo (Med Associates, St. Albans, VT, Estados Unidos; Modelo CPP-3013AT) equipadas con puertas de guillotina y luces controladas automáticamente. Compartimentos alojan las matrices de infrarrojos para grabar automáticamente los tiempos de residencia del compartimiento y movimientos dentro y entre los 3 compartimentos. Se ha realizado una prueba inicial para determinar la preferencia del compartimiento de la línea de base de cada animal. Para ello se colocaron en el centro (gris) comienzan cámara durante 1 minuto antes de encender las luces y abrir las puertas de guillotina. las pruebas de preferencia siempre se llevó a cabo 10 a.m.-2 p.m.. El tiempo relativo dedicado a explorar los compartimentos en blanco y negro sobre un juicio posterior de 15 minutos fue calculado como un porcentaje del tiempo total de la prueba (véase CPP sección de análisis de datos). Los ratones fueron asignados para el acondicionamiento en el compartimento en el que pasaron proporcionalmente la menor cantidad de tiempo (es decir, su cámara no preferido) S + (solución salina o morfina), pero no los ratones mostraron preferencias compartimiento iniciales proporcionadas superiores a 0,6 (los detalles Sección de Análisis de CPP el método de cálculo preferencia). El diseño fue entonces contra-equilibrado de tal manera que la preferencia inicial grupo relativo aproxima lo más estrechamente posible a 0,5 (es decir, igual número fueron asignados por grupo al negro (B) o blanco W) S (+ cámaras). Sobre esta base, ocho ratones fueron asignados a cada uno de 2 grupos de morfina que abarcan el rango probable de las tasas efectivas analgésicas de dosis (1 o 5 mg /kg s /c) y un grupo representativo de 4 ratones fueron testigos de solución salina. Una vez que llegamos a la etapa de pruebas para el cáncer sabíamos que el enfoque tradicional de CPP ensayos de condicionamiento repetitivas seguido de una sola prueba de preferencia no sería apropiado. Esto era porque si se produce dolor; También hemos querido capturar su aparición. Informado por esto, todas las pruebas de CPP (incluidos en el estudio piloto) consistió en bloques repetitivos de 3 días, con cada bloque que comprende de 2 días de acondicionamiento antes de una prueba de preferencia libre de drogas cada día subsiguiente (que se muestra en la Figura 1). Para el estudio piloto de los 4 controles recibieron sólo solución salina (0,03 ml s /c) en tanto el S y S + condiciones. Debido a la posibilidad de morfina 'arrastre' de la tarde + S ensayos era necesario que los vehículos (S-) inyecciones siempre se les dio por la mañana y S + (morfina o solución salina) en la tarde. La morfina se obtuvo como solución de sulfato de morfina (30 mg /ml; Supplies NHS, Reino Unido) y se diluyó apropiadamente con agua para inyección (WFI) para ser administrada por vía subcutánea en un volumen de 0,03 ml. Todas las inyecciones se administran inmediatamente antes de la colocación en el compartimento B asignado o W para un periodo de acondicionamiento 45 minutos con la guillotina puertas cerradas. Los ratones fueron devueltos a sus jaulas hogar-inmediatamente después de cada sesión de condicionamiento. Se realizaron cuatro pruebas de preferencia consecutivos para el estudio piloto (4 bloques de prueba; Figura 1). Precisamente, siguiendo el método utilizado para determinar la preferencia inicial compartimento
Los sucesivos bloques eran cada una de dos días de acondicionamiento donde los ratones se sometieron a la mañana S- (solución salina) y luego tratamientos tarde S + (morfina o solución salina) y se limitaron durante 45 minutos en la cámara de blanco o negro. El tercer día de cada bloque era una prueba de preferencia libre de drogas, y el ciclo de 3 días se repitió hasta la eutanasia.
La investigación principal CPP comenzó con una repetición de las pruebas iniciales preferencia. Cada ratón se le asignó un compartimento B o W para su posterior S /S + acondicionado de la manera descrita anteriormente (los números de equilibrio inicialmente prefiriendo el compartimento B o W a través de los grupos de control y tumorales). Como antes, los ratones fueron asignados a su compartimiento inicialmente no preferido medida de lo posible. los ratones del tumor se implantaron de nuevo a través de la uretra con 50 DPBS l que contenía 5 × 10
6 MBT-2 células. Treinta ratones fueron implantados con células tumorales de forma ortotópica y diez fueron testigos de solución salina. Estos números fueron informados por nuestros hallazgos previos sobre el número de fracasos del injerto después de la implantación de la uretra. Se planificó para equilibrar el diseño (y aún más el uso de animales de conservas) mediante la asignación de estos fallos de los grupos de control, pero sólo si no había signos palpables o de otro tipo de desarrollo del tumor después de 21 días. ausencia del tumor también se confirmó
post-mortem.
