Extracto
El cáncer de colon es la segunda causa más común de mortalidad por cáncer en el mundo occidental con metástasis comúnmente presentes en el momento del diagnóstico. La detección de la propagación y el comportamiento metastásico en un nuevo modelo de cáncer de colon quimérico ratón, impulsado por p53 mutante y β-catenina, llevado a la identificación de un adenocarcinoma único, invasivo. Comparación del genoma de este tumor, CB42, con genomas de tumores no propagar por matriz CGH y secuenciación reveló un amplicón en el cromosoma que contiene cinco CDK6 y CDK14, y una mutación KRAS, respectivamente. agente de inhibición de molécula pequeña individual de cualquiera de CDK6 o MEK, una quinasa aguas abajo de KRAS, llevó a la inhibición del crecimiento tumoral in vivo, mientras que la terapia de combinación no sólo condujo a la regresión de los tumores subcutáneos, pero también cerca de la inhibición completa de la metástasis de pulmón; Por lo tanto, el análisis genómico de este tumor condujo a un tratamiento eficaz, individualizado
Visto:. Zhou Y, Rideout WM III, Bressel A, Yalavarthi S, Zi T, Potz D, et al. (2014) espontáneas genómicas Las alteraciones en un modelo quimérico de cáncer colorrectal Habilitar Terapia metástasis y Guía Combinatoria eficaz. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10.1371 /journal.pone.0105886
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: April 9, 2014; Aceptado: July 24, 2014; Publicado: 27 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Este trabajo fue financiado en su totalidad por AVEO farmacéuticos. AVEO Pharmaceuticals es /era el patrono de todos los autores, excepto por Marcus Bosenberg. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue financiado en su totalidad por AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bosenberg fue un consultor pagado AVEO. Todos los demás autores son o bien los empleados actuales o anteriores de AVEO farmacéuticos. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cuatro tipos de tumores más comunes y letales que causan aproximadamente 53.000 muertes al año en los EE.UU. solamente. Afortunadamente, se están haciendo progresos contra la CRC ya que tanto la incidencia y la mortalidad por este tipo de tumor, han ido disminuyendo en los últimos diez años aproximadamente 2-3% por año. A pesar de este progreso general, la tasa de supervivencia de cinco años para el promedio de la etapa 4 de cáncer colorrectal metastásico sigue siendo un sombrío 12,5% [1]. Muchas alteraciones genéticas que contribuyen a la CRC se han identificado incluyendo mutaciones que inactivan los genes supresores de tumores (por ejemplo p53 y APC mutado en el 52% y el 76% de los tumores, respectivamente) o activan oncogenes (por ejemplo, KRAS y BRAF mutado en el 42% y el 10% de tumores, respectivamente) [2], [3]. Los pacientes en estadio 3 o 4 CRC necesitan tratamientos más efectivos y menos tóxicos para mejorar su supervivencia y calidad de vida. Como agentes terapéuticos más específicos estén disponibles, los ensayos clínicos han revelado que muchos de ellos son sólo moderadamente eficaz cuando se utiliza como agente único. Por el contrario, algunos muestran resultados significativamente mejores cuando se combina con quimioterapia existentes u otros fármacos dirigidos [4], [5]. Con el fin de detectar con mayor precisión combinaciones de fármacos para los que proporcionará el mayor beneficio, se necesitan modelos precisos y predictivos. modelos de ratones genéticamente manipulados de CRC se han desarrollado en las últimas dos décadas, principalmente por la inactivación de los genes supresores de tumores (por ejemplo APC1638N, [6] para revisión ver [7]). Existentes modelos preclínicos de caída CRC principalmente en cuatro categorías: establecido xenoinjertos de líneas celulares derivadas de pacientes, xenoinjertos (PDX), mediante ingeniería genética de la línea germinal modelos de ratón (GEMM) y Cre-Lox GEMM condicionales. Cada uno de los sistemas modelo tiene su propio conjunto de ventajas y desventajas con xenoinjertos de líneas celulares de ser el más fácil de realizar, pero más lejanamente relacionado con el tumor primario en el huésped, mientras que en el otro extremo del espectro de Cre-Lox activa GEMM surgen en el tejidos en un huésped inmunocompetente deseada.
