Extracto
El cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado que afecta a 1 de cada 6 hombres en los EE.UU.. La comprensión de la base molecular de la progresión del cáncer de próstata puede servir como una herramienta para el diagnóstico precoz y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para esta enfermedad. Proteína Quinasa D1 (PKD1) es una quinasa multifuncional que es altamente expresado en la próstata normal. La disminución de expresión de PKD1 se ha asociado con la progresión del cáncer de próstata. Por lo tanto, los productos sintéticos o naturales que regulan esta vía de señalización pueden servir como nuevas modalidades terapéuticas para la prevención y el tratamiento del cáncer de próstata. La curcumina, el ingrediente activo de la cúrcuma, ha demostrado propiedades anti-cáncer a través de la modulación de un número de diferentes vías moleculares. En este documento, hemos demostrado que la curcumina activa PKD1, lo que resulta en cambios en la señalización de β-catenina mediante la inhibición de la actividad de transcripción β-catenina nuclear y la mejora de los niveles de membrana β-catenina en células de cáncer de próstata. La modulación de estos eventos celulares de la curcumina se correlacionaron con disminución de la proliferación celular, la formación de colonias y la motilidad celular y la agregación de célula-célula mejorada en células de cáncer de próstata. Además, también hemos puesto de manifiesto que la inhibición de la motilidad celular por la curcumina es mediada por la disminución de los niveles de la cofilina activa, un objetivo corriente abajo de PKD1. Los potentes efectos anticancerígenos de la curcumina
in vitro
también se reflejaron en un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata. La
in vivo
inhibición del crecimiento tumoral también se correlacionó con la localización de membrana mejorada de β-catenina. En general, nuestros hallazgos en este documento han revelado un nuevo mecanismo molecular de acción curcumina a través de la activación de PKD1 en las células de cáncer de próstata
Visto:. Sundram V, Chauhan SC, Ebeling M, H Jaggi (2012) La curcumina atenúa la β- catenina señalización en las células del cáncer de próstata a través de la activación de la proteína quinasa D1. PLoS ONE 7 (4): e35368. doi: 10.1371 /journal.pone.0035368
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 4 de octubre de 2011; Aceptado: March 15, 2012; Publicado: 16 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Sundram et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por COBRE Grant (RR024219 P20) de los NIH (http://www.ncrr.nih.gov/) y por las subvenciones del Departamento de defensa (DOD) (http://cdmrp.army.mil/) de MJ (DOD PC073643) y SCC (DOD PC073887). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte y el cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres en los EE.UU. [1]. El riesgo de cáncer de próstata aumenta de manera exponencial después de la edad de 50. Por lo tanto, el cáncer de próstata está posicionado para convertirse en un desafío mayor en los próximos años debido a un aumento general de la longevidad. Mientras que la etiología del cáncer de próstata no se entiende bien, los factores genéticos y ambientales parecen jugar papeles importantes en el desarrollo de la enfermedad. Una estrategia de primera línea común para el tratamiento del cáncer de próstata incluye castración quirúrgica o farmacológica a través de la terapia de ablación de andrógenos. Mientras que la terapia de ablación de andrógenos es eficaz durante las etapas iniciales de la enfermedad, el cáncer progresa rápidamente a una fase independiente de andrógenos para el cual no hay tratamiento efectivo conocido está disponible actualmente. Por lo tanto, es altamente deseable para el desarrollo de nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de cáncer de próstata comprensión de la base molecular de la enfermedad.
Proteína Quinasa D1 (PKD1) es un conservadas evolutivamente, expresado de forma ubicua serina-treonina quinasa que desempeña un papel central en la regulación de una variedad de funciones celulares incluyendo la supervivencia celular, la proliferación, la motilidad y la invasión [2] - [8]. El
PKD1
gen se expresa en muchos órganos, con la expresión más alta documentada en las células germinales de próstata y testículo [3], [9], [10]. PKD1 exhibe una combinación de características estructurales y funcionales tanto de la familia PKC (diacil-glicerol y éster de forbol dominios estructurales de unión) y la familia CaMK (homología estructural del dominio quinasa y el sustrato y el inhibidor de especificidad). Por lo tanto, tiene una posición única dentro de la cascada de transducción de señales para la integración de información de señalización de los estímulos externos y las convierte en respuesta intracelular mediante la modulación de diversas vías aguas abajo [2]. Por lo tanto, la desregulación de PKD1 afecta a múltiples vías de señalización, lo que resulta en enfermedades crónicas como el cáncer [2]. El trabajo previo de nuestro laboratorio ha implicado un papel crítico para PKD1 en el cáncer de próstata [11]. Nuestro trabajo ha puesto de manifiesto la capacidad de PKD1 para inhibir las funciones de β-catenina en el cáncer de próstata [12]. Además, PKD1 se ha demostrado que interactúan con y modular las funciones de E-cadherina, receptor de andrógenos y MAPKinase vías de señalización [13] - [18]. PKD1 también inhibe la motilidad celular al interactuar directamente con y la modulación de las funciones de un número de proteínas implicadas en la remodelación de actina, incluyendo la fosfatasa cabestrillo disparo (SSH1L) y cortactin [19] - [23]. Además, PKD1 se sabe están involucrados en la inhibición de la invasión, metástasis y epitelio-mesenquimal transición (EMT) de las células cancerosas mediante la regulación de la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [24], [25] y las funciones de factor de caracol transcripción [26 ], respectivamente. Por lo tanto, las moléculas que modulan la expresión o actividad PKD1 pueden desempeñar un papel importante en la prevención y o el tratamiento de cáncer de próstata.
