Extracto
Antecedentes
polipéptidos Lamina-2 asociada (LAP2) es una proteína nuclear que conecta la lámina nuclear con la cromatina. Aunque se han descrito sus papeles críticos en los trastornos genéticos y tumores malignos hematopoyéticos, su expresión y su papel en cánceres del tracto digestivo han descrito adecuadamente.
Métodos
Para examinar la expresión de LAP2 en tejidos del paciente, se realizó inmunohistoquímica y PCR en tiempo real. Para examinar la motilidad de las células cancerosas, se empleó la cámara de Boyden, Herida ensayos de curación y la invasión de Matrigel. Para revelar sus papeles en la metástasis in vivo, se utilizó un modelo de metástasis hepática de xenoinjertos. Para investigar el mecanismo subyacente, se llevó a cabo una micromatriz de ADNc.
Resultados
La inmunohistoquímica en tejidos de pacientes mostró que la expresión generalizada de LAP2 en diversos cánceres del tracto digestivo, incluyendo el estómago, el páncreas, el hígado y cáncer de las vías biliares . PCR en tiempo real confirmó que LAP2β se sobre-expresa en los tejidos de cáncer gástrico. Desmontables de LAP2β no afectó a la proliferación de la mayoría de las células de cáncer del tracto digestivo, excepto las células de cáncer de páncreas. Sin embargo, desmontables de LAP2β disminución de la motilidad de todas las células cancerosas ensayadas. Por otra parte, la sobreexpresión de LAP2β aumento de la motilidad de células de cáncer gástrico y pancreático. En el modelo de xenoinjerto de la metástasis de hígado, LAP2β aumentó la eficacia metastásica de células de cáncer gástrico y la mortalidad en ratones ensayados. microarrays de ADNc mostraron la posibilidad de que miristoilada sustrato rico en alanina C quinasa (MARCKS) y interleukin6 (IL6) pueden mediar la motilidad regulado LAP2β de las células cancerosas.
Conclusiones
De los resultados anteriores, se concluir que LAP2 es ampliamente sobreexpresa en diversos cánceres del tracto digestivo y LAP2β regula la motilidad de las células de cáncer y sugieren que LAP2β puede tener utilidad para el diagnóstico y la terapéutica en cánceres del tracto digestivo
Visto:. Kim HJ, Hwang SH, Han ME , Baek S, SE Sim, Yoon S, et al. (2012) LAP2 es ampliamente sobreexpresa en diversos cánceres del tracto digestivo y regula la motilidad de las células cancerosas. PLoS ONE 7 (6): e39482. doi: 10.1371 /journal.pone.0039482
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 8 Septiembre, 2011; Aceptado: 24 de mayo de 2012; Publicado: 20 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa Nacional de investigación del centro de núcleo de investigación médica Instituto Grant (2010-25), el hospital Universitario Nacional de Pusan, el programa de centros de investigación médica del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología /Corea Ciencia e Ingeniería de Cimentaciones (2011-0006190) y Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (núm R15-2006-022-01001-0). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metástasis de las células de cáncer afecta en gran medida el pronóstico de pacientes con cáncer. La tasa de supervivencia de los pacientes con metástasis a distancia es significativamente menor que los que se han localizado tumor en la mayoría de tipos de cáncer [1]. Uno de los factores críticos en la metástasis es la motilidad de las células cancerosas [2]. Muchas moléculas importantes que regulan la motilidad de las células cancerosas han sido identificados. Dado que la inhibición de la migración es eficaz en el tratamiento de metástasis en muchos aspectos, muchos inhibidores de migración están bajo el desarrollo clínico [3]. Por ejemplo, Rho quinasa es una pequeña GTPasa que regula la actina y la red microtubular y protuberancias celulares. Así, un inhibidor que se dirige a la Rho-cinasa está bajo el desarrollo clínico [3].
polipéptidos Lamina-asociado 2 (LAP2) es una de las proteínas LEM-dominio, que son proteínas de la membrana nuclear interna que comparten un motivo común de aproximadamente 40 aminoácidos, conocido como el LEM-dominio [4], [5]. LEM-proteínas de dominio conectan la membrana nuclear interna y la lámina nuclear con la cromatina a través del factor de barreras a autointegration (BAF). La familia de proteínas LEM-dominio incluye LAP2 [6], [7], [8], emerin [9], man1 [4], LEM2 [10] y LEM3 [11]. El nombre se deriva de LEM LAP2, Emerin y man1 [4].