La colección reciente y la propagación de los tumores directamente de los pacientes ha arrojado nuevos recursos PDX que mantienen una mayor heterogeneidad del tumor, tanto histológicamente como genéticamente [8]. Sin embargo, el establecimiento de tumores humanos en ratones inmunodeprimidos ejerce presión selectiva tanto en la adaptación a un host de ratón y por lo general a un sitio ectópico (es decir, subcutánea). Esto limita inherentemente la matriz de interacciones que se producen normalmente entre el tumor, el estroma y el sistema hematopoyético. En varios estudios de la eficacia de la propagación del material derivado del paciente en ratones inmunodeprimidos se ha mezclado, con los informes de hasta el 77% de los tumores de colon humanos muy avanzados que se propagan en ratones nude [9].
GEMMS superar muchas de las limitaciones de xenoinjertos. GEMM actuales de cáncer de colon se desarrollan tumores en un corto período de tiempo impulsado por mutaciones características en oncogenes y genes cruciales supresores de tumores (para revisión ver [7]). Algunos modelos de ratón de cáncer de colon existentes, que emplean las mutaciones RAS pertinentes, han proporcionado información sobre las posibles respuestas de drogas [10]. Nuestro enfoque para la creación GEMM implica un sistema que no es de la línea germinal, quimera de ratón con base con la que se han generado modelos complejos de cáncer, incluyendo modelos de pulmón y de mama [11], [12]. Nuestro enfoque de células madre de embriones permite la rápida generación de nuevos modelos inducibles doxiciclina con múltiples modificaciones genéticas sin tener que cruzar reproducen los alelos modificados juntos. Los tumores de estos sistemas modelo se han propagado como aloinjertos y utilizado para generar archivos de material tumoral permitiendo así el examen prospectivo de la respuesta al fármaco y la correlación de que la respuesta a las características del tumor [12], [13]. La caracterización molecular mediante microarrays y variedad de hibridación genómica comparada (aCGH) los análisis de este tipo de bibliotecas propagadas de tumores han demostrado que las mutaciones que promueven tumorales adicionales se habían producido en las líneas tumorales que afectan a su tasa de crecimiento, la metástasis, y la respuesta a la terapéutica [12], [13] , [14]. Si bien una serie de pantallas de expresión génica de biomarcadores son cada vez más útil para dirigir la terapia en ensayos clínicos en curso (por ejemplo, 21, 50, 70 candidatos, respectivamente, para Oncotype Dx, PAM50, y Mammaprint [15]) y la secuenciación de próxima generación de genes conocidos de cáncer (n = 236) está empezando a dirigir la selección beneficioso de la terapia para una amplia gama de tipos de tumores [16], el aumento de la asequibilidad del genoma amplia proyección de expresión, número de copias, y la secuencia puede proporcionar un enfoque imparcial para determinar un tratamiento eficaz del cáncer.
En este trabajo se describe el proceso de elaboración de un modelo basado en células ES de cáncer de colon impulsado por la mutación de p53, y activan inducible β-catenina (
CTNNB1
).
CTNNB1
mutaciones se encuentran en el 5% de CRC humano con y sin mutaciones correspondientes en
APC
[2], especialmente en el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) pacientes en los que la frecuencia de
CTNNB1
subidas de mutación [17]. Los tumores que surgen de estos modelos basados en células ES contienen idénticos antecedentes genéticos y mutaciones del conductor iniciales; Sin embargo, tienden a adquirir mutaciones de novo y variaciones del número de copia durante la tumorigénesis que crean la diversidad limitada que puede influir en la respuesta al tratamiento. La β-catenina (ΔN131) impulsada por el modelo que aquí presentamos generado nuevos conocimientos sobre las alteraciones genéticas necesarias para la propagación del tumor del ratón, la metástasis, y la respuesta a los fármacos.
