Extracto
Antecedentes
4β proteína transmembrana asociada a lisosoma
-35 (LAPTM4B-35), un miembro de la 4-tetratransmembrane mamíferos que abarca superfamilia de proteínas, se ha informado que se sobreexpresa en varios tipos de cáncer. Sin embargo se desconoce la expresión de LAPTM4B-35 y su papel en la progresión del cáncer gástrico (GC). El objetivo de este estudio fue investigar LAPTM4B-35 expresión en GC, su potencial relevancia de parámetros clínico y papel de LAPTM4B-35 durante la carcinogénesis gástrica.
Métodos
En el presente estudio, la parafina se analizaron muestras -embedded con GC (n = 240, incluyendo 180 muestras pareadas) y 24 pareadas tejidos frescos congelados. QRT-PCR e inmunohistoquímica (IHC) se utilizaron para analizar la expresión de LAPTM4B-35 en GC. Los efectos de LAPTM4B-35 sobre la proliferación celular GC, la migración y la invasión se determinaron mediante ensayos de sobreexpresión y desmontables.
Resultados
IHC mostraron que LAPTM4B-35 se expresó en el 68,3% (123/180 ) de los tejidos GC, mientras que en el 16,1% (29/180) de los tejidos gástricos no cancerosas adyacentes apareados (
P
= 0,000).
LAPTM4B-35
niveles de mRNA en tejidos GC también fueron significativamente elevados en comparación con sus tejidos no cancerosos adyacentes pareados (
P = 0.017)
. La sobreexpresión de LAPTM4B-35 se asoció significativamente con el grado de diferenciación, profundidad de la invasión, invasión linfovascular y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,05). Kaplan-Meier de supervivencia reveló que los pacientes con LAPTM4B-35 expresión tuvieron una disminución significativa en la supervivencia global (SG) en pacientes con cáncer gástrico etapas I-III (
P
= 0,006). El análisis multivariado mostró una elevada expresión de LAPTM4B-35 fue un factor pronóstico independiente de la SG en pacientes en estadio I-III GC (
P
= 0,025).
Conclusión
Estos hallazgos indican que LAPTM4B-35 sobreexpresión puede estar relacionado con la progresión de la GC y de mal pronóstico, y por lo tanto puede servir como un nuevo marcador de predicción de pronóstico en pacientes GC
Visto:. Cheng X, Z Zheng, Bu Z, Wu X , Zhang L, Xing X, et al. (2015) LAPTM4B-35, un gen relacionado con el cáncer, se asocia con un mal pronóstico en estadios TNM I-III pacientes con cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10.1371 /journal.pone.0121559
Editor Académico: Ken-ichi Mukaisho, Universidad de Ciencias Médicas de Shiga, Japón
Recibido: Abril 10, 2014; Aceptado: 12 de febrero de 2015; Publicado: 7 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30471677 y 81141024) y la clave Nacional de Tecnología I & amp; D Programa (Beijing Municipal de Ciencia y Tecnología. Proyecto Z121100007512010). Los donantes han contribuido al diseño del estudio, el rendimiento, reactivos, materiales, análisis de datos y la decisión de publicar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el tercer cáncer más común en china y la principal causa de muerte por cáncer en china [1]. La mayoría de los pacientes GC ya están en fase avanzada en el momento del diagnóstico (fase III y IV), haciendo que el pronóstico sea triste, a pesar de la mejora de enfoque de tratamiento quirúrgico y adyuvante [2-5]. Independientemente de la quimioterapia y la cirugía curativa destinada, casi el 60% de los pacientes con GC desarrollar recurrencia y finalmente mueren de la enfermedad metastásica [6]. progresión GC es un proceso multifactorial y de múltiples pasos en el que hereda y factores ambientales juegan un papel vital [7]. Las observaciones anteriores indican que los biomarcadores clásicos y sistemas de clasificación, basados en los hallazgos clínicos y patológicos, pueden tener sus limitaciones en las aplicaciones clínicas e impulsar el desarrollo de nuevos biomarcadores moleculares que pueden predecir el resultado y el tratamiento de los pacientes [8, 9].
