Extracto
Aplicaciones
La radioterapia para el cáncer de vejiga invasivo permite la preservación de órganos pero la toxicidad y el control local siguen siendo problemáticas. Como tal, la mejora de la eficacia del tratamiento requiere de radiosensibilización de células tumorales. El objetivo del estudio es investigar si el objetivo de la rapamicina (mTOR), una quinasa aguas abajo de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) vía de supervivencia /AKT, puede ser un objetivo de sensibilización a la radiación.
Diseño Experimental
ensayos por clonación se realizaron utilizando líneas celulares de cáncer de vejiga (6 UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV, y 253-JP) con el fin de examinar los efectos de las radiaciones ionizantes ( IR) solo y en combinación con RAD001, un inhibidor de mTOR. Análisis del ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo.
In vivo
, los ratones atímicos se les inyectaron por vía subcutánea con 2 líneas celulares de cáncer de vejiga. La respuesta al tratamiento con RAD001 (1,5 mg /kg, diariamente), IR fraccionada (en total 9 Gy = 3Gy × 3), y la combinación de RAD001 y IR fue seguido de más de 4 semanas. El peso del tumor se midió al final del estudio experimental.
Resultados
ensayos clonogénicos revelaron que en probaron todas las líneas celulares de vejiga, se observó un efecto aditivo en el tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. Nuestros datos indican que este efecto es debido a un paro en ambas fases G1 y G2 del ciclo celular cuando se combinan tratamientos. Además, nuestros datos muestran que esta detención está regulado principalmente por cambios en los niveles de ciclina D1, p27 y p21 después de los tratamientos.
In vivo
, se observó una disminución significativa en el peso del tumor en el tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los tratamientos solos o control.
Conclusiones
La alteración del ciclo celular mediante la inhibición de la señalización mTOR vía en combinación con la radiación tiene resultados favorables y es una modalidad terapéutica prometedora para el cáncer de vejiga
Visto:. Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, F Cury, Kassouf W (2013) combinación de mTOR inhibición con radiación Mejora antitumoral La actividad en las células del cáncer de vejiga
in vitro
y
en Vivo
: Una nueva estrategia para el tratamiento. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10.1371 /journal.pone.0065257
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 24 Febrero, 2013; Aceptado: April 24, 2013; Publicado: 17 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Nassim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto está siendo financiado por una subvención del Instituto canadiense de investigación en Salud (CIHR) MOP subvención 89796. el Dr. W. Kassouf es un receptor de un premio becario de investigación clínica del Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El inhibidor de mTOR RAD001 fue proporcionado amablemente por su fabricante, Novartis. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer de vejiga es una enfermedad muy frecuente en Norteamérica. En 2012, 55.000 hombres y 18.000 mujeres fueron diagnosticadas con cáncer de vejiga; 1 de cada 5 hombres y 1 de cada 4 mujeres morirán a causa de su enfermedad [1]. . La cistectomía radical que consiste en la extirpación completa de la vejiga, sigue siendo el tratamiento "estándar de oro" para el cáncer de vejiga invasivo [2]. La radioterapia es una alternativa atractiva ya que preserva la vejiga y permite las funciones urinarias y sexuales normales [3]. Sin embargo, la falta de control local de la enfermedad, así como la toxicidad significativa asociada con la terapia de radiación sigue siendo problemática [4] - [6]. Para mejorar la eficacia, varios ensayos clínicos sobre el manejo de órganos de preservación se llevaron a cabo para poner a prueba los efectos de la quimioterapia y la radiación combinada [7], [8]. Sin embargo a pesar de numerosos esfuerzos, los estudios de quimiorradiación permanecen asociados con el control local subóptimo de la enfermedad y disminuyen la supervivencia en comparación con la cirugía radical. Como tal, existe una imperiosa necesidad de aumentar la radiosensibilización de cáncer de vejiga para aumentar la eficacia mediante la mejora de control local de la enfermedad y permite la reducción de la dosis para disminuir la toxicidad de la terapia de radiación.