curcumina (Figura 1A), el ingrediente activo de la cúrcuma, es un no tóxico, diferuloyl metano compuesto que tiene una potente anti-proliferativa, anti-inflamatorias y anti-oxidantes [27], [28]. Tanto
in vivo
y
in vitro
estudios han demostrado la capacidad de la curcumina para inhibir eficazmente el crecimiento del cáncer [29] - [31]. Esta propiedad anti-cáncer potente de la curcumina se relaciona con su capacidad para modular simultáneamente las funciones de un número de diferentes vías moleculares incluyendo MAPK, EGFR y las vías de NFkB [32]. Además, la curcumina también regula la actividad transcripcional β-catenina nuclear /factor de células T (TCF). Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos de la curcumina mediada por la supresión de la actividad transcripcional β-catenina no se entienden completamente.
A). Estructura química de la curcumina. SEGUNDO). Efecto de la curcumina sobre la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer de próstata. LNCaP, C4-2, DU145 y PC3 células fueron tratados con curcumina o vehículo DMSO de control durante 48 h y la proliferación celular se determinó usando el ensayo de MTS. La proliferación celular se calculó el porcentaje por la normalización de la proliferación de las células tratadas con la curcumina con la proliferación de las células tratadas de control. la inhibición dependiente de la concentración en la proliferación celular se observó con el tratamiento de cúrcuma. La media ± SE; n = 3; * P & lt;.
0,05
En el presente estudio, se han puesto de manifiesto el efecto de la curcumina en la activación de PKD1. La curcumina activación mediada PKD1 suprime la actividad de transcripción /TCF β-catenina nuclear y inhibió el crecimiento de cáncer de próstata en la línea celular y el modelo animal de xenoinjerto. La activación de PKD1 también mejoró la agregación de célula-célula y las funciones de la motilidad celular inhibidos
vía
enriquecimiento de membrana β-catenina y la inhibición de la actividad de la cofilina. En general, hemos puesto de manifiesto una nueva vía de señalización molecular regulado por la curcumina para atenuar el crecimiento del cáncer de próstata.
Resultados
La curcumina inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata
proliferación celular desregulada es un sello distintivo de las células cancerosas. Con el fin de determinar la actividad anti-proliferativa de la curcumina (Figura 1A), un panel de líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP sensible temprano paso andrógeno, independiente de andrógenos C4-2, PC3 y DU145) fueron tratados con concentraciones variables de la curcumina para 48 h y se evaluó para la proliferación celular. tratamiento curcumina exhibió una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular en todas las diferentes células de cáncer de próstata (Figura 1B). El sistema emparejado de próstata LNCaP línea celular de cáncer de células (andrógenos y minúsculas) y C4-2 (LNCaP derivados, independiente de los andrógenos) se utilizaron para estudios posteriores.
La curcumina activa PKD1
PKD1 es necesaria para fisiología normal de las células de la próstata y su regulación a la baja se asocia con la progresión del cáncer de próstata. Por lo tanto, los compuestos no tóxicos, naturales que regulan al alza la expresión o actividad de PKD1 pueden ayudar en la prevención y o el tratamiento de cáncer de próstata. Con el fin de determinar si la curcumina puede modular la expresión o actividad de PKD1, las células de cáncer de próstata C4-2 independiente de andrógenos fueron tratados con curcumina para variar los puntos de tiempo, y la expresión del total PKD1 (Figura 2A) y PKD1 activo (Figura 2B) se determinó usando anticuerpos de anticuerpos PKD1 y fosfo PKD1. Si bien no se detectó cambio marcado en el nivel total de PKD1 después del tratamiento curcumina (Figura 2A), el tratamiento curcumina mejora de forma significativa la expresión de PKD1 activado dentro de 1 h de tratamiento (Figura 2B y la Figura S1A). Resultados similares se obtuvieron en las células que sobreexpresan C4-2 PKD1 (C4-2-PKD1) (Figura S1 B) y en células LNCaP (Figura s1c). Estos datos sugieren que el tratamiento con la curcumina puede inducir eficazmente la activación de PKD1 en células de cáncer de próstata.