lysosome asociada a la proteína transmembrana 4 beta (LAPTM4B) ha sido clonado originalmente en carcinomas hepatocelulares (HCC) por Shao et al, que se encuentra en el cromosoma 8q22, una región con frecuencia amplificado en cáncer de mama y HCC [10, 11]. Se codifica dos proteínas con diferente peso molecular, 24 kDa y 35 kDa proteínas (LAPTM4B-24 y -35) con cuatro regiones transmembrana putativo [12]. La localización de LAPTM4B-35 se encuentra no sólo en lisosomas, pero también en la membrana plasmática y orgánulos internos, tales como aparatos y endosomas [13] Golgi. Se ha informado de que LAPTM4B-35 se expresa ampliamente en diversos tipos de carcinoma. informes previos indicaron que la sobreexpresión de LAPTM4B-35 se asocia con comportamientos biológicos desfavorables y mal pronóstico en muchos tipos de cáncer, como el cáncer de mama [14], HCC [15-17], carcinoma de la vesícula biliar [18, 19], cáncer de colon [20] , carcinoma epitelial de ovario [21] y carcinoma endometrial [22]. También se ha informado de que la variación alélica de LAPTM4B se asoció con la susceptibilidad genética de GC [23]. Por otra parte, la sobreexpresión de LAPTM4B-35 por transfección de cDNA LAPTM4B promueve la proliferación celular, la migración, invasión en xenoinjertos de HCC en ratones desnudos e induce la resistencia a múltiples fármacos [24]. Desmontables de LAPTM4B de interferencia por ARN inversa invierte todas estas características fenotípicas malignas en HCC [24, 25].
Sin embargo, la expresión LAPTM4B-35, su adecuación a las características clínico-patológicas, y el papel biológico de LAPTM4B-35 en GC siguen sin estar claros. En el presente estudio, que tuvo como objetivo identificar LAPMT4B-35 expresión en GC y su posible relación con las características clínico-patológicas, y su significado pronóstico. Además, in vitro se realizaron ensayos funcionales para caracterizar los efectos biológicos de LAPTMEB-35 en la tumorigenicidad gástrico.
Materiales y Métodos
consentimiento informado Ética
Todos los pacientes habían firmado para la obtención de muestras de tejido, y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación clínica del hospital de cáncer de la Universidad de Pekín.
muestras de tejido gástrico humano
Un total de 240 (167 varones y 73 mujeres, edad 22-87 años, y la edad media era de 60 años) fijadas con formalina y embebidos en parafina tejidos GC, incluyendo 180 emparejados y emparejados cancerosos tejidos de la mucosa gástrica no cancerosas adyacentes, se obtuvieron de pacientes con cáncer gástrico sometidos a gastrectomía en el hospital de cáncer de la Universidad de Pekín a partir de enero de 2003 a diciembre 2011. La información clínica e histológica para cada caso también se recogerá de acuerdo con las directrices institucionales aprobadas. Los criterios de la UICC 1997-TNM se utilizaron para la clasificación de los cánceres gástricos. La duración mediana de seguimiento desde el momento del diagnóstico fue de 26,2 meses (rango, 2.4-119.0 meses). En total, 112 (46,7%) pacientes fallecieron en el período de seguimiento.
La inmunohistoquímica
Secciones de parafina (4 mM) fueron desparafinados y rehidratados en el xilema y el etanol. La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [16] utilizando-LAPTM4B-35 anticuerpo anti (1: 200) (regalado por Pro RL Zhou.). Como controles negativos, las secciones se procesaron tal como el mismo protocolo excepto que se incubaron durante la noche a 4 ° C en solución de bloqueo sin el anticuerpo primario.