Una molécula de señalización que es extremadamente atractivo y tiene recientemente llamado mucho la atención de la terapia dirigida es el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR). Más específicamente, mTOR es un aguas abajo de la serina /treonina proteína quinasa de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt, que desempeña un papel crítico en la oncogénesis [9], [10]. La desregulación de la vía PI3K /AKT /mTOR genera un entorno favorable oncogénico y se ha documentado en una variedad de tumores humanos, incluyendo el cáncer de vejiga [11]. la inhibición de mTOR se convirtió en un área activa de investigación para desarrollar y probar pequeñas moléculas inhibidoras tales como la rapamicina análogos -en especial RAD001 (everolimus, Novartis) y CCI-779 (Torisol, Wyeth) para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer. Recientemente, el primer ensayo clínico de Fase III con éxito la participación de un inhibidor de mTOR se realizó en pacientes con carcinoma avanzado de células renales, que experimentaron una mejora en la supervivencia general [12]. Recientemente hemos publicado el primer informe que demuestra la actividad antitumoral significativa
a través de la inhibición de mTOR
con RAD001 en modelos de cáncer de vejiga
in vitro
y
in vivo
[13]. Curiosamente, notables diferencias en la sensibilidad a la inhibición de mTOR se observaron entre los nueve líneas celulares de cáncer de vejiga humana. Por otra parte, no hubo correlación entre los niveles activados AKT y mTOR con características agresivas de células. Sin embargo, este no fue el caso para S6 activado cuyos niveles aparecido superior en RAD001 sensible en comparación con líneas de células relativamente resistentes. De interés, algunos estudios han informado de que la inhibición de mTOR puede sensibilizar los tumores de la próstata, mama, cerebro y a la radiación [14] ionizante - [16]. Dado que la radiación se demostró que activar la vía PI3K /Akt supervivencia /crecimiento que puede ser responsable de la muerte de las células de escape y radioresistance [17], [18], la inhibición de mTOR concurrente puede potencialmente superar la resistencia a la radiación en el cáncer de vejiga. Para dar seguimiento a esta hipótesis, el presente estudio examinó los efectos de la combinación de RAD001 y la radiación ionizante,
e in vitro
in vivo
, sobre la supervivencia celular y el crecimiento en una variedad de células de cáncer de vejiga líneas. Además, hemos tratado de arrojar luz sobre el mecanismo por el que esta combinación de tratamientos podría inhibir el crecimiento tumoral.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los estándares éticos asociados con el uso de nuestro modelo animal de xenoinjerto fueron totalmente seguidas y respetadas. Fondo para la Universidad del Centro de Salud McGill Cuidado de Animales aprobado nuestros animales protocolos (protocolo#5428) antes del comienzo del estudio. Por otra parte, los animales se mantuvieron y se mantienen en unas instalaciones de última generación que siguen los procedimientos estrictos para la realización de investigaciones en animales, que incluye un monitoreo constante y la inspección de los animales y de los usuarios.
Cultivo celular
la UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, y KU7 líneas celulares se caracterizaron y proporcionados por el espécimen núcleo de los Programas especializados de Investigación de Excelencia genitourinarias en el cáncer de vejiga en el MD Anderson Cancer Center [19]. El documento JP-253 y BV-253J fueron amablemente proporcionados por el Dr. Colin P. N. Dinney de M. D. Anderson Cancer Center de Houston, Texas [20]. Las líneas de células se cultivaron de forma rutinaria a 37 ° C en un CO 5%
2 incubadora, se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (bisonte europeo, Saint-Jean-Baptiste QC) y se pasaron al alcanzar el 80% de confluencia. El inhibidor de mTOR RAD001 fue proporcionado amablemente por su fabricante, Novartis.