Resultados
modelo de la quimera de colon a base de células ES
Hemos informado anteriormente de un nuevo enfoque para el desarrollo del cáncer de modelos en ratones usando quimeras de células ES. En comparación con los modelos transgénicos de línea germinal convencionales, una de las ventajas clave del enfoque quimérico es que permite que células que albergan mutaciones oncogénicas a coexisten con las células que son genéticamente de tipo salvaje vecino, mejor imitando el proceso oncogénico en los cánceres humanos. Supresión de APC, un supresor tumoral conocido, es un evento clave en la progresión del cáncer de colon. La inactivación de los resultados de APC en niveles elevados β-catenina nuclear, que evita la diferenciación terminal y promueve la proliferación. Para generar modelos de colon líneas celulares embrionarias, empezamos con una línea de +/- Ink4a (H12C23) y de forma secuencial modificamos los dos alelos de p53: el primer alelo p53 se condicionó mediante la inserción de sitios loxP que flanquean los exones 2 a 7, que pasa de un alelo funcional a un alelo nulo tras la recombinación mediada por Cre; el segundo alelo p53 tiene un cassette lox-stop-lox insertado en el intrón 1 combinada con la mutación R172H en el exón 5 que resulta en la expresión de una versión oncogénica de p53 después de la eliminación mediada por Cre del casete de parada. A continuación, una GAPDH-lox-Stop-lox-rtTA-IRES-luciferasa casete (el activador /cassette marcador) fue construido, que, cuando es activado por Cre, expresa rtTA (inversa tetraciclina trans-activador) y de luciferasa de forma simultánea. Por último, las células ES fueron co-transfectadas con construcciones para GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-luciferasa, Villin-Cre y TetO-β-catenina (ΔN131), una versión truncada de β-catenina que carece de la región que se une el complejo APC /AXIN y constitutivamente acumula en el núcleo. En las células epiteliales gastrointestinales no de quimeras resultantes, el promotor Villin será silencioso y por lo tanto Cre no se expresará. En este caso, un alelo p53 sigue siendo de tipo salvaje y el casete rtTA activador es inactiva (Fig. 1 de células ES). En las células diana en el epitelio intestinal donde promotor Villin conduce la expresión de Cre, solamente p53 mutante se expresará y el cassette activador expresará rtTA y luciferasa y por lo tanto, β-catenina (ΔN131) expresión puede ser inducida específicamente en estas células por la doxiciclina (Fig . 1 GI célula y GI + DOX).
A). En células madre embrionarias: se insertaron 3 casetes transgénicos: Villin-Cre, GAPDH-LOX-stop-LOX-rtTA-IRES-luciferasa y β-TetO- CateninΔN131; los tres permanecen en silencio en células madre embrionarias. Además, un alelo p53 se floxed y expresa p53 de tipo salvaje en células madre embrionarias y el otro alelo se dirige con lox-stop-lox y punto de mutación R172H, que es funcionalmente nula en células ES. SEGUNDO). En el epitelio gastrointestinal, la expresión de Cre conduce a la supresión de las dos casetes lox-stop-lox, así como el alelo p53 floxed. la expresión de p53 cambiará de tipo salvaje a la forma mutante, y la expresión de rtTA y luciferasa se enciende. DO). en presencia de doxiciclina, rtTA se unirá al promotor TetO y activar la transcripción de β-CateninΔN131.
clones Twenty ES positivos para todos los cinco elementos genéticos se inyectaron en blastocistos para generar quimeras, que fueron dadas 2500 ppm de alimentos doxiciclina después del destete. Después de la inducción durante 2-4 semanas, para cada línea de ES, 2-3 quimeras con & gt; 80% quimerismo por el color del pelaje fueron sacrificados y los tejidos se obtuvieron de 3 regiones diferentes del tracto intestinal. Se analizó la expresión de Cre, rtTA, y β-catenina por QRT-PCR y recombinación de los alelos de p53 y el cassette activador por PCR. Estos análisis identificaron 5 validados genéticamente y funcionalmente líneas embrionarias (91A2, 91C5, 91D3, 91F5 y 91F7) para su posterior estudio (datos no mostrados).
inducción de β-catenina en el epitelio del colon conduce a adenocarcinomas invasivos
ciento veinte y nueve ratones quiméricos se generaron utilizando las líneas de células madre embrionarias modelo validado 5 de colon y se alimentaron con comida doxiciclina después del destete. Después de 3 meses de inducción, hacen pruebas de sangre oculta en una base mensual y los ratones positivos durante 2 meses consecutivos fueron controlados diariamente y se sacrificaron cuando se observó la pérdida de peso. El tracto intestinal se diseccionó en sentido longitudinal, se aclararon en PBS para eliminar las heces, luego aplanado sobre una toalla de papel y escaneado con un estereoscopio de pólipos y tumores.