A). Efecto de la curcumina sobre los niveles de PKD1. células C4-2 fueron tratados con 20 mM curcumina. En puntos de tiempo variables, las células se cosecharon, y los lisados se resolvieron en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se sondaron para el total de PKD1. β-actina se utilizó como control interno de carga. Las intensidades de las bandas se analizaron densitométrica, normalizadas con respecto a los niveles de ß-actina y se representan. La curcumina tratamiento dio lugar a ningún cambio significativo en la expresión de PKD1 a 1, 3 y 6 h. SEGUNDO). Efecto de la curcumina sobre la activación de PKD1. Para la determinación de la expresión de activado PKD1 /fosforilada, manchas de transferencia se sondaron con fosfo PKD1, PKD1 total y anticuerpos beta-actina. La intensidad de la banda pPKD1 se normalizó a los niveles totales de PKD1 y graficó. tratamiento de curcumina indujo PKD1 activación /fosforilación por 1 h, mientras que no se observaron cambios aparentes en la expresión del total de PKD1. borrones representativos de tres experimentos se muestran en la figura. Au- unidades arbitrarias.
tratamiento de curcumina enriquece localización de β-catenina en la membrana celular
β-catenina es una proteína celular importante que es fosforilada por PKD1. PKD1 también se ha demostrado que aumenta los niveles de membrana β-catenina y la interacción célula-célula en células de cáncer de próstata [12]. Para determinar el efecto de la activación mediada por la curcumina de PKD1 en la membrana localización β-catenina, se inmunotiñeron tratada curcumina células C4-2 para β-catenina y se procesaron para microscopía confocal (Figura 3). Como se muestra en la Figura 3, el tratamiento de cúrcuma membrana enriquecida β-catenina localización en células C4-2 dentro de 1 h de tratamiento en comparación con las células tratadas de control del vehículo. Resultados similares se observaron también en células LNCaP (Figura S2).
C4-2 células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio durante la noche en placas de 12 pocillos. Las células fueron tratadas con DMSO (panel superior) o la curcumina (20 M) (panel inferior) durante 1 h, se lavaron, se fijaron y inmunoti~neron de β-catenina (rojo) y contra el teñidas con DAPI (azul). Se observó tinción Superior β-catenina en la superficie celular en 1 h de tratamiento de cúrcuma, en comparación con las células tratadas de control de DMSO. Aumentos originales × 600.
La curcumina mejora de la membrana mediada por β-catenina es inhibida por PKD1 siRNA
PKD1 previamente se ha demostrado que influyen en la localización subcelular de β-catenina [12] . Por lo tanto, hemos tratado de investigar el papel de PKD1 en la curcumina mediada enriquecimiento de la membrana de β-catenina. Para este fin, hemos utilizado PKD1 siRNA para silenciar PKD1 en las células C4-2. PKD1 siRNA expresión efectivamente silenciada PKD1 (más del 95%) en las células en comparación con C4-2 revueltos siRNA (Figura 4A) (no específica). Después de la inhibición de la expresión de PKD1, las células C4-2 fueron tratados con curcumina y se procesaron para microscopía confocal para determinar β-catenina y la expresión y localización de PKD1 (Figura 4B). En las células transfectadas siRNA revueltos, el tratamiento de cúrcuma mejorada de manera eficiente localización β-catenina en la membrana celular (Figura 4B, A2-D2) en comparación con las células control (Figura 4B, A1-D1). Sin embargo, en las células transfectadas con PKD1 silenciar siRNA, el tratamiento de cúrcuma no pudo enriquecer β-catenina en la membrana en las células C4-2 (Figura 4B, A4-D4). Estos datos sugieren que PKD1 juega un papel en la curcumina mediada enriquecimiento de membrana β-catenina en células de cáncer de próstata.