La expresión de LAPTM4B-35 se evaluó por dos patólogos experimentados (Y sol y B Dong), que trabajó de forma independiente y fueron cegados a los resultados clínicos de los pacientes. Las discrepancias entre los observadores se encuentran en menos del 10% de las láminas examinadas, y se llegó a un consenso después de una revisión adicional. evaluación de la tinción se acaba de utilizar los métodos semicuantitativos para clasificar LAPTM4B-35 expresión como células inmunorreactivas manchadas negativos y positivos. La relación de positividad fue marcado como '' 0 "(& lt; células 10% positivas tumorales), '' 1" (10-50% de células tumorales positivas), y '' 2 "(& gt; células tumorales positivas 50%). La intensidad de la tinción se puntuó como '' 0 "(sin tinción o débilmente teñidas), '' 1" (tinción moderada), o '' 2 "(fuerte coloración). La suma de la puntuación de intensidad de la tinción y el porcentaje de puntuación se utilizó para definir los niveles de expresión LAPMT4B: 0-2, 3-4 y expresión negativa, expresión positiva (14). La expresión positiva sólo se evaluó por las secciones con área positiva al menos el 10% de los tumores.
Cultivo celular, LAPTM4B-35 plásmido de expresión y hCas9 /gRNA transfección
líneas celulares de cáncer gástrico (SGC- 7901, BGC-823, MGC-803, MKN-28 y AGS) se cultivaron en DMEM (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) y 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2. El
pcDNA3
.
0-AF
que contiene toda la ORF de la producción de la proteína LAPTM4B LAPTM4B-35 fue regalado por el Prof. Zhou RL [11]. La transfección se realizó con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. clones de células positivas se obtuvieron mediante la selección de antibióticos con G418 (Gibco, Grand Island, NY) a una concentración de 800 ng /ml.
hCas9 y gRNA vector se incorporaron a partir del Centro de Recursos de pez cebra China (CZRC). La longitud completa de Cas9 cDNA fue clonado en el vector linealizado y pXT7, y cubiertas de mRNA se sintetizó usando kits de síntesis de transcripción mMESSAGE mMACHINE de ARNm (Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.). El primer secuencias gRNA utilizados fueron: cebador directo, 5'-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ', y el cebador inverso: protocolo de 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3'.The fue seguido por el trabajo publicado anterior [26]. hCas9 mRNA (3 ng /l) y gRNA (0,2 ng /l) se cotransfectaron en células SGC-7901 realizado con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
aislamiento de ARN, cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa PCR (QRT-PCR)
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transcribió inversamente en cDNA utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real rápida ABI 7500 (Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.). β-actina se utilizó como control interno. Las secuencias de los cebadores utilizados se enumeran a continuación: LAPMT4B-35: cebador directo: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ', cebador inverso: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; β-actina: cebador directo: 5'-CCTGTGGCATCCACGAAACT 3 'cebador inverso: 5'-3 GAAGCATTTGCGGTGGACGAT'
La proliferación celular ensayo
La proliferación celular se midió por Cell Counting Kit-8. (CCK-8) (Dojindo, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un volumen de 100 pl de suspensión celular (3000 células por pocillo) se incubó en una placa de 96 pocillos (Costar, Corning, NY) durante 24, 48, 72, 96 hrs. 10μl de la solución de CCK-8 se añadió a cada pocillo y se incubó durante 3 horas a 37 ° C. Los valores de absorbancia de todos los pocillos se determinaron a continuación, a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en lector de microplacas (Bio-Rad, EE.UU.). El experimento se realizó por triplicado y se repitió dos veces.