ensayo clonogénico
Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 200 células por pocillo y se mantuvieron en el medio de crecimiento . Una vez conectado, se trataron con RAD001 a dosis equivalentes a la GI50 para cada línea celular, tal como se describe anteriormente [13]: UM-UC3 (75 nM), KU7 (50 nM), 253J-BV (8 nM), 253- JP (8 nM), UM-UC5 (0,5 nM) y UM-UC6 (0,5 nM) y se mantiene a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora durante 12 horas. Esto fue seguido por un tratamiento de radiación a diferentes dosificaciones, con y sin RAD001. Los controles incluyeron células no tratadas, junto con las células tratadas con cada uno de la radiación y el tratamiento RAD001 solo. Las células se cultivaron a 37 ° C y se dejaron formar colonias durante 10-14 días. Se eligió un punto de corte aproximada de 50 células viables /colonia. Las células se lavaron con solución salina equilibrada con fosfato (PBS) y se fijaron durante 15 min con 3,7% de formaldehído en PBS. Después de un segundo lavado con PBS, las células se tiñeron con violeta cristal (0,4% w /v en PBS; Fisher Scientific, Waltham, MA) y se dejó secar al aire antes de contar las colonias. Cada tratamiento consistió en pocillos duplicados de una placa de 6 pocillos y el experimento se realizó dos veces. La fracción superviviente se calculó como (el recuento medio de colonias al final del experimento) /(células inoculadas al principio) × (planchas de eficiencia). La eficiencia del chapado se definió como (recuento de colonias media) /(células sembradas en el control no irradiado). Se utilizaron las células no irradiadas como control.
La citometría de flujo
Las células se sembraron en placas de cultivo y deja que se unan. RAD001 se añadió a las muestras apropiadas 12 horas antes de la radiación a una dosis equivalente a la GI50 de cada línea celular. Esto fue seguido por una dosis de 4Gy de radiación ionizante (basado en experimentos de sensibilidad previamente determinados) y las células se cultivaron adicionalmente durante 48 horas. Las células fueron tripsinizadas, lavadas una vez con PBS, y se fijaron con etanol al 100% frío durante 60 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación, los sedimentos celulares se resuspendieron en una solución de yoduro de propidio (PI) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) en PBS, suplementado con RNasa (100 g /ml; Invitrogen, Carlsbad, CA) después se transfiere a la fluorescencia de células activado por (FACS) tubos y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a 40 ° C para permitir la entrada de yoduro de propidio en el núcleo. a continuación, la ingesta de PI se evaluó utilizando un citómetro de flujo Coulter (BD Biosciences, Franklin, Nueva Jersey).
Western blot
Las células fueron cultivadas y tratadas de acuerdo con el régimen descrito anteriormente (RAD001, radiaciones ionizantes, y ambos en combinación), con las células no tratadas sirven como controles. Después de los tratamientos, las células se rasparon en hielo y se resuspendieron durante 30 minutos a 4 ° C en tampón frío RIPA (lisis) que contiene un cóctel de inhibidores de fosfatasa y proteasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Las suspensiones celulares se centrifugaron entonces para recoger lisados claros en el sobrenadante. La concentración de proteínas se midió por el ácido bicinconínico (BCA) ensayo (Pierce Scientific-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Las muestras de proteínas (40 g-60 g) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida, tal como se describe anteriormente [13]. Las proteínas en los geles se transfirieron a membranas, se bloquearon con un 5% de leche no grasa y /o solución de albúmina de suero bovino 5%, e inmuno-borrado con los siguientes anticuerpos primarios monoclonales (todos conejo): fosfo-AKT, AKT total, el fosfo S6, S6 totales, p21, p27kip1, y ciclina D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) a las concentraciones recomendadas por el fabricante. Las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios anti-conejo adecuados y un sistema de detección de quimioluminiscencia ECL (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) se usó para revelar bandas de proteínas de interés, en la película de rayos X. Las películas fueron escaneados y los niveles de proteína se normalizaron en contra actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), una proteína kDa limpieza de control 42 presente en todas las muestras y sirven como nuestro control de carga.