A). El silenciamiento de PKD1 por PKD1 siRNA. células C4-2 fueron transfectadas durante 48 h con 25 nM de control de siRNA o PKD1 siRNA, se lisaron y se inmunotransfirieron para PKD1 y β-actina utilizando anticuerpos específicos. La cuantificación de las intensidades de banda de la proteína se realizó por análisis densitométrico. Los niveles de PKD1 se normalizó los niveles de ß-actina y se representan. Au- unidades arbitrarias. La inmunotransferencia muestra más del 95% de supresión de la expresión de PKD1 en la transfección con PKD1 siRNA (carril 2) en comparación con las células control siRNA-transfectadas (carril 1). SEGUNDO). Represión de PKD1 inhibe el enriquecimiento de los niveles de β-catenina de membrana. C4-2 células se cultivaron en cubreobjetos durante la noche. Las células se transfectaron primero, ya sea con el control de siRNA (A1-D1; A2-D2) o PKD1 silenciar siRNA (A3-D3; A4-D4) durante 24 h, seguido de tratamiento con el control de vehículo (DMSO) (A1-D1; A3 -D3) o la curcumina (20 M) (A2-D2; A4-D4) durante 1 h. Las células se inmunotiñeron para la β-catenina (rojo) o PKD1 (verde) y el núcleo se tiñó contador con DAPI (azul). Se observó tinción Superior β-catenina en la superficie celular de las células siRNA de control en 1 h de tratamiento de cúrcuma (A2) en comparación con el tratamiento con vehículo (A1). Sin embargo, siRNA mediada por silenciamiento de PKD1 (B3, B4) inhibió la curcumina enriquecimiento mediada de membrana tinción β-catenina en la superficie celular (A4 vs A3 y A2). Aumentos originales con 600 × 2 × zoom.
La curcumina atenúa nuclear de señalización
β-catenina
PKD1 modula la vía de señalización de β-catenina mediante la interacción, la fosforilación y la modulación de la localización subcelular y la inhibición la actividad de transcripción de β-catenina nuclear [12]. Hemos observado la activación de PKD1 máxima por tratamiento curcumina dentro de 1 h (Figura 2B). la activación transitoria de PKD1 se ha demostrado que tienen a largo plazo efectos celulares aguas abajo [12], [17]. Por lo tanto, se determinó adicionalmente el efecto de la curcumina sobre la membrana localización β-catenina después de 24 h de tratamiento mediante microscopía confocal (Figura 5A). se observó membrana Superior localización β-catenina reducida junto con β-catenina citoplásmica en las células después de 24 h de tratamiento de cúrcuma (Figura 5A). Además, 24 h tratamiento de cúrcuma también alteró la localización subcelular de PKD1 (Figura 5A). Mientras que en las células control, PKD1 fue localizada principalmente en el citoplasma, las células tratadas exhibieron curcumina localización PKD1 en la membrana y en el núcleo (Figura 5A).
A) Efecto del tratamiento curcumina en la localización celular de β- catenina y PKD1. C4-2 células tratadas con curcumina (20 mM) o DMSO durante 24 h Inmunomarcamos de β-catenina (verde) o PKD1 (rojo) y contra el teñidas con DAPI (azul). células tratadas curcumina mostraron menor membrana citoplasmática y una mayor tinción β-catenina en comparación con las células control. Además, mientras que PKD1 se localizó predominantemente en el citoplasma de las células de control, las células tratadas curcumina mostraron tinción principalmente en la membrana celular y en el núcleo (flechas blancas), con débil tinción citoplásmica. Aumentos originales × 600 con 2 x zoom. B) Efecto de la curcumina en los niveles de β-catenina nuclear. proteínas nucleares aisladas de las células C4-2 tratados ya sea con la curcumina (20 mM) o DMSO se resolvieron en membrana de PVDF y se procesaron para inmunotransferencia utilizando anticuerpo β-catenina. proteína histona H1 se utilizó como control de carga. cuantificación densitométrica de las intensidades de las bandas β-catenina, normalizado a los niveles de histona H1 se muestra en el gráfico. tratamiento curcumina disminuyó notablemente los niveles de β-catenina nuclear en comparación con las células tratadas con vehículo. Au- unidades arbitrarias. C) Efecto de la curcumina sobre la actividad de transcripción β-catenina en las células del cáncer de próstata C4-2. La actividad de transcripción β-catenina se midió mediante transfección transitoria de las células con TCF luciferasa reportero de construcción que contiene ya sea TVC unión promotor sitios (PTOP-FLASH) o sitios de unión del promotor mutante de TCF (pFOP-FLASH), junto con el plásmido de control interno que contiene
Renilla
gen de la luciferasa (pRL-TK). Después de 3 h, las células se trataron con la curcumina (20 mM) o DMSO durante 24 h. La actividad de transcripción β-catenina fue normalizada a primera
Renilla