Además de sus funciones estructurales en la membrana nuclear, proteínas LEM-dominio se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en diversos procesos celulares, como la replicación del ADN y regulación de la expresión génica. LAP2β regula la replicación del ADN mediante la interacción con HA95 durante la fase G1 del ciclo celular [12]. Esta interacción con HA95 lleva los complejos prereplication al origen de replicación y la estabiliza. La interrupción de esta interacción provoca la liberación de los componentes complejos prereplication y desencadena la proteólisis de Cdc6.
consecuencias patológicas han sido descritas para las proteínas LEM-domain de trastornos genéticos en los seres humanos y se llaman colectivamente laminopathies [5], [13 ]. Por ejemplo, la deficiencia de Emerin causa de Emery-Dreifuss distrofia muscular (la DEF) [9], [14], [15] y la deficiencia conduce a man1 osteopoiquilia, síndrome de Buschke-Ollendorf y melorreostosis [16]. Además de estos laminopathies, la participación de LAP2 en la carcinogénesis se ha descrito. Por ejemplo, LAP2β se ha demostrado estar involucrados en la proliferación de linfocitos malignos [12], [17], [18]. Por otra parte, se informó que la sobreexpresión de LAP2α en los tejidos de la laringe, pulmón, estómago, mama y cáncer de colon [19]
La familia de proteínas de dominio LAP2 LEM, se compone de al menos seis isoformas en los mamíferos:. Α, β , γ, δ, ε, ζ, [6], [20], [21], [22]. Estas isoformas se generan mediante corte y empalme alternativo de la misma transcripción. Todas las isoformas de mamíferos, excepto el LAP2α y LAP2ζ son proteínas de la membrana nuclear interna y comparten una organización de dominio similar. El segmento N-terminal contiene el LEM-dominio y dominio LEM-similares. A diferencia del LEM-dominio, el dominio LEM-como puede interactuar directamente con la cromatina y sin ayuda de BAF. El segmento C-terminal de las proteínas LAP2 tiene dominios de unión a Lamin-. Cabe destacar que el segmento C-terminal de α-isoforma carece de un dominio transmembrana putativo, por lo que la proteína se distribuye por todo el núcleo. Aunque LAP2α, β, y γ se expresan de forma ubicua en la mayoría de células de mamífero, la expresión diferencial de las isoformas LAP2 se ha descrito. tejidos diferenciados altamente expresan la isoforma LAP2γ, sin embargo, los tejidos con células en proliferación expresan más de las isoformas LAP2α y LAP2β [23].
Aunque sus papeles críticos en los trastornos genéticos y enfermedades malignas hematopoyéticas se han descrito, la expresión y las funciones de LAP2 en otras células o enfermedades están mal caracterizado. En el presente estudio, encontramos por primera vez un nuevo papel de LAP2β en la regulación de la motilidad de las células cancerosas y la sobreexpresión de LAP2 en diversos cánceres del tracto digestivo.
(A) La tinción inmunohistoquímica mostró sobreexpresión de LAP2 en diversa cánceres del tracto digestivo, incluyendo cáncer de páncreas, el hígado, el estómago y las vías biliares. Nota sobreexpresión de LAP2 en las células cancerosas metastásicas. Barra de escala, 200 micras. (B) La sobreexpresión de LAP2β en tejidos de cáncer gástrico se examinó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos para la β-isoforma. GAPDH se utilizó para normalizar todos los datos.
Western Blot (A, B) y PCR en tiempo real (C, D) se utilizaron para determinar la eficiencia de la precipitación (A, C) o sobreexpresión ( B, C) de LAP2β en SNU638 o Panc1 células. Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,01, prueba t de Student). (E) Efecto de LAP2β caída en la proliferación de células cancerosas. ensayo de WST-1 se utilizó para medir la proliferación de células cancerosas en la presencia de 10% de FBS. Cinco días después de la transfección con 100 nM LAP2β ARNsi 100 nM o revueltos (SCR) siRNA, se realizó WST-1 ensayo de proliferación. (F) Efecto de la sobreexpresión LAP2β sobre la proliferación de células cancerosas. ensayo de WST-1 se llevó a cabo en SNU638 o Panc1 células que sobreexpresan el gen LAP2β o vector de control. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes por quintuplicado (* P & lt; 0,01, prueba t de Student).