Modelo in vivo-xenoinjerto
Todas las aprobaciones de protocolo se obtuvieron antes del inicio del estudio del Comité de Cuidado de Animales del Centro de Salud de la Universidad McGill. los ratones atímicos hembras (cepa Nu /Nu, de 4-6 semanas de edad; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron utilizados para nuestro modelo de xenoinjerto de cáncer de vejiga, como se informó anteriormente [13]. Brevemente, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con KU7 (10
6 células por inyección). Otro experimento con la misma metodología se ha realizado mediante las líneas celulares de cáncer de vejiga 253J-BV. Para facilitar la adhesión, las células se suspendieron en 200 l de Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ) antes de la inyección. Los tumores se dejaron implantar y crecer durante una semana antes de la asignación al azar en 4 grupos correspondientes a los diferentes grupos de tratamiento, con cada grupo que consta de 14 ratones. El grupo 1
st fue tratado con un placebo (solución de glucosa al 5% en agua). La
nd grupo 2 recibió RAD001 por vía oral (microemulsión diluida en solución de glucosa al 5%) a una dosis de 1,5 mg /kg al día. En el grupo de rd 3
, los tumores fueron expuestos a la radiación ionizante a una dosis fraccionada total de 9 Gy (3 × 3Gy) cada segundo día durante la primera semana de tratamiento. En el 4
ésimo grupo, los ratones se les dio RAD001 a la dosis 1 día antes mencionada antes del inicio del tratamiento de radiación tumor. Los ratones fueron seguidos durante 4 semanas desde el inicio de los tratamientos. El peso corporal y comportamiento de los animales se controlaron durante todo el experimento. Se midieron los tumores (longitud y anchura) dos veces a la semana usando un calibrador Vernier a fin de calcular volúmenes (V = [(longitud x anchura
2) x (π /6)] como se informó anteriormente [13]. Se sacrificaron los ratones en un CO
2 cámara al final del tratamiento. los tumores se cosecharon, se pesa inmediatamente y conservada fijo o congelados para futuros estudios.
la inmunohistoquímica
Tumor secciones se obtuvieron de ratones tratados con placebo, radiación, RAD001 y el régimen de combinación. las secciones de los tumores embebidos en parafina se montaron en portaobjetos de vidrio para la tinción. Después de-paraffinization y la hidratación, la recuperación de antígeno se llevó a cabo en el calentamiento de las muestras con solución tampón de citrato 5% (pH 7,0). las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo específico de p21 (dilución 1:25). se añadió HRP conjugado policlonal de cabra anti-IgG de conejo anticuerpo secundario y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. 3,3'-diaminobencidina ( DAB) sustrato (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) se utilizó para el desarrollo de color de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se observa bajo un microscopio invertido Leica Diaplan equipado con una cámara Leica DFC300FX (Leica, Wetzlar, Alemania). Imágenes fueron capturadas utilizando una suite de aplicaciones de Leica. El análisis se basa en un promedio de 5 focos, a 40 aumentos, que muestra células viables, y un computarizada H-score se calcula sumando los productos de las células teñidas porcentuales en una determinada intensidad de tinción (0-100) y la intensidad de la tinción (0 para la tinción negativa, 1 para baja y 2 para alta tinción).
T-test análisis estadístico
de Student (sin pareja, de dos colas) se utilizó en todos los análisis estadísticos. La significación se fijó en p. & Lt; 0,05
Resultados
La sensibilidad relativa de un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga a RAD001 y la radiación ionizante
Recientemente hemos demostrado que un panel de nueve líneas celulares de cáncer de vejiga exhibe diferencias relativas en su sensibilidad RAD001 y, en consecuencia, el tratamiento RAD001 dieron lugar a diferencias relativas en la inhibición de mTOR y la detención del crecimiento, como la supervisión de ensayos de MTT. Con estos datos, hemos sido capaces de dividir nuestras líneas de células en 3 grupos en función de su sensibilidad RAD001 [13] de la siguiente manera: relativamente resistentes (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /L)), moderadamente sensible (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 & lt; 50 nmol /L)). y, finalmente, altamente sensible (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /L) en este estudio mirando a la efectos de los tratamientos combinados (RAD001 y radiación), ensayos por clonación se usó para clasificar las seis líneas celulares sometidas a prueba de acuerdo a sus sensibilidades relativas a IR a varias dosis de radiación (fig. 1A). sobre la base de estas sensibilidades relativas a la radiación, las líneas celulares eran dividido en tres grupos, resistentes, moderadamente resistentes y sensibles. el grupo resistente incluye UM-UC5 con la fracción de supervivencia más alta, la resistencia moderada incluido UM-UC13, KU7, UM-UC3, UM-UC6 mientras que 253J-BV tenía una menor fracción de supervivencia y por lo tanto se define como una línea celular sensible a la radiación. se comparó la respuesta de estas seis líneas de células a cada uno de RAD001 y la radiación ionizante. Con base en los datos de la Figura 1B y en la Tabla 1, se concluyó que no hay correlación entre la sensibilidad a RAD001 y la sensibilidad a la radiación ionizante.