cicatrización de heridas ensayo
La migración celular se midió mediante el ensayo de cicatrización de heridas por el sistema IncuCyte HD (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a la densidad de 6 x 10
4 células por pocillo. Herida se hace a través de células monocapa confluente con un bloque de pasadores y las células se lavaron con 1 x PBS, se cultivaron en medio DMEM con suero bovino fetal 10%. Las fotografías de las células fueron imágenes utilizando el sistema HD IncuCyte a intervalos de 4 horas a partir de 2 regiones separadas por pocillo usando un objetivo 10x. Los valores de 2 regiones de cada pocillo se agruparon y se promedian entre todos los 3 repeticiones
ensayos de invasión Transwell
El Transwell (tamaño de poro 8μm; Cell Biolabs, EE.UU.). Ensayo se utilizó para analizar la invasión de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 8 × 10
se colocaron 4 células en las cámaras superiores en medio libre de suero, y las cámaras inferiores se rellenaron con DMEM y 10% de FBS. Después de la incubación durante 72 horas a 37 ° C, las células no invasivas en la superficie superior de las membranas se eliminaron con un hisopo de algodón. Las membranas se fijaron con metanol durante 10 min y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 10 minutos. Las células en la parte inferior del filtro eran de se contaron cinco vistas microscópicas seleccionadas al azar.
análisis de transferencia de Western
Los niveles de expresión de proteínas de las líneas celulares de GC se midieron por análisis de Western Blot. Las células se lisaron en pre-refrigerada tampón de lisis RIPA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) que contiene cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Basilea, Suiza) durante 30 min después de la centrifugación a 15.000 g durante 20 min, se obtuvo el sobrenadante. 50? G de extractos de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida al 10%, y se transfirieron a la difluoruro 0.45μm de polivinilideno (PVDF) membrana (Whatman, Alemania). La membrana se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (pH 7,6) que contiene 5% de leche descremada en polvo, después se incubó con anti-LAPTM4B-35 anticuerpo (1: 800; Regalado por Prof. RL Zhou) a 4 ° C durante la noche . Mouse anti-humana de anticuerpos β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se aplicó como un control interno. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para comparar la diferencia en LAPTM4B-35 expresión de la proteína entre el GC tejidos y tejidos no cancerosos adyacentes. modelos de análisis de regresión logística incondicional se utilizaron para analizar las relaciones entre la expresión LAPTM4B-35 y clinicopathological parámetros ajustados por condición de género. La diferencia de
expresión LAPMT4B-35
ARNm entre GC y tejidos cancerosos adyacentes se analizó mediante la prueba de Wilcoxon par.
La supervivencia global (OS) curva se calculó con el método de Kaplan-Meier y se analizaron con la prueba de log-rank. Los riesgos relativos (RR) de muerte asociado con LAPTM4B-35 expresión y otras variables predictoras, estimados de los riesgos proporcionales de Cox univariante modelo en primer lugar. modelos multivariante de Cox también se construyeron para estimar el RR para la expresión LAPMT4B-35. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software paquete estadístico SPSS (versión 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Un
valor de p
a doble cara inferior a 0,05 se consideró como significación estadística.
Resultados
Análisis de la expresión de LAPTM4B-35 en líneas celulares de GC y GC
Se examinó en primer lugar la expresión de
LAPTM4B-35 fotos: por RT-PCR en 5 líneas de células GC (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 y AGS), y luego se detectó su la expresión de proteínas por transferencia Western. Los resultados mostraron que LAPTM4B-35 se expresó en todas las líneas celulares, tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Fig 1A, superior y el panel inferior), entonces se eligió BGC-823 y las células SGC-7901 para nuestros siguientes pruebas de la función celular.
(a) mRNA (panel superior) y de la proteína (panel inferior) expresión de LAPTM4B-35 en cinco líneas celulares de cáncer gástrico. (B) la expresión de mRNA relativa de
LAPTM4B-35
en el cáncer gástrico y sus tejidos no cancerosos adyacentes.
LAPTM4B-35
expresión también fue detectado en 24 pares resecado especímenes de GC de QRT-PCR. Como podemos ver en la figura 1B, el
LAPTM4B-35
expresión en tejidos GC fue significativamente elevado en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes pareados (
P = 0,017
) (Figura 1B).