cuarenta y cuatro por ciento de los ratones quiméricos inducida con doxiciclina desarrollaron lesiones neoplásicas intestinales dentro de 3-17 meses con una latencia tumoral medio de 11 meses (Fig. 2B, y en la Tabla 1). bioluminiscente de imágenes demostró un aumento en la actividad de la luciferasa en la región inferior del abdomen de los ratones portadores de tumor (Fig. 2A). En estos ratones, se identificaron en 2-3 lesiones neoplásicas promedio por ratón; análisis histológico confirmó 60% de las lesiones como pólipos, 25% como adenomas y 15% como adenocarcinomas (Fig. 2C). Curiosamente, se encontró que las lesiones tempranas (pólipos y adenomas) por igual tanto en el tracto intestinal superior e inferior, mientras que la gran mayoría (85%) de las lesiones avanzadas se encontraron en el colon. Los adenocarcinomas oscilaron 2-8 mm de diámetro y se parecían a los tumores de colon humanos histológicamente. se observó invasión en la capa sub-mucosa en 70% de los adenocarcinomas (Fig. 2C). Estos resultados demostraron que nuclear β-catenina, en combinación con la mutación de p53, fue suficiente para impulsar el desarrollo de un tumor maligno en el tracto GI.
A). bioluminiscente de imágenes de tres ratones quiméricos después de tres meses de inducción doxiciclina. señales luminiscentes se detectaron en la región abdominal inferior en dos ratones. SEGUNDO). curva de Kaplan-Meyer que muestra la latencia del desarrollo de tumores de colon en ratones quiméricos. DO). comparación histológica de las vías normales gastrointestinal, pólipos benignos, y el adenocarcinoma de ratones quiméricos. RE). tinción colorimétrica química de mucina y la tinción inmunohistoquímica de β-catenina, Ki-67, y la ciclina D1 en el epitelio normal de GI, pólipos y adenocarcinoma
tumores de colon. Caracterización molecular de β-catenina impulsadas
Análisis por inmunohistoquímica de proteínas candidatas en los tumores primarios accionadas-catenina β indica la activación de varias vías conocidas por jugar un papel en la tumorigénesis de colon. Las formas normales de colon epitelio bien organizado unidades de las criptas-vellosidades (Fig. 2C), con células progenitoras en división situadas en la región de cripta y las células que no se dividen diferenciadas en la vellosidad como lo demuestra la restricción de Ki-67 y la ciclina D1 células positivas a la cripta. Si bien se detecta membranosa β-catenina en todas las células epiteliales, nuclear β-catenina se encuentra sólo en el 20-30% de las células dentro de la cripta (Fig. 2D). En contraste, la estructura normal cripta-vellosidad se perdió en ambos pólipos y adenocarcinomas invasivos. tinción de ß-catenina ya no se limita a la membrana; en lugar de 80-90% de las células mostró citoplásmica y nuclear positividad β-catenina. El 60-80% de las células tumorales mostraron una fuerte tinción Ki-67 y la positividad de ciclina D1, lo que demuestra que las células tumorales estaban proliferando activamente. Además, aunque se detectó una fuerte tinción positiva para epitelial mucina en el 20-40% de las células en todos los pólipos benignos estudiados, en consonancia con su origen epitelial del colon, mucina no fue detectado en los adenocarcinomas examinados (Fig. 2D). Una fracción de los adenocarcinomas también mostró más de expresión de EGFR (datos no presentados).
propagación en serie de tumores de colon
El tiempo de latencia de este modelo, junto con el desarrollo de tumores asíncrono, presentó una obstáculo para cumplir eficazmente con los estudios preclínicos terapéuticos de una manera estadísticamente significativa. Para superar ese problema, hemos explorado formas de ampliar el material tumoral obtenida de este modelo a través de serie en la propagación in vivo. Hasta el momento, los informes de la propagación de tumor de colon de ratón han estado ausentes de la literatura. Hemos probado la propagación in vivo en 3 cepas diferentes de ratones inmunodeficientes (SCID, NOD-SCID y desnudos) en 3 sitios diferentes (espacio subcutáneo, la cápsula renal y espacio cecal sub-mucosa) (véase el cuadro S1 para más detalles) de cualquiera de tumor fragmentos o suspensiones de células individuales embebidos en Matrigel. Propagación de material tumoral de 82 tumores se puso a prueba en un total de 107 sitios. De los tumores analizados, sólo uno establecido con éxito una línea tumoral propagado, CB42, que surgió en el ciego de un ratón quimérico de la línea ES 91C5 (Tabla 2 y Tabla S1).