Métodos
Cultivos de Células y transfección
se utilizaron siguientes células de cáncer del tracto digestivo; Las células de cáncer gástrico (SNU216, SNU638), células colangiocarcinoma (SNU1079, HuCCT1), células de cáncer de páncreas (Panc1, MIA-PACA2), células de hepatocarcinoma (Huh7, HepG2). células HuCCT1, HepG2, SNU216, SNU638, SNU1079 y Huh7 se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina. células Panc1 y MIA-PACA2 fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DME) /alto contenido en glucosa suplementado con 10% de SFB y 100 mg /ml de penicilina /estreptomicina. La mayoría de las células se cultivaron a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Las células fueron transfectadas con siRNA usando DhamaFECT Reactivo 3 (Dhamacon, Lafayette, CO, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de siRNA son los siguientes: LAP2β siRNA (Bioneer, Daejeon, Corea), 5'-ACA AGA GGG UCA AGA AGA A (dTdT) -3 'y 5'- UUC UUC UUG ACC CUC UUG U (dTdT) -3 '; revueltos (SCR) siRNA (Dhamacon, Lafayette, CO, EE.UU.), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) 3 'y 5'-UUU UUU CGC CGC UCU GAU C (dTdT) 3'.
La sobreexpresión de LAP2β
La expresión constructo de ADN de pCMV-SPORT6-LAP2β (Thermo biosistema científica abierta, Huntsville, aL, EE.UU.) se utilizó para conducir la sobreexpresión y G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, EE.UU.) se utilizó para la selección. Las células fueron co-transfectadas con pCMV-SPORT6-LAP2β /pIRES-Neo en una relación de 5:02 utilizando Fugene HD (Roche, Nutley, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se establecieron células MOCK simultáneamente usando el vector de control vacío
Western Blot
Después de la electroforesis en gel y transferencia a una membrana de PVDF, la membrana se bloqueó durante una hora.. Después de la adición de anticuerpos primarios (ratón anti-humano LAP2β (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 1:1000) y el ratón anti-α-tubulina (BioGenex, 1:10000)) en solución de bloqueo, la membrana se incubó en las primarias anticuerpo a 4 ° C durante la noche en un agitador. Se aplicó el anticuerpo secundario apropiado (1:2000, peroxidasa de rábano picante anti-ratón conjugado) y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h en un agitador. Por último, las proteínas se detectaron utilizando LAS3000.
ensayo Boyden cámara (A-G) y cicatrización de heridas de ensayo (H, SNU638 células) se utilizaron para medir la migración de células cancerosas. LAP2β siRNA inhibe significativamente FBS- o la migración inducida por EGF en comparación con SCR siRNA en SNU638 (A, C), Panc1 (A, D) u otras células de cáncer del tracto digestivo (G). La sobreexpresión de LAP2β en SNU638 (B, E) o Panc1 (B, F) células aumentado significativamente la migración en comparación con el vector de control (B, E, F). EGF (100 ng /ml) o 10% FBS se utilizó para inducir la quimiotaxis. se añadió mitomicina C (0,01 g /ml) para eliminar los efectos de la proliferación. Dos días después de la transfección con 100 nM LAP2β ARNsi 100 nM o revueltos (SCR) siRNA, se realizaron dos ensayos de migración. Cuatro o seis horas más tarde después de la adición de EGF o FBS en ensayo de cámara de Boyden, se fijaron las células. Después de un rasguño en el ensayo de cicatrización de la herida, las células migradas se fijaron en los tiempos indicados. tinción representativa de células migradas se presentó (A, B). Las células migradas se contaron y los datos se presentan como gráficos (C-G). Los datos son las medias ± SD de tres experimentos independientes por triplicado (C-G, * P & lt; 0,01, prueba t de Student).