LAPTM4B-35 expresión de la proteína se observó con frecuencia en GC
humanos
Hemos investigado la expresión de LAPTM4B-35 en GC y tejidos cancerosos adyacentes por medio de análisis inmunohistoquímico. LAPTM4B-35 no expresó en la mucosa gástrica normal (figura 2A), pero se expresa en la metaplasia intestinal, lesión displasia (datos no se muestra) y células tumorales, y localizada principalmente en el citoplasma o en la membrana celular (Fig 2B y 2D 2H). LAPTM4B-35 observa con frecuencia en los tejidos de GC en comparación con la mucosa no canceroso adyacente emparejado (68,3% vs. 16,1%,
P
= 0,000) (Tabla 1).
(A) LAPTM4B-35 era no se expresa en la mucosa de estómago normal. (B) LAPTM4B-35 se expresó en la lesión displasia. (C) LAPTM4B-35 tinción negativa en el tejido GC. (E-H) LAPTM4B-35 tinción positiva en los tejidos GC. Aumento original:. 100 ×
Relación entre LAPTM4B-35 expresión y las características clinicopatológicas
Se analizó la relación entre LAPTM4B-35 expresión y las características clínico-patológicas de los pacientes GC. A medida que el género, los objetos de nuestro estudio tiene su desviación (167 vs 73, Tabla 2), se calculó su relación mediante análisis de regresión logística y se adaptó al nivel de género. LAPTM4B-35 se observó con mayor frecuencia GC pobremente diferenciado en comparación con los moderados-bien diferenciados (65,4% vs. 57,9%,
P = 0,017
). Por otra parte, LAPTM4B-35 expresión se asoció con la invasión linfovascular (
P
= 0,000), la profundidad de la invasión (
P = 0,016
) y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P =
0,029) (Tabla 2).
LAPTM4B-35 expresión y el pronóstico de los pacientes GC
Fig 3 representa el análisis de LAPTM4B-35 expresión y los resultados clínicos. Kaplan-Meier de supervivencia mostraron que hubo una tendencia de menor supervivencia global (SG) en pacientes con GC-35 LAPTM4B expresión positiva en comparación con los negativos (
P = 0,064
, log-rank = 3,425) (Fig 3A). Después de los pacientes fueron estratificados por TNM I-III o pacientes sin invasión lypmphovascular, los pacientes con LAPTM4B-35 mostraron expresión positiva OS significativamente más cortos que los negativos (
P = 0,006
y
P = 0,001
, respectivamente) (figura 3B y 3D).
A, de Kaplan-Meier de supervivencia para la SG en pacientes con GC-35 LAPTM4B expresión positiva y negativa. (B, C, D) Las curvas de Kaplan-Meier para la OS en subgrupo de pacientes estratificados por GC TNM estadios I-III, IV y pacientes sin invasión linfovascular, respectivamente.
Los resultados de univariante y multivariante modelos de Cox para el sistema operativo de pacientes con cáncer gástrico en estadio TNM I-III mostraron que la profundidad de la invasión (RR = 3,103; IC del 95%: 1,427-6,748;
P
= 0,004), metástasis a los ganglios linfáticos (RR = 3,015, IC del 95%: 1,552-5,858;
P
= 0,001) y 35-LAPTM4B nivel de expresión (RR = 2.249 IC del 95%: 1,242-4,072;
P
= 0,007) afectado significativamente el supervivencia de GC, respectivamente (Tabla 3); Por otra parte, LAPTM4B-35 expresión positiva era un factor pronóstico independiente (RR = 1.897 IC, 95%: 1,041-3,457;
P
= 0,025). metástasis de ganglios linfáticos (RR = 2.665 IC, 95%: 1,362-5,213;
P
= 0,001) también predijeron de forma independiente del sistema operativo (Tabla 3) guía empresas
LAPTM4B-35 promueve las células tumorales. la proliferación
con el fin de investigar el efecto de LAPMT4B-35 en la función de la biología celular, se establecieron dos líneas celulares. células BGC-823 y SGC-7901 que presentan relativamente más baja o más alta expresión de LAPTM4B-35 fueron seleccionados por separado para la sobreexpresión y el ensayo de caída (figura 1A). En la primera línea, células BGC-823-AF-35 que sobreexpresan LAPTM4B de forma estable se estableció, y un prototipo fue utilizado como el control de esta línea celular. En segundo lugar, LAPTM4B-35 fue derribado de forma estable towarding al SGC-7901 (hCas9 /gRNA) por el II agrupados espaciadas regularmente cortas repeticiones palindrómicas sistema (CRISPR) tipo, y los resultados fueron identificados por Western blot (Figura 4A).