CB42 creció robustamente tanto en la cápsula renal y el espacio subcutáneo; por ejemplo, cuando se inyectaron 10
5 células por sitio, los tumores se hicieron visibles en 5-7 días y alcanzan los límites humanas dentro de otras 2 semanas. El análisis histológico mostró que la arquitectura de los tumores propagadas ya sea en cápsula renal o el espacio subcutáneo se parecía a la del tumor primario (Fig. 3A, B y los datos no presentados). Los tumores propagadas retenidos mayor que 80% de células que muestran expresión de β-catenina citoplásmica y nuclear (Fig. 3C) y se mantienen sus características epiteliales como se evidencia por la tinción IHC homogénea para citoqueratina pan (Fig. 3D) y E-cadherina (datos no mostrados ). Tinción inmunohistoquímica para HGF fue positiva en 70 a 80% de estas células tumorales, y la tinción de fosfo-MET reveló una alta expresión de MET y la activación, pero curiosamente no positividad EGFR (Fig. 3C-F y los datos no se muestran) como se observa comúnmente en humanos CRC [18] y otros tumores primarios del modelo B-catenina de colon ES-quimera
A) Histología (H & amp;. tinción e) de CB42 tumor primario. SEGUNDO). Histología (H & amp; E) de CB42 después de la propagación por vía subcutánea (CB42P1). DO). La tinción inmunohistoquímica de β-catenina. RE). La tinción inmunohistoquímica para citoqueratina sartén. MI). La tinción inmunohistoquímica para el HGF. F). La tinción inmunohistoquímica para la fosfo-Met.
línea tumoral CB42 metástasis en hígado y pulmón
La metástasis se presenta el verdadero reto terapéutico en el CCR. Para validar nuestro modelo CB42 se estudió su potencial metastásico. Nos primero a cabo ensayos de 2 de siembra: siembra de las células tumorales en el pulmón a través de la inyección intravenosa o en el hígado a través de la inyección intraesplénica seguido de la esplenectomía. Las tasas de éxito para los dos ensayos de siembra fueron altas: en el ensayo de pulmón, 10 de los 10 ratones desarrollaron tumores dentro de 4-6 semanas después de la inyección resulta en aumento de los pesos pulmonares promedio de estos ratones a 1,5 g (frente a los 0,2 g de pulmón normal) ; en el ensayo de hígado, 7 de cada 10 ratones desarrollaron nódulos tumorales visibles en el hígado 5-8 semanas después de la inyección. Una segunda serie de experimentos de metástasis recapitula más de cerca el proceso de metástasis en pacientes humanos con cáncer. Las células tumorales se inyectaron primero en el espacio subcutáneo. Una vez que los tumores inoculados alcanzaron 500-800 mm
3 en tamaño, les extirpados quirúrgicamente y monitoreado de cerca los ratones de aspecto saludable en general y pérdida de peso, una indicación de metástasis a órganos internos. Ocho de 10 ratones no presentaron ningún signo de nuevo crecimiento del tumor subcutáneo y 2 tenía sólo un pequeño nódulo (& lt; 200 mm
3) en el sitio quirúrgico. Sin embargo, los 10 ratones se enfermaron dentro de 3-5 semanas después de la cirugía. La necropsia reveló metástasis al pulmón en los 10 ratones y distante metástasis de ganglios linfáticos en 6 de los 10 ratones. el examen histológico cuidadoso de otros órganos internos incluyendo el cerebro, el hígado, el bazo y el riñón no reveló ninguna nódulos tumorales (datos no mostrados). Las metástasis en el pulmón y en los ganglios linfáticos histológicamente se parecía al tumor primario, y fueron positivas para citoqueratina tinción bandeja (Fig. 4). No estaba claro, sin embargo, a partir de este experimento, si la cirugía fue causalmente ligada a la difusión de las células tumorales a órganos distantes, o simplemente permitió que los tumores diseminados más tiempo para crecer en el órgano distante al prolongar la vida de estos ratones. Para distinguir estas dos posibilidades, se repitió el experimento sin la extirpación quirúrgica del tumor subcutáneo. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores subcutáneos llegaron a alcanzar límites humanos y examinadas cuidadosamente por signos de metástasis. Pequeños nódulos blanquecinos se encuentran en los pulmones de los ratones 5/10 y 2 de estos ratones tenían ganglios linfáticos hinchados auxiliares cerca del cuello. Este experimento demostró que era competente para CB42 metástasis espontánea
Las metástasis pulmonares H & amp; E a 5X (A) y 20X (C) aumento del objetivo; metástasis de ganglios linfáticos H & amp; E a 5X (B) y 20X (D) aumento del objetivo; inmunohistoquímica pan-citoqueratina de pulmón (E) y los ganglios linfáticos (F) metástasis.