ensayo de invasión de Matrigel se utilizó para medir la invasión de las células cancerosas. Desmontables de LAP2β inhibió significativamente FBS- y la invasión inducida por EGF en comparación con SCR siRNA en SNU638 (A, C) o Panc1 células (A, D). La sobreexpresión de LAP2β en SNU638 (B, E) o Panc1 células un aumento significativo de invasión en comparación con el vector control (B, F). EGF (100 ng /ml) o 10% FBS se utilizó para inducir la invasión. se añadió mitomicina C (0,01 g /ml) para eliminar los efectos de la proliferación. Dos días después de la transfección con 100 nM LAP2β ARNsi 100 nM o revueltos (SCR) siRNA, se llevaron a cabo los ensayos de invasión. se presentó tinción representativa de células invadidas (A, B). células invadidas se contaron y los datos se presentan como gráficos (C-F). Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes por triplicado (CF, * P & lt; 0,01, prueba t de Student)
En tiempo real PCR se obtuvieron
tejidos de cáncer gástrico. con el consentimiento informado por escrito de los pacientes sometidos a resección quirúrgica en Pusan National University hospital y el hospital Yangsan Universidad Nacional de Pusan, y el estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional de los hospitales (número de permiso 2009-13). El ARN total de los tejidos o células se extrajeron usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Calsbad, CA, EE.UU.) o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc se sintetizó con la transcriptasa inversa MMLV (Promega, Madison, WI, EE.UU.), dNTP y cebadores oligo-dT. El primer secuencias fueron los siguientes: LAP2β, 5'-AGG GCA GAG CAA CAG CTC AGA TAA CAA-3 'y 5'-TTA TTC CAG GAG CTT AAT AGC TCT GAT TGT GC-3'; MARCKS, 5'-GTG CCC AGT TCT CCA AGA CCG CA-3 'y 5'-GGC CAT TCT CCT GTC CGT TCG CT 3', IL6; 5'-TAG CCG CCC CAC ACA GAC AGC C-3 'y 5'-TTC TGC TGC CAG CTC TTT TCG TCG-3'; STAT3, 5'-AAC ATG GCT GGC AAG GGC TTC TCC T-3 'y 5'-AGT GCT CAA GAT GGC CCG CTC CC-3'; GAPDH, 5'-GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT-3 'y 5'-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G - 3'. Real-time RT-PCR se llevó a cabo utilizando la energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un 7500 detector de secuencias ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), de acuerdo con el fabricante de protocolo. GAPDH se utilizó para estandarizar los niveles de entrada de ADNc.
Inmunohistoquímica
Después de desparafinación y rehidratación, los portaobjetos se sometieron a peróxido de hidrógeno 0,3% durante 30 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. El bloqueo se hizo con 10% de suero normal de burro (NDS) y 1% de BSA en 1X PBS. A continuación, los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C en tampón de bloqueo que contiene el anticuerpo primario siguiente; LAP2 anti-humano (1:200, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.), anti-STAT3 (1:100, Señalización Celular, Beverly, MA, EE.UU.), anti-IL-6 (1:100, Abcam, Cambridge, Reino Unido) o anti-MARCKS (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) anticuerpo. El anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa de rábano picante) La unión se realizó a una dilución 1:200 en tampón de bloqueo durante 2 h a TA. La detección se realizó con HRP (Vector Laboratories) usando el kit de sustrato DAB (Vector Laboratories). Contratinción se realizó durante 1 min con tampón de tinción hematoxilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Ensayo de proliferación celular
Dos, tres o cinco días después de la transfección con siRNA, hemos añadido 10 l de reactivo de proliferación de las células pre-mezclado soluble en agua la sal de tetrazolio-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) en cada pocillo. Se incubaron estas células durante dos horas en la incubadora. La viabilidad celular se midió por absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA (TECAN, Männedorf, Suiza).
Boyden Cámara Ensayo
La migración de las células de cáncer se midió en una cámara de Boyden. Aproximadamente el 5 × 10
4 células en 0,05 ml de medio RPMI 1640 libre de suero se sembraron al pozo membrana recubierta con colágeno de tipo I. Para eliminar los efectos de la proliferación, se añadió mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma, EE.UU.). Las células se dejaron migrar durante cuatro o seis horas. Las membranas se fijaron y se tiñeron con solución Diff-Quik (Sysmex, Kobe, Japón) durante un minuto y se lavaron con agua destilada. Se determinó el número de células en 10 campos elegidos al azar usando un microscopio de luz. Los experimentos se realizaron por triplicado y tres veces repetido.