(a) expresión de LAPTM4B-35 en BGC-823 y SGC-7901 después de la transfección con el vector de expresión LAPTM4B y hCas9 /gRNA fueron identificados por Western-blot. BGC-823-AF muestra clon BGC-823 que sobreexpresan. curvas (B) Crecimiento determinados por CCK-8 ensayo. Panel izquierdo: la sobreexpresión de LAPTM4B-35 promueve un rápido aumento en la proliferación de células BGC-823 en comparación con el tipo salvaje y se burlan. El panel medio: desmontables de LAPTM4B-35 expresión inhibe la proliferación celular en comparación con el control y SGC-7901. Panel derecho: diverso estado proliferación de las células después de la incubación de 3 días para BGC-823 y 2 días para el SGC-7901. *
P Hotel & lt; 0,05, BGC-823-AF vs Mock, caída vs SGC-7901. Para todos los datos la media y desviación estándar representan la media de tres experimentos independientes.
ensayo de proliferación celular se midió por CCK-8 kit de recuento de células. El valor de la absorbancia de las células BGC-823-AF a las 72 horas después de la difusión fue significativamente mayor que aquellas células progenitoras y células Mock, y el resultado fue justo enfrente derribando de LAPTM4B-35 en las células SGC-7901 (Figura 4B).
LAPTM4B-35 mejorado migración de células tumorales y la capacidad de invasión
Después de la transfección con pcDNA3.0-AF y hCas9 /gRNA, se realizó un ensayo de cicatrización de heridas para analizar la capacidad de migración de LAPTM4B-35 sobre-expresión /desmontables células de cáncer gástrico (figura 5a). Los resultados mostraron que LAPTM4B-35 promovido BGC-823 (BGC-823-AF) la migración de células en comparación con BGC-823 y falsos (
P Hotel & lt; 0,05), y la baja regulación de la expresión LAPTM4B-35 podría revertir este fenómeno en las células SGC-7901 (
P Hotel & lt; 0,05, figura 5B)
(a) panel superior izquierdo:. ensayo de cicatrización de heridas de BGC-823-AF, se burlan y BGC-823; Panel inferior izquierdo: ensayo de cicatrización de heridas de hCas9 /gRNA, Control y SGC-7901. Las fotografías fueron capturadas por un microscopio de contraste de fase invertida a las 24 horas después de la herida. Aumento = 100 ×. (B) Cuantificación de las tasas de curación de heridas. Para todos los datos la media y desviación estándar representan la media de tres experimentos independientes.
De acuerdo con ello, el efecto de LAPTM4B-35 en la invasividad de las células tumorales se estudió usando el ensayo transwell (Fig 6A). Se encontró que el número célula invadida fue significativamente mayor en las células transfectadas BGC-823-LAPTM4B-35 y menor en las células SGC-7901 desmontables, que en sus células de control, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,05, Fig 6B). Estos resultados sugieren que LAPTM4B-35 promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico
(A), el panel superior izquierdo:. Transwell ensayo de BGC-823-AF, las células se burlan y BGC-823; Panel inferior izquierdo: transwell ensayo de hCas9 /gRNA, Control y SGC-7901. células invasoras fueron contados en campos microscópicos al azar 5 seleccionados. Aumento = 100 ×. (B) Cuantificación de la migración y las células invasoras. Para todos los datos la media y desviación estándar representan la media de tres experimentos independientes.