espontáneas de copias de genes alteraciones en el número de CB42
Desde CB42 era único entre nuestros dos puntos impulsada por β-catenina tumores en su capacidad para propagar y hacer metástasis, se realizó una serie de ensayos genómicos imparciales incluyendo la hibridación genómica comparativa dispuestos (aCGH) y la secuenciación genómica para identificar alteraciones espontáneas que se correlacionaban con la propagación y la metástasis. ADN genómico aislado de CB42 primaria y subcutánea, propagado en serie (paso 3, etiquetado como CB42P3) muestras de tumor junto con el ADN de otras 7 tumores primarios que no se propagan fueron elegidos para la comparación por aCGH. Análisis de los datos aCGH reveló múltiples amplicones que estaban presentes en sólo el subcutánea propagado tumores CB42 (CB42P3), pero no el tumor primario CB42, ni ninguno de los otros tumores primarios de colon (Fig. 5A).
A ). aCGH perfil de CB42 tumor primario y el paso 3 propaga tumor. Se ha detectado una amplificación de 3,5 Mb en el cromosoma 5 sólo en el tumor se propaga. Las sondas para Cdk6 fueron coloreadas en amarillo y sondas para Cdk14 fueron coloreadas en azul. SEGUNDO). análisis de RT-PCR para la expresión de 7 genes en el cromosoma 5 amplicón. Los valores de expresión relativos de los tumores CB42P4 (n = 4) se normalizaron a los de epitelio cecal normal (n = 4). DO). análisis de Western Blot para los niveles de Cdk4 y CDK6 en CB42 y 4 líneas celulares de cáncer de colon humano. RE). Frecuencia de amplificación y CDK6 CDK14 en muestras humanas de cáncer de 13 tipos de tejidos. Los datos fueron recuperados desde el sitio web CBio.
El amplicón más destacada fue una región de 3.5 Mbps en el cromosoma 5, entre Cdk6 y Steap1 que contiene más de 25 genes conocidos. Hemos examinado por QRT-PCR la expresión de 7 genes candidatos dentro del amplicón y descubrimos que 3 de los 7 genes se sobreexpresa significativamente en comparación con el epitelio del tracto GI normales: Cdk6, Cdk14 (Pftk1) y Fzd1 (figura 5B.). El análisis de transferencia Western de CB42 y varias líneas de xenoinjerto de tumor de colon humano confirmó la alta expresión de CDK6 en CB42 y SW620 y CDK6 detectable en HCT116 y HCC2998 que indica que la activación de CDK6 puede ser ventajoso para xenoinjertos de tumores humanos (Fig. 5C). El análisis de la base de datos del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) encontró pruebas para la amplificación de la región syntenic en el genoma humano y reveló que, si bien la amplificación de la región era poco común en CRC humana, que se elevan hasta el 11% de los tumores gástricos (Fig. 5D) .
Las mutaciones identificadas por secuenciación del genoma
Además de copiar los cambios de numeración, se analizó el ADN de los tumores CB42P3 propagadas por los cambios mutacionales por todo el genoma, exoma, y la secuencia de ARN que se identificaron mutaciones en 9 consistentemente regiones de exón (Tabla 3). Una de las mutaciones provocó un cambio de glicina a la cisteína en la posición de codón 12 del gen KRAS. La posterior piro-secuenciación de ADN de primaria y propagada CB42, así como otros 10 tumores primarios de colon confirmaron la mutación KRAS sólo en CB42 propagado, pero no se encontraron mutaciones de KRAS en cualquiera de las otras muestras, lo que sugiere que la activación de KRAS no era necesario para la iniciación del tumor de colon primario en el modelo de CRC, pero fue requerido para el crecimiento maligno del tumor durante la propagación y la metástasis.