células en placas fueron expuestas a la radiación ionizante para medir los efectos sobre el crecimiento por ensayo clonogénico, como se describe en Métodos. (A) Sobre la base de los resultados recogidos, hemos sido capaces de clasificar estas líneas celulares como sensible a la radiación, moderadamente sensibles y resistentes -relativamente. (B) El RAD001 IC50 se representó frente a la pendiente de la curva para cada línea celular en el ensayo clonogénico cuando son tratados con IR.
La radiación ionizante activa AKT mientras que RAD001 inhibe la fosforilación S6
se ha informado de que la radiación ionizante activa AKT en la fracción de células supervivientes [17], [21]. Ya que esto puede estar asociado con resistencia al tratamiento, escapar de la muerte celular y la supervivencia, hemos tratado de determinar si la exposición de radiación de las células del cáncer de vejiga debería conducir a la activación de AKT. Para este fin, una línea celular relativamente resistente, KU7, se expuso a la radiación ionizante en el tiempo (0 a 60 min) y se lisaron para analizar pAKT mediante transferencia Western directa usando anticuerpos AKT fosfo-específicos dirigidos contra el sitio de fosforilación de S473. Los resultados en la figura 2A muestran que, efectivamente, AKT se activó rápidamente después de 15 minutos de tratamiento de radiación y esta activación persistió a los 30 y 60 minutos. Estos resultados implican que KU7 someterse a una activación de la vía de supervivencia pro-oncogénica después de la exposición a la radiación ionizante. En todos los experimentos, los niveles de pAkt aumentaron después del tratamiento con radiación ionizante a un máximo y disminuyeron después. Del mismo modo, como células KU7 son también relativamente RAD001 resistentes, se trataron con RAD001 para comprobar que su objetivo mTOR se inhibió. Para este propósito, los niveles de fosforilados S6 se determinaron utilizando un anticuerpo específico para los residuos de serina 240/244 en la proteína S6. Como era de esperar, RAD001 fue potente en la disminución de los niveles de fosforilación de la molécula de señalización corriente abajo mTOR y objetivo S6, tal como se muestra a los 30 minutos después del tratamiento (Fig. 2B) y esta inhibición se mantiene a 24 h post-tratamiento (datos no mostrados). Además, se obtuvieron resultados similares con otras líneas de células de cáncer de vejiga (253J-BV, UM-UC3, y UM-UC6) tratados con radiación y RAD001 (datos no mostrados).
se trataron células (A) KU7 con 4 Gy de radiación ionizante. Las células se lisaron 15, 30 y 60 minutos después del tratamiento para analizar la activación de AKT (p-AKT; fila superior) por transferencia de Western. Los niveles totales de AKT se muestran en la fila inferior. las células (B) KU7 se trataron con 5 Gy de radiación, 100 nM de RAD001 o ambos, y se lisaron. Los niveles de Akt y fosforilación S6 se analizaron por Western blot. Se indican los niveles totales de Akt y la expresión S6. Se obtuvieron resultados similares cuando 253J-BV, UM-UC3, y UM-UC6 fueron tratados con radiación y RAD001 solo y en combinación (datos no mostrados).