Discusión
GC es una enfermedad muy heterogénea donde incluso las características clínicas y patológicas similares conducen a resultados distintos [ ,,,0],27, 28], lo que indica que el sistema de estadificación TNM para GC tiene su limitación e impulsar la búsqueda de nuevos biomarcadores moleculares que pueden predecir el resultado y el tratamiento del paciente. El oncogén LAPTM4B-35 se localiza en el cromosoma 8q22, y el aumento del número de copias de ADN en el cromosoma 8q22 es un hallazgo frecuente en GC de acuerdo con nuestro estudio anterior (datos no publicados). En el cáncer de mama, la sobreexpresión de LAPTM4B-35 y 8q22 amplificación fueron contribuyó a
de Nove
quimio-resistencia a las antraciclinas y son permisivas para la recurrencia metastásica [29].
En este estudio, se investigó
LAPTM4B-35
expresión en el cáncer gástrico y 24 de sus pares no cancerosos especímenes quirúrgicos gástricos por QRT-PCR y encontró que
-35 LAPTM4B nivel de expresión de ARNm
en el cáncer gástrico fue significativamente elevado en comparación con la de la emparejado grupo de tejido no canceroso. Por otra parte, el análisis inmunohistoquímico de 180 pares de cáncer gástrico mostró LAPTM4B-35 se sobreexpresa en los tejidos GC (68,3%) en comparación con la mucosa no canceroso emparejado (16,1%). LAPTM4B-35 promueve el crecimiento tumoral y la tolerancia a estrés metabólico y genético a través de la inducción de la autofagia [30, 31]. En nuestro estudio, la función de LAPTM4B en el cáncer gástrico se investigó mediante ensayos in vitro. La sobreexpresión de LAPTM4B-35 en las células BGC-823 también aumentó la viabilidad celular en condiciones de cultivo libre de suero también. Si este fenómeno es causado por autophage que se necesita para ser investigado.
Por otra parte, también se analizó la correlación de LAPTM4B-35 expresión con parámetros clínico en cáncer gástrico. La expresión de alto LAPTM4B-35 se correlacionó significativamente con el grado de diferenciación, invasión linfovascular, la profundidad de la invasión y metástasis en los ganglios linfáticos, lo que sugiere que LAPTM4B-35 puede ser ampliamente activa en el cáncer gástrico y puede jugar un papel vital en la carcinogénesis gástrica y la progresión tumoral. A medida que la invasión linfovascular tumoral y la metástasis linfonodos son muy importantes indicadores de pronóstico clínicos de recidiva del tumor, se realizó un análisis de supervivencia. Las curvas de Kaplan-Meier estratificadas por LAPTM4B-35 expresión y el estadio del tumor o invasión linfovascular revelado que LAPTM4B-35 pacientes positivos tienen una SG significativamente más pobres en comparación con LAPTM4B-35 negativas en estadios TNM I-III o sin invasión linfovascular subgrupo. Análisis multivariado de regresión de Cox en este subgrupo demostró que entre todos los factores analizados, LAPTM4B-35 expresión es un factor pronóstico independiente en pacientes con cáncer gástrico en TNM estadios I-III, pero en la etapa IV. Es razonable porque los pacientes en estadio IV es incapaz de recibir operación radical y puede ser tratado con muchos otros diferentes tratamientos paliativos, todos los cuales impactarían en el pronóstico. Estos resultados indican que la propensión a la LAPTM4B-35 puede predice específicamente los tipos más agresivos y mortales de cáncer gástrico en los casos con principios y sin metástasis distal o sin invasión linfovascular.