crecimiento y metástasis del CB42 es Met /HGF vía independiente
Dado que la expresión de MET y la activación se elevan durante la propagada CB42 (Fig. 3F) y el papel de MET en la invasión y la metástasis está bien apoyado en la literatura [19], [20], [21], hemos probado si la vía MET podría desempeñar un papel importante en la proliferación y la metástasis CB42. Para probar esta hipótesis, se llevó a cabo una serie de 3 experimentos. En el primer experimento, se trataron ratones implantados con tumores subcutáneos CB42 con crizotinib (50 mg /kg po a diario), un inhibidor de molécula pequeña de MET y ALK. Sorprendentemente, a pesar del alto nivel de expresión de MET y la activación, el tratamiento de CB42 con crizotinib no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor (TGI = 0%, Fig. 6A). En el segundo experimento, se estudió si el crizotinib, podría inhibir la metástasis CB42. CB42 células tumorales se inyectaron por vía subcutánea y los tumores primarios fueron retirados quirúrgicamente después de 14 días, cuando el tamaño medio de tumor alcanzó 500 mm
3. Estos ratones fueron cohorted en un grupo del vehículo (n = 10) y un grupo de tratamiento (n = 10), y el tratamiento comenzaron el segundo día después de la cirugía. Los ratones de ambos grupos comenzaron a enfermar 2-3 semanas después de la cirugía. Cuando se sacrificaron, las metástasis pulmonares se encontraron en 9/9 ratones en el grupo de vehículo y 10/10 ratones en el grupo tratado crizotinib, mientras que la metástasis de ganglio linfático se observó en 2 ratones de cada grupo. No se observó diferencia significativa en el número o el tamaño de las metástasis entre grupos de tratamiento, lo que sugiere que la inhibición de MET no influir en el crecimiento metastásico después del establecimiento de los tumores metastásicos distantes.
A). crizotinib inhibidor de MET no inhibió el crecimiento del tumor CB42. SEGUNDO). CDK4 /6 inhibidor PD0332991 crecimiento significativamente inhibido tumor CB42 (*** P & lt; 0,001). DO). /2 inhibidor PD0325901 completamente bloqueado crecimiento MEK1 tumor CB42 (*** P & lt; 0,001). RE). Combinación de CDK4 /6 y /2 inducida inhibidor CB 42 regresión del tumor MEK1 (**** P & lt; 0,0001). MI). volúmenes de los tumores subcutáneos de los tres brazos de tratamiento al final del estudio. La combinación es significativamente más potente que la CDK4 inhibidor /6 solas (**** P & lt; 0,0001) o de la MEK inhibidor solo (*** P & lt; 0,001). F). El examen macroscópico de los lóbulos pulmonares de nódulos metastásicos reveló que tanto CDK4 /6 inhibidor y MEK inhibidor de la metástasis, inhibió la CB42 de pulmón (* P & lt; 0,05), pero la combinación fue significativamente más eficaz que cualquier agente solo (**** P & lt; 0,0001) y casi completamente eliminado la metástasis de pulmón.
En el tercer experimento, hemos probado si la inhibición TEM pudo evitar la diseminación de las células tumorales de pequeños sitios de tumor primario. En este experimento, la dosificación con vehículo o crizotinib comenzó dos días después de la inyección subcutánea de células CB42 en ratones receptores. Los tumores subcutáneos se extirpan quirúrgicamente dos semanas más tarde y la dosificación continuaron hasta que los ratones se enfermó. Las metástasis pulmonares se observaron en todos los ratones, independientemente de si recibieron crizotinib o vehículo. Sobre la base de estos experimentos, se concluyó que el trato de economía no era necesaria para el crecimiento tumoral y la metástasis CB42.