Combinando RAD001 con radiación ionizante reduce significativamente colonia formación
Para dar una idea sobre los efectos de la combinación de RAD001 con radiaciones ionizantes en las líneas celulares de cáncer de vejiga, se ha monitorizado la fracción de células supervivientes en el tiempo utilizando ensayos por clonación. Después del tratamiento, se monitorizaron células sembradas en el tiempo y se contó el número de colonias. La dosis RAD001 se mantuvo en el GI50 para cada línea celular, mientras que la dosis de radiación se varió. En todas las líneas celulares ensayadas (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, y UM-UC5), se observó una disminución significativa en el número de colonias para las células tratadas con la terapia de combinación en comparación con cualquiera la radiación sola, o el control no tratado (Fig. 3) ionizante. Curiosamente, mientras que esta disminución en la fracción de supervivencia se observó en todas las líneas celulares ensayadas, la disminución relativa más dramática cuando se combinaron ambos tratamientos se observó con dos líneas celulares más sensibles a RAD001 (UM-UC5 y UM-UC6). En todas las líneas celulares ensayadas, nuestros resultados apuntan a un efecto aditivo sobre el crecimiento cuando la combinación de RAD001 con radiación ionizante. Vale la pena señalar que se observó una inhibición menor de formación de colon en las dos líneas de células (UM-UC5 y UM-UC6) que se caracterizaron originalmente por nuestro laboratorio para ser los más sensibles a RAD001. Este recae principalmente en el propio ensayo colonogenic donde la formación de colon (tal como se determina por un tamaño de las colonias establecer universalmente) mientras que la sensibilidad a RAD001 se realizó con un ensayo enzimático (MTT). Esta discrepancia en la sensibilidad de los ensayos, la duración de ensayo, en combinación con el tiempo de duplicación rápido, podría explicar los resultados clonogénicas para estos dos líneas celulares.
Seis líneas celulares se trataron con RAD001 durante 12 horas antes de la exposición a ionizante radiación y crecido aún más, como se indica en Métodos. La formación de colonias se midió después de la fijación de células y la tinción con cristal violeta, 10-14 días después del tratamiento en función de las líneas celulares. Los resultados fueron estadísticamente significativos (p & lt; 0,05). En el tratamiento combinado en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo en todas las líneas celulares ensayadas
El tratamiento con RAD001 y la radiación ionizante induce tanto un aumento del porcentaje de células en la G0 /G1 y las fases G2 del ciclo celular
para obtener conocimientos sobre el mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento observado, el análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo para estudiar la distribución de las células a lo largo de las diversas fases de la ciclo celular 48 horas después de cada tratamiento solo y en combinación. Las células se trataron con una dosis de RAD001 equivalente a su GI50 (que varía de 0,5 a 75 nmol /L), así como 4Gy de radiación ionizante. Los resultados se muestran en la Figura 4. RAD001 indujo una detención G0 /G1 en todas las líneas celulares de cáncer de vejiga analizadas: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% y 253J- BV 67% ± 4% en comparación con sus controles no tratados, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% y 55% ± 3%, respectivamente. Los porcentajes representan la proporción de células en cada fase con respecto al número total de células. Como era de esperar, la radiación ionizante dio lugar principalmente a una detención G2, ilustrado por un aumento significativo en el porcentaje de células en esta fase tras el tratamiento con radiación ionizante: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% y 253J-BV 22% ± 3% en comparación con sus respectivos controles sin tratar: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% y 4% ± 2%, respectivamente. En el brazo combinado con RAD001 y la radiación ionizante, se observó tanto un aumento en el porcentaje de células en las fases G0 /G1 y G2 (Fig. 4). Más específicamente, una disminución en el porcentaje de células en la fase S fue observado en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo o con el control (sin tratamiento) y esto fue acompañado con un aumento del porcentaje de células en la fase G0 /G1 y G2 fases. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que el efecto citostático de RAD001 en combinación con radiación ionizante exhibe un efecto aditivo inhibidor de la progresión de las células a través de su ciclo.