En nuestro estudio, encontramos que LAPTM4B -35 expresión positiva en general correlacionado con un peor pronóstico en pacientes estratificados por GC estadio del tumor o invasión linfovascular. Para la función de LAPTM4B-35 en GC, se realizó adicionalmente en ensayo in vitro. La sobreexpresión de LAPTM4B-35 en las células BGS-823 reveló un aumento significativo en la proliferación celular, la migración y la invasión, y la baja regulación de LAPMT4B-35 con plomo a los resultados opuestos. Zhou et al. ha mostrado que LAPTM4B-35 sobreexpresión promueve la supervivencia celular, la proliferación y la migración desregulado en las células de HCC [12]. Estudios recientes han informado de que LAPTM4B-35 se asoció significativamente con un peor resultado clínico en muchos tumores malignos humanos, tales como HCC [16], tumor de ovario metastásico [32], la vesícula biliar [19, 33], colangiocarcinoma extrahepático [34] y el cáncer de endometrio [22]. Estas evidencias acumuladas apoyan nuestros hallazgos actuales, lo que indica que LAPTM4B-35 sobreexpresión puede desempeñar un papel importante en la transformación maligna y la progresión de GC.
Los mecanismos moleculares de LAPTM4B-35 en las propiedades de la progresión del tumor aún no están claros. Algunos estudios anteriores indicaron que se requiere LAPTM4B-35 para la homeostasis lisosoma, la acidificación y la función, y que LAPTM4B-35 hace que las células tumorales resistentes a la muerte celular mediada por lisosoma desencadenada por el estrés ambiental y genotóxicos [30, 31]. La sobreexpresión de LAPTM4B-35 podría activar algunos proto-oncogenes, tales como c-myc, c-jun y c-fos [35], y promover la proliferación, la migración y la invasión en algunas líneas de cáncer humano que mejorar el crecimiento y la metástasis de HCC xenoinjertos en ratones nude [36]. investigación relacionada a entender que LAPTM4B puede mejorar la proliferación celular o la supervivencia a través de la participación en la vía de transducción de señal, tal como la quinasa proteína de la ruta de fosfatidilinositol 3-quinasa B. Y LAPTM4B-35 puede interactuar con algunas proteínas relacionadas con el cáncer, como la proteína fosfatasa 2A y la proteína quinasa C [10]. Li et al encontraron que LAPTM4B-35 motiva resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas mediante la promoción de eflujo de fármaco y anti-apoptosis mediante la activación de PI3K /señalización [24] AKT, lo que indica que LAPTM4B-35 puede ser un nuevo objetivo de la terapia. El papel funcional y el mecanismo de LAPTM4B en GC necesitan más investigaciones.
En conclusión, este estudio indica que la sobreexpresión LPTM4B-35 juega un papel importante en la promoción de la proliferación celular, la migración y la invasión en el cáncer gástrico. LAPTM4B-35 expresión positiva en tejidos de cáncer gástrico correlaciona con el pobre resultado y demostró ser un factor pronóstico independiente en el subgrupo de pacientes GC en estadios TNM I-III o sin invasión linfovascular. Por lo tanto, LAPTM4B-35 puede constituir un biomarcador útil para predecir el pronóstico en cierto subgrupo de GC. Además, como las funciones de LAPTM4B-35 en la limitación de la muerte celular lisosoma mediada y la promoción de la autofagia tienen efectos de supervivencia importantes en las células cancerosas, y LAPTM4B-35 se sobre-expresa en una gran proporción de cáncer gástrico, podría ser un objetivo útil para el tratamiento del grupo subtipo de cáncer gástrico.
Apoyo a la Información
S1 conjunto de datos. Los resultados individuales de mRNA relativa de expresión LAPTM4B-35, la proliferación celular, la migración y la invasión, la supervivencia de pathients y clinicopathological features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)
Acknowledgments
We gracias Guoshuang Feng (desde el Centro Chino para el Control y Prevención de Enfermedades) por su amable ayuda en la estadística de datos.