inhibición significativa del crecimiento tumoral metastásico subcutáneo y por la inhibición de CDK4 /6 o MEK
Desde propagado tenía CB42 una amplificación genómica de CDK6 y fuerte expresión celular (véase más arriba), se probaron un compuesto, PD0332991, que inhibe tanto la CDK4 y CDK6 [22]. A pesar de la confirmación por Western blot que mostró una fuerte CDK6 y expresión de CDK4 más débil en CB42 (Fig. 5C), una de 3 días en el ensayo de proliferación in vitro mostraron que PD0332991 no inhibió la proliferación de una línea celular derivada-CB42 incluso a la dosis más alta (10 M) (datos no mostrados). En contraste, el tratamiento de ratones implantados con tumores subcutáneos CB42 con PD0332991 (125 mg /kg, po) qd crecimiento inhibió subcutánea tumor (TGI-75%, p & lt; 0.00005, Fig 6B.) Y la reducción de la metástasis de pulmón. Al final del experimento, sólo cinco de los 15 ratones tratados con PD0332991 tenido nódulos visibles en el pulmón mientras que todos los 15 ratones en los grupos de vehículo tenía metástasis pulmonares visibles. Hubo un promedio de nódulos pulmonares 5 por ratón en el grupo PD0332991 frente a 18,3 en el grupo del vehículo (p = 0,00002). En general, estos resultados sugieren que la sobreexpresión CDK6 permite tumores gastrointestinales ratón para crecer fuera del entorno del colon sub-mucosa y que la activación de CDK6 podrían contribuir a tumores gastrointestinales sobrevivir y prosperar en un entorno metastásico
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Desde CB42 también había adquirido una la activación de la mutación de Kras y la literatura sugieren que los tumores KRAS mutantes fueron sensibles a los inhibidores de MEK [23], el PD0325901 inhibidor de MEK se probó por su capacidad para inhibir el crecimiento de CB42 in vitro e in vivo. de inhibición de MEK bloques de señalización corriente abajo del gen KRAS. In vitro, PD0325901 potentemente bloqueado Erk1 /2 de señalización en las células CB42 (datos no mostrados). In vivo, una dosis única de PD0325901, ya sea a 5 mg /kg, o 15 mg /kg, dio como resultado la inhibición completa de Erk1 /2 fosforilación 4 horas después de la dosificación (datos no mostrados). El tratamiento con PD0325901 de tumores subcutáneos en ratones CB42, en cualquiera de 5 mg /kg o 15 mg /kg, conducen a una inhibición casi completa del crecimiento del tumor (93% y 96% deltaTGI, respectivamente, Fig. 6C). Escaneado de los pulmones al final de estudio también demostró una reducción significativa del número y tamaño de los nódulos metastásicos en los ratones tratados en comparación con el grupo vehículo. Estos datos demostraron que el crecimiento y la metástasis de CB42 como un aloinjerto subcutánea también fue fuertemente dependiente de la mutación KRAS.
Regresión de CB42 por la inhibición combinada de la señalización de KRAS /MEK y CDK4 /6
las lesiones genéticas múltiples identificados en CB42 sugirieron que el máximo efecto terapéutico puede lograrse con una combinación de agentes dirigidos que inhiben varias de las vías dysregulated. Para probar esta hipótesis, se trataron con el CB42 PD0325901 inhibidor de MEK (5 mg /kg) en combinación con la CDK4 /6 PD0332991 inhibidor (125 mg /kg). La combinación de estos dos fármacos fue bien tolerado y no resultó en la pérdida de peso significativa (& lt; 10%) (datos no mostrados). El tratamiento combinado con PD0332991 y PD325901 hizo retroceder drásticamente los tumores en un promedio del 35% (Fig. 6D), mientras que los brazos de tratamiento con un único agente de nuevo mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con los controles. La comparación de los tamaños de los tumores representados individualmente entre los tres grupos de tratamiento al final del estudio ilustra cómo una regresión significativa del tumor y uniforme estaba en el grupo de combinación (Fig. 6E). También al final de estudio, los pulmones fueron disecados y examinados para nódulos metastásicos observables. Menos metástasis se observaron en ambos grupos de tratamiento con un único agente (hasta de 5 nódulos /ratón en comparación con 15 nódulos /ratón en el grupo de control de vehículo), mientras que en particular, el grupo de combinación promedio de menos de un nódulo por ratón (Fig. 6F). Así, por CB42, ambas lesiones genéticos adquiridos contribuyeron al crecimiento de tumor subcutáneo así como el crecimiento metastásico de tumores potencial y /o metástasis.
expresión forzada de CDK6 y CDK14 dio lugar a tumores de colon propagables
Aunque existe alguna evidencia de que tanto la literatura CDK6 [24], [25] y CDK14 [26], [27] están involucrados en diversos aspectos de la tumorigénesis, sus posibles funciones en la tumorigénesis de colon actualmente no están bien comprendidos. Nos aprovechamos de la flexibilidad del enfoque ES modelo quimera y añadió doxiciclina-inducible casetes de expresión de CDK14 solo o en combinación con CDK6 y Fzd1 al modelo de colon línea ES originales 91C5 para establecer nuevas líneas de modelo.