La célula líneas se cultivaron y se trataron con RAD001 solo, radiación ionizante solos y con la combinación de RAD001 y la radiación. Para esta última serie, las muestras fueron pre-tratados con RAD001 durante 6 horas antes de la radiación. Las células se fijaron y se tiñeron para la ingesta de yoduro de propidio a las 48 horas después del tratamiento, y entonces las mediciones se realizaron por citometría de flujo. La proporción de poblaciones de células en las diferentes fases del ciclo celular se muestra para cada línea celular mediante barras de colores (G0 /G1: naranja /azul; S: Rojo y G2: Amarillo) guía empresas
RAD001. y la radiación ionizante altera los niveles de los puntos de control del ciclo celular ciclina D1, p27kip1 y p21
sobre la base de los datos de análisis del ciclo celular por encima y para comprender mejor el mecanismo por el que RAD001 y ionizante acto radiación en conjunto para inhibir el crecimiento celular, hemos probado la posibilidad de cambios en los niveles de expresión de diversos reguladores del ciclo celular, particularmente asociado con los puestos de control, tales como la ciclina D1, p27, y p21. Los resultados en la figura 5 ilustran el caso de KU7, usado como un representante del grupo de líneas celulares encuentra para ser relativamente resistente a la radiación ionizante y RAD001. Dicho esto, una dosis de RAD001 equivalente a la IC50 de esa línea celular se utilizó para garantizar una respuesta al tratamiento RAD001. Nuestros resultados muestran que el nivel de ciclina D1, que es una proteína necesaria para la transición G1 /S del ciclo celular, se disminuyó después de 24 horas de tratamiento con RAD001 (Fig. 5), un hallazgo que es compatible con nuestras observaciones en el ciclo celular cambios. En contraste, los niveles de p27, que es una proteína también asociada a la transición G1 /S, cambiado en una correlación inversa (aumento) después de 24 horas de tratamiento con RAD001, la radiación ionizante, y el tratamiento combinado en comparación con el control (Fig. 5). Curiosamente, los niveles de p21, que también se asocia con la inhibición de la progresión del ciclo celular, se redujeron en células tratadas con RAD001 solo en comparación con el control, o la radiación (Fig. 5). Los niveles de p21 aumentaron en respuesta al tratamiento a la radiación en comparación con el control, y los niveles de p21 están en su más alto cuando las células se tratan tanto con RAD001 y la radiación ionizante. Es de destacar que se obtuvieron resultados similares para la ciclina D1, p27, p21 y, en todas las líneas celulares ensayadas:. UM-UC3, UM-UC6 y 253J-BV
células de cáncer de vejiga fueron tratados con RAD001, ionizante radiación (IR) o el tratamiento combinado. Ellos se lisaron 24 horas después del tratamiento como se describe en Métodos. El análisis de transferencia Western para la ciclina D1, p27kip1 y p21 en las células KU7 y normalizado en los paneles inferiores como una función del nivel de actina medido en paralelo. Se obtuvieron resultados similares para todas las líneas celulares probadas, UM-UC3, UM-UC6 y 253J-BV (no mostrado).