Una vez que las inspecciones clínicas confirman el crecimiento del tumor, cada ratón se inició CPP acondicionado y un tratamiento de control no tumoral emparejados entraron en el estudio al mismo tiempo. luego continuó la serie durante 3 días de acondicionamiento y de ensayo sesiones hasta que los ratones fueron sacrificados (véase la sección sobre determinación del punto final). Por lo tanto, los grupos experimentales formaron un (Drogas) × 2 (Tratamiento) diseño factorial 2 que combina acondicionado a la morfina o 0,9% de solución salina en ratones tumorales o no tumorales. Hemos seleccionado una dosis intermedia de la morfina (2 mg /kg s /c) para el estudio principal sobre la base de los resultados del estudio piloto. En las principales pruebas de preferencia estudio de CPP fueron también 45 en lugar de 15 minutos, pero la metodología era de otra manera idéntica a la utilizada en el estudio piloto. Debido a limitaciones de tiempo y el factor de confusión potencial de la colocación en otros entornos no familiares (de hecho, otros lugares ''), las evaluaciones de comportamiento y la hiperalgesia no se llevaron a cabo como el estudio de CPP progresó. Sin embargo, el efecto del tratamiento analgésico de la última etapa en el comportamiento se evaluó como posible opción refinamiento. Esto significaba que los ratones sobre la eutanasia días se filmaron durante 20 minutos antes y después de la inyección de la dosis de acondicionamiento de la morfina (2 mg /kg s /c) y grabaciones idénticas fueron hechos de un número igual de controles en el último día del estudio.
punto final determinación
en los exámenes clínicos se llevaron a cabo en todos los estudios para determinar si los ratones portadores de tumores necesitan para ser retirados. Estos estaban de acuerdo con las directrices publicadas [10], [11] y con el asesoramiento del personal de cuidado de los animales de gran experiencia. La eutanasia era inevitable una vez que los animales tenían un gran tumor palpable o pérdida de peso corporal de más de 15%, y si cualquiera de ellos coincidió con hematuria significativa (indicados por la piel manchada de sangre y /o ropa de cama). Todos los ratones, incluyendo los controles se sometieron a la palpación. Ellos fueron restringidos de la manera que es habitual para una inyección intraperitoneal. A continuación, la región de la vejiga se palpó suavemente entre el pulgar y el índice, pero con la presión suficiente para determinar la hora más temprana del inicio del desarrollo del tumor más fiable posible.
Análisis de Datos
estudio de Hargreaves.
Como latencias de respuesta fueron inicialmente similar entre la izquierda y derecha patas traseras, todos los valores se promediaron para calcular la latencia de la respuesta media global en cada tiempo de grabación. Los datos han cumplido los requisitos para el análisis paramétrico de modo fueron examinadas usando ANOVA de medidas repetidas con 'Time' (10 niveles) y "Grupo" (4 niveles, 2 × tumoral; 1 × placebo y sólo la anestesia), intra e inter-sujetos factores de respectivamente .
post-hoc
niveles de tiempo y se hicieron comparaciones de grupos de probabilidad individuales y adaptar en consecuencia (
Bonferroni
). Los cambios en el peso corporal también se calcularon como el cambio de línea de base y los mismos métodos estadísticos aplicados. Para mayor claridad, los cambios de peso se representan como valores absolutos en cada punto de tiempo. Debido a la ausencia de datos nociceptivas en los ratones de control no la cirugía después del día 3 y el peso corporal de datos tras día 4 todos los análisis siguiendo estos momentos sólo se incluyen los grupos de cirugía. Por último, los efectos de meloxicam antes de la cirugía se examinaron mediante la comparación de las latencias de respuesta basal hasta el punto de tiempo de 1 hora en el ANOVA; pero con "pre-tratamiento" (meloxicam o solución salina) como entre el factor de sujetos (n = 7 (solución salina) en comparación con n = 8 (meloxicam)).
Estudio de Comportamiento.
El comportamiento los datos se procesaron utilizando el software de análisis automatizados HCS. Las medidas utilizadas fueron las clases de la distancia total recorrida y cinco de comportamiento que comprenden diferentes elementos de los 20 comportamientos individuales del sistema reconocido. Estos fueron: 1) Crianza (que comprende 'trasero Up' (tanto parcial y total extensión bípeda) & amp; la actividad recíproca 'Come Down'); 2) el comportamiento activo (incluyendo caminar, correr, saltar y escalar); 3) abdominal y estética, y 5) en reposo (períodos inactivos). Que resume las ocurrencias de comportamientos dentro de cada clase como la magnitud relativa de los elementos de la clase era suficientemente uniforme. p.ej.