Curación de Heridas Ensayo
La monocapa celular se rascó con una punta de pipeta amarilla y la migración de las células a la zona de la herida se observó bajo un microscopio invertido. Para eliminar los efectos de la proliferación, se añadió mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma, EE.UU.). Las imágenes fueron tomadas en los momentos indicados. Las mediciones se tomaron a partir de cinco campos microscópicos individuales en cada experimento, y se presentan los datos representativos de tres experimentos.
Matrigel Invasion Ensayo
Se determinó la capacidad de las células cancerosas de invadir el uso de 24 pocillos insertos de cámara BioCoatTM MatrigelTM (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). El inserto interior de las cámaras de invasión se recubrieron con 0,5 mg de factor reducido Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y el inserto exterior por 0,5 mg /ml de fibronectina (Sigma-Aldrich, St. Louis /ml el crecimiento, MO, EE.UU.). Las células se sembraron en insertos a una densidad de 5 × 10
4 por inserción en un medio libre de suero y luego se transfirieron a pozos llenos con el medio de cultivo que contiene 10% de FBS o 100 ng /ml de EGF como un quimioatrayente. Para eliminar los efectos de la proliferación, se añadió mitomicina C (0,01 g /ml, Sigma, EE.UU.). Después de 24 (10% FBS) o 52 horas (100 ng /ml de EGF) de incubación, las células no invasora en la parte superior de la membrana se retiraron por raspado. células invadidas en la parte inferior de la membrana se fijaron, seguido de tinción con solución de Diff-Quik. Los experimentos se realizaron por triplicado, y se contaron al menos 10 campos en cada experimento.
Liver Metastasis modelo de xenoinjerto
La capacidad de los transfectantes a la metástasis en el hígado se evaluó por las células lentamente inyectables ( 5 × 10
6 /0,05 ml) en el bazo de los ratones desnudos a través de una aguja de calibre 27 (grupo NK4, grupo mock; n = 5 /grupo). Para los estudios patológicos, todos los ratones fueron sacrificados a las 5 semanas y se aislaron los hígados, se fijaron en 10% neutral - formalina tamponada, y embebidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El Comité Nacional de Pusan Cuidado de Animales de la Universidad institucional y el empleo (PNUIACUC) aprobó los procedimientos experimentales (número de permiso: PNU-2010 a 00.083).
cDNA microarrays
ARN total fue extraído de SNU638-LAP2 y SNU638 células simulados utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. entonces cuantificada ARN se utilizó para el análisis de microarrays en chips humano HT-12_v4_Bead (Illumina Inc., San Diego, CA, EE.UU.). muestras de ARN total se marcaron usando el Kit de Illumina TotalPrep de amplificación del ARN (Ambion, Applied Biosystems, CA, EE.UU.) para la síntesis de ADNc y la transcripción in vitro. ARN monocatenario (cRNA) se generó y se marcó mediante la incorporación de biotina-NTP (Ambion). Un total de 0,5 g de cRNA marcado con biotina se hibridó a 58 ° C durante 16 h a de Illumina humano HT-12_v4_BeadChip (iluminación). El cRNA biotinilado hibridado se detectó con estreptavidina-Cy3 y se cuantificó usando un escáner lector de BeadArray (Illumina) según las instrucciones del fabricante. matriz de datos fueron procesados y analizados por el software Illumina BeadStudio versión 3.0 (iluminación). Los datos escaneados se normalizaron por el método de normalización cuantil-cuantil y log-transformados (por base dos). Todos los datos son compatibles con MIAME y los datos en bruto se presentaron al repositorio público. (NCBI GEO número de acceso: GSE31450)
Se inyectaron células de cáncer gástrico que sobreexpresan LAP2β gen o el control de vectores en el bazo y metástasis en el hígado se examinó 5 semanas después. regiones tumorales metastásicas se indican mediante una línea discontinua. Se presentan coloraciones E en una metástasis hepática; immunostainings representativos con anti-LAP2, anti-IL-6, anti-STAT3, y los anticuerpos anti-MARCKS, y H & amp. El asterisco indica las lesiones tumorales. Barra de escala, 50 micras.