La combinación de tratamiento con radiación ionizante RAD001 inhibe significativamente el crecimiento del tumor en xenoinjerto de cáncer de vejiga humana modelo, en comparación con el tratamiento aislado de
para determinar la significación y para verificar si
in vitro
datos con respecto a los efectos de la combinación de RAD001 y de la radiación sobre el crecimiento de líneas celulares de cáncer de vejiga ionizante puede aplicarse de forma
in vivo
, se utilizó la línea celular de cáncer de vejiga KU7 para crecer como xenoinjertos de tumores subcutáneos en ratones sin timo. En todos los ratones, los tumores se evidenciaron en los primeros 10 días después de la implantación. No hubo pérdida de peso corporal o ninguna toxicidad significativa asociada directamente con RAD001 y tratamientos de radiación ionizante durante toda la duración del estudio (un total de 5 semanas). En los ratones tratados con RAD001 combinado y la radiación ionizante, se produjo un efecto inhibidor máximo sobre la progresión del cáncer de vejiga, tal como se indica por la disminución significativa en el peso del tumor en comparación con cualquiera de los tratamientos solos o grupo de placebo (peso del tumor promedio de 31 mg para vs. grupo de combinación 117 mg con RAD001 solo, 80 mg con IR, o 340 mg para el placebo, P & lt; 0,05) (Fig 6).. Resultados similares también se obtuvieron usando las líneas de células 253J-BV donde la terapia combinada logra efecto inhibidor máximo en la progresión del cáncer de vejiga después de 4 semanas de tratamiento en comparación con el control. Los mismos resultados se demostraron mediante la cinética de crecimiento del tumor cuando el volumen del tumor se midió a lo largo de la duración del tratamiento (datos no mostrados). Nuestra tinción inmunohistoquímica de p21 en las secciones de xenoinjertos confirmó los hallazgos del análisis de transferencia de Western de los niveles de p21
in vitro gratis (Fig. 7). Los niveles de p21 significativamente (p & lt; 0,05) aumentaron después del tratamiento con radiación y el régimen de combinación en comparación con el placebo. Además, nuestros datos indican una ligera disminución, aunque estadísticamente no significativa, de los niveles de p21 en el grupo tratado con RAD001 solo.
El modelo de ratones portadores de tumores de vejiga sin timo de KU7 se utilizó como se describe en Métodos. pesos de los tumores (en gramos) alcanzaron en el punto final experimental y se expresaron como la media de peso de tumores recogidos para cada grupo de ratones en los 4 grupos de tratamiento, como se indica. Similares resultados obtenidos utilizando células 253J-BV (datos no mostrados).
(A) La inmunohistoquímica se usa para detectar los niveles de p21 en tejidos de cáncer de vejiga de xenoinjerto de ratón embebidos en parafina tratados con placebo, IR, RAD001 y en combinación. (B) Cuantificación de los datos de inmunohistoquímica reveló un aumento significativo en la expresión de p21 como se observa en los tumores tratados con radiación ionizante y en combinación en comparación con el tratamiento con placebo y RAD001.
Discusión
la radioterapia es un elemento clave de muchos regímenes de tratamiento del cáncer de ahí su uso generalizado. Sin embargo, la radiación ionizante parece contribuir a un aumento desfavorable en la señalización a través de la vía favor de la supervivencia PI3K /Akt /mTOR. En el presente estudio, se observó diferencias en la sensibilidad de un panel de líneas celulares de seis vejiga a la radiación ionizante, siendo algunos de ellos eran más resistentes que otros. Se demostró además la activación de AKT después de la exposición a la radiación ionizante. Varios factores pueden ser potencialmente determinante en los mecanismos de activación de la vía PI3K /AKT siguientes radiación ionizante y luego ayudar a las células cancerosas en el establecimiento de la resistencia [22]. Entre otros, la actividad mejorada de enzimas clave, tales como la actividad de telomerasa [23], así como la participación de moléculas de señalización, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y RAS [24], [25] puede explicar por qué algunos tumores no lo hacen responder a la radiación tan eficazmente como los demás. En particular, señalización a través de la vía PI3K /AKT EGFR se informó para regular la proteína quinasa subunidades catalíticas dependientes de ADN, que son parte de la maquinaria de reparación del ADN activado después de la radiación [26]. Si bien estas observaciones hacen hincapié en la importancia del papel que la activación de PI3K /AKT desempeña en la radioresistance cáncer, se demuestra que el bloqueo de la vía PI3K /Akt /mTOR con RAD001 aparece como un medio valioso para mejorar la eficacia del tratamiento de radiación en las células de cáncer de vejiga. El mecanismo por el cual exhibe RAD001 este efecto mejorado todavía necesita más evaluación. Podría ser simplemente que el bloqueo de la activación de la vía de recuperación después de la radiación es suficiente para disminuir radioresistance;