Análisis de Datos
Todos los datos se presentan como medias ± SD. La diferencia entre los valores medios de los dos grupos se evaluó mediante la prueba t de Student (sin pareja). Para la comparación de más de 3 grupos, se utilizó un análisis de una vía de la varianza (ANOVA), seguido por comparaciones múltiples de Tukey. * Indica un valor de p. & Lt; 0,05, que se consideró estadísticamente significativa
Resultados
LAP2 es ampliamente sobreexpresa en diversos cánceres del tracto digestivo
Para examinar los patrones de expresión de LAP2 en los cánceres de tracto digestivo, incluyendo el estómago, el páncreas, el hígado y el cáncer del conducto biliar, se realizó inmunohistoquímica utilizando tejidos de pacientes (n = 15 por cada tipo de cáncer). LAP2 proteína fue ampliamente sobreexpresa en el área cancerosa de tejidos en comparación con las zonas no cancerosas (Fig. 1A, 47% en cáncer de estómago, un 27% en el cáncer de páncreas, el 30% en el cáncer de hígado, 40% en el cáncer de las vías biliares). En particular, se observó expresión de LAP2 en las células cancerosas metastásicas de los tejidos de los pacientes. Debido LAP2 tiene numerosas isoformas, que se centró en LAP2β. Para confirmar los resultados de immunohistochemistsry, se realizó PCR en tiempo real utilizando cebadores LAP2β específicos en tejidos de cáncer gástrico. A pesar de todos los tejidos analizados no sobreexpresan LAP2β, se sobreexpresa en 13 casos (24 casos en total, Fig. 1B).
Roles de LAP2β en la proliferación, migración y la invasión de las células cancerosas
Para examinar las funciones de LAP2β en la carcinogénesis, hemos derribado o sobreexpresa LAP2β utilizando siRNA o ADNc, respectivamente. Se verificó la eficacia de la modulación de gen LAP2β por Western Blot o PCR en tiempo real (Fig. 2A-D). LAP2β siRNA (100 nM) disminuyó el nivel de mRNA de LAP2β en SNU638 o Panc1 células en comparación con SCR siRNA por 42% o 61%. La sobreexpresión de LAP2β mediante transfección de ADNc se incrementó el nivel de mRNA de LAP2β en SNU638 o Panc1 células (clon#6) en comparación con el vector de control por 1,7 o 19,6 veces, respectivamente.
A continuación, se analizó el papel de LAP2β en la proliferación de las células cancerosas. Cinco días después de la transfección con SCR o LAP2β siRNA, WST-1 ensayo de proliferación se llevó a cabo. Desmontables de LAP2β no afectó a la proliferación de las células de cáncer más probadas, excepto las células de cáncer de páncreas (Fig. 2E). LAP2β siRNA inhibió la proliferación de células de cáncer de páncreas Panc1 MIA-PaCa2 y en comparación con SCR siRNA por 74% y 46%, respectivamente (Fig. 2E). Hemos observado resultados similares cuando se realizó WST-1 ensayo de proliferación de dos o tres días después de la transfección. La sobreexpresión de LAP2β en células SNU638 o Panc1 afectada ligeramente la proliferación (Fig. 2F).
Para determinar el papel de LAP2β en la migración de las células cancerosas, se realizaron estudios usando un ensayo de cámara de Boyden. En todas las células de cáncer probadas, desmontables de LAP2β inhibió la migración de las células cancerosas (Fig. 3). Por ejemplo, LAP2β siRNA inhibe FBS- o EGF inducida por la migración de células SNU638 comparación con SCR siRNA por 47% y 70%, respectivamente (Fig 3A, & amp;. 3C). En constraste, la sobreexpresión de LAP2β aumento de la migración inducida por EGF FBS- y de SNU638 células en comparación con las células simulacros de 145% y 387%, respectivamente (Figura 3B & Amp;. 3E). Se obtuvieron resultados similares en células que sobreexpresan LAP2β- Panc1 (Fig 3B & amp;. 3F). Este efecto sobre la migración de las células cancerosas se confirmó adicionalmente mediante un ensayo de cicatrización de heridas en células SNU638 (Fig. 3H). Estos resultados nos llevaron a examinar el papel de LAP2β en la invasión de las células cancerosas. En un ensayo de invasión de Matrigel, LAP2β siRNA inhibe FBS- y la invasión inducida por EGF de células SNU638 comparación con SCR siRNA por 93% y 47% respectivamente (Fig. 4A & amp; 4C). Se obtuvieron resultados similares en Panc1 (Fig 4A & amp;. 4D) o SNU216 (datos no mostrados) las células. Por el contrario, la sobreexpresión de LAP2β aumentó FBS- y la invasión inducida por EGF de células SNU638 comparación con el control del vector por 725% y 1,223%, respectivamente (Fig 4B & amp;. 4E). Se obtuvieron resultados similares en Panc1 (Fig 4B & amp;. 4F). células
LAP2β Mejora metastásico Eficacia de células de cáncer gástrico en un modelo de xenoinjerto de metástasis de hígado
Reglamento de la motilidad de las células cancerosas por LAP2β sugirió la posibilidad de que LAP2β regula la metástasis de las células cancerosas in vivo. Para examinar esta posibilidad, inyectamos células de cáncer gástrico en el bazo de ratones desnudos y luego observó metástasis en el hígado. Curiosamente, la sobreexpresión de LAP2β aumentó la eficiencia y el tamaño de la metástasis del hígado (Fig. 5) y la mortalidad de los ratones ensayados. 67% de los ratones inyectados con células de cáncer gástrico que sobreexpresan LAP2β murió 8 semanas más tarde después de la inyección, mientras que todos los ratones de control inyectados con células de cáncer gástrico que expresan el vector de control sobrevivieron. En el examen histológico de los tejidos de xenoinjerto, se confirmó la sobreexpresión de LAP2β en el xenoinjerto derivados de los ratones inyectados con células que sobreexpresan LAP2β (Fig. 5).
Los cambios inducidos por LAP2β en la expresión de ARNm
para revelar el mecanismo subyacente de la motilidad regulado LAP2β, se realizó una micromatriz de ADNc (GEO número de acceso del NCBI: GSE31450). Aunque el nivel de ARNm de LAP2β se sobreexpresa en la línea celular estable alrededor de 1,7 veces, las de muchos genes fueron cambiados por la sobreexpresión (figura 2 & amp;. Tabla 1). Entre los genes cambiado significativamente por LAP2β, nos centramos en sustrato myristoylated rico en alanina C quinasa (MARCKS), transductor de señales y activador de la transcription3 (STAT3) y interleukin6 (IL6) debido a que estos genes se han reportado para regular la motilidad de las células. PCR en tiempo real para cada gen confirmó cambios significativos en los niveles de ARNm de cada gen (Fig. 6). La sobreexpresión de LAP2β aumentó los niveles de ARNm de MARCKS e IL6 comparación con el control de vectores en un 193% y 79%, respectivamente (Fig. 6). Además, el aumento se observaron expresiones de MARCKS, IL6 y STAT3 en el xenoinjerto procedentes de ratones inyectados con células que sobreexpresan LAP2β-(Fig. 5).
La expresión génica entre células de cáncer gástrico overepxressing gen o de control de vectores LAP2β se compararon por cDNA microarray. PCR en tiempo real se utilizó para confirmar el cambio inducido por LAP2β en la expresión génica de
MARCKS, STAT3 y la IL-6 Hoteles en SNU638 células. Los datos se representan como cambios veces en comparación con las células simuladas. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes por quintuplicado (* P & lt; 0,01, prueba t de Student).
Discusión
LAP2, una de las proteínas de dominio LEM, se ha descrito principalmente para jugar un papel estructural en la membrana nuclear y estar implicado en varios trastornos genéticos. Sin embargo, aquí se presenta por primera vez su expresión y papeles en diversos cánceres del tracto digestivo. En particular, se encontró que LAP2β puede controlar la motilidad de las células cancerosas, así como contribuir a la metástasis de las células cancerosas.
metástasis de las células de cáncer afecta en gran medida el pronóstico de los pacientes con cáncer. Varios resultados en el presente estudio apoyan que LAP2β regula la motilidad y la metástasis de las células cancerosas. En experimentos in vitro en la cámara de Boyden, heridas ensayos de curación y de invasión Matrigel, mostró que desmontables disminuyó mientras que la sobreexpresión de LAP2β aumentó la migración y la invasión de las células cancerosas (Fig 3 & Amp;. 4). Además, en el modelo de xenoinjerto, LAP2β mejora la metástasis de las células cancerosas (Fig. 5). Aunque las células transfectadas con el vector de control causados metástasis en el modelo de xenoinjerto, el efecto fue bastante ineficiente y lento. En contraste, las células sobreexpresados-LAP2β mostraron un comportamiento más agresivo en el xenoinjerto. Además, hemos encontrado sobreexpresión de LAP2 en células de cáncer metastásico de tejidos de pacientes (Fig. 1).
Cómo LAP2β pueden contribuir a la motilidad y la metástasis de las células cancerosas? Hemos encontrado varios genes que fueron inducidos por LAP2β en el cDNA microarray análisis (Tabla 1), que fue confirmado por PCR en tiempo real (Fig. 6) y la inmunohistoquímica en xenoinjerto (Fig. 5). Uno de ellos, la MARCKS, es responsable de la unión y entrecruzamiento de filamentos de actina directamente a la membrana [24]. La sobreexpresión de MARCKS se ha encontrado en diversos tipos de cáncer incluyendo el carcinoma hepatocelular [25], cáncer de páncreas [26], glioblastoma [27] y colangiocarcinoma [28]. Por otra parte, MARCKS juega un papel crítico en la invasión de EGFR inducida de células de glioblastoma [29]. Muchos otros estudios han demostrado la implicación de la MARCKS en la motilidad celular [30].
Otro gen candidato que media en la motilidad inducida por LAP2β es IL-6, que se produce principalmente durante la inflamación aguda y crónica. Las células cancerosas que están expuestos a la IL-6 o secretan citoquinas como el factor de un espectáculo autocrina aumentaron invasión [31], [32], [33]. Además, la inactivación de gp130, un transductor de IL-6 de señalización, reduce la agresividad de las células de cáncer de mama in vivo [34]. Varios genes relacionados con la vía de IL-6 señalización STAT3 incluyendo también están asociados con la migración y la invasión de las células del cáncer [35], [36], [37]. IL-6 se expresa ampliamente en muchos cánceres sólidos, incluyendo próstata [38], de mama [39], de pulmón [40] el cáncer, y glioblastoma [41].
¿Cómo puede regular la expresión génica LAP2β? proteínas LEM-dominio han demostrado ser capaces de regular la expresión génica mediante el secuestro reguladores transcripcionales a la lámina nuclear. Man1 se une a regulados por el receptor R-Smads y antagoniza la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF), activina y proteína morfogenética ósea (BMP) [42]. deficiencia de man1 conduce a defectos remodelación vascular embrionarias en ratones y desarrollo de los huesos en los seres humanos [16], [43]. Otro ejemplo es emerin de unión a beta-catenina, un objetivo corriente abajo de la señalización de Wnt, que promueve su salida del núcleo [44]. deficiencia Emerin conduce a la acumulación nuclear de β-catenina. LAP2β se ha demostrado que interactúan con HDAC3 y regular la actividad de E2F, p53 y NF-kB factores de transcripción [5], [45]. En estudios futuros, cómo LAP2β puede regular la MARCKS o IL-6 expresión de nuevas investigaciones.
La participación de LAP2β en la replicación fue sugerido por un estudio en el que trunca LAP2β alterada eficacia de la replicación del ADN [18]. La regulación de la replicación del ADN por LAP2β ha sugerido que está mediada por dos vías posibles. LAP2β puede reducir la actividad del complejo E2F solo o con células germinales menos (GCL) [46]. La otra vía es mediante la interacción con HA95 durante la fase G1 del ciclo celular [12]. Esta interacción con HA95 contribuye a la estabilidad de los complejos prereplication. En el presente estudio, desmontables de LAP2β no afectó a la proliferación de la mayoría de las células de cáncer del tracto digestivo, excepto las células de cáncer de páncreas (Fig. 2). Por otra parte, la sobreexpresión de LAP2β no provocó cambios significativos en la proliferación (Fig. 2), lo que sugiere la regulación de la proliferación por LAP2β en células de cáncer del tracto digestivo no es tan crítica.
sobreexpresión generalizada de LAP2 en varios cánceres del tracto digestivo se describe por primera vez en el presente estudio (Fig. 1). Expresión de LAP2β se ha descrito en varios tejidos normales, incluyendo piel, timo, pulmón, testículo y ovario. Sin embargo, su expresión en el tracto gastrointestinal normal se rara vez se detecta [47]. La sobreexpresión de LAP2β se informó en varias células malignas hematológicas y células de neuroblastoma [17], [48].