actividad de la luciferasa, y se expresa como una proporción de la actividad /pFOP-FLASH PTOP-FLASH. La actividad de las células tratadas con la curcumina se normalizó a la actividad de las células tratadas con vehículo (considerado 100%). tratamiento curcumina redujo significativamente la actividad de transcripción β-catenina en células C4-2 comparación con las células tratadas con vehículo. Media ± SE, n = 3, * p & lt; 0,01. RE). Efecto de la curcumina sobre la transcripción de la ciclina D1. La transcripción de la ciclina D1 se analizó a partir de células tratadas con la curcumina o vehículo de control durante 24 h. Después de la transcripción inversa del ARN en ADNc, la amplificación PCR de ciclina D1 o GAPDH de control interno se llevó a cabo utilizando cebadores específicos de genes. Los productos amplificados se resolvieron en gel de agarosa al 1%. La cuantificación densitométrica de las intensidades de las bandas de ciclina D1 normalizaron a los niveles de GAPDH se muestra en el gráfico. el tratamiento de cúrcuma reduce la expresión de ciclina D1. Au- unidades arbitrarias. MI). análisis de inmunotransferencia. Los lisados celulares preparados a partir de la curcumina (20 mM) o DMSO tratados C4-2 células se resolvieron mediante SDS-PAGE y se procesaron para inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos. tratamiento curcumina disminuyó notablemente la expresión de ciclina D1, mientras que no se observó ningún efecto sobre la expresión de β-catenina total, el E-cadherina o 3a Wnt. Se muestran inmunotransferencias representativas de tres experimentos.
β-catenina es un componente crítico de la cascada de señalización Wnt. funciones de β-catenina nuclear como un factor co-transcripción mediante la formación de un complejo con TCF y aumenta la expresión de un número de moléculas con funciones de pro-oncogénicos, incluyendo la ciclina D1, c-myc y c-jun. Desde PKD1 modula la localización subcelular de β-catenina y desde la curcumina mediada por la activación de PKD1 mejoró la localización de la membrana de β-catenina, se analizó el efecto de esta activación de la expresión β-catenina nuclear mediante inmunotransferencia y en la actividad de transcripción β-catenina usando una luciferasa sistema informador en células de cáncer de próstata C4-2 (Figuras 5B y 5C). tratamiento curcumina redujo significativamente la expresión nuclear de β-catenina en comparación con sulfóxido de dimetilo (DMSO) células tratadas (Figura 5B). La disminución en los niveles de β-catenina nuclear se correlacionó con la atenuación de la actividad de transcripción β-catenina en C4-2 (Figura 5C). Con el fin de determinar los efectos aguas abajo de la actividad β-catenina suprimido, la expresión de la ciclina D1 fue analizado en tratados curcumina células C4-2. Curiosamente, se observó una marcada disminución en la expresión de ciclina D1 en mRNA (Figura 5D) y los niveles de proteína (Figura 5E) en tratados curcumina células C4-2. Resultados similares también se obtuvieron por análisis de PCR en tiempo real (datos no mostrados). Sin embargo, no se observó ningún cambio aparente en la expresión de Wnt 3a, β-catenina y E-cadherina (Figura 5E).
También determinó el efecto de la curcumina sobre la actividad de transcripción β-catenina en las células LNCaP. De manera similar a las células C4-2, actividad curcumina inhibió β-catenina de transcripción (Figura S3A) y una marcada disminución de la expresión de ciclina D1 (Figura S3B) en células LNCaP.
tratamiento curcumina suprime fenotipo oncogénico en células de cáncer de próstata
Enhanced potencial clonogénico y la disminución de la adhesión célula-célula son dos características importantes del crecimiento del cáncer y la metástasis. La característica de crecimiento clonogénico es necesario que las células de cáncer para establecer un tumor primario y, finalmente, metástasis. Por lo tanto, hemos examinado la capacidad de la curcumina para inhibir la formación de colonias dependientes e independientes de anclaje anclaje. tratamiento curcumina inhibe la formación de colonias independiente dependiente y anclaje de anclaje de una manera dependiente de la dosis en células de cáncer de próstata C4-2 (Figura 6A, B). En ensayos independientes de anclaje, el tratamiento de cúrcuma no sólo redujo el número de colonias, pero también se redujo el tamaño de las colonias (Figura 6B). Resultados similares se observaron en las células LNCaP (Figura S3C, D).
A). ensayo de formación de colonias dependientes de anclaje. células C4-2 (2000) se cultivaron durante la noche, se trató con las concentraciones indicadas de la curcumina durante 14 días y se examinaron para su capacidad de formación de colonias. Se muestran fotografías representativas. La curcumina mostró una inhibición dependiente de la dosis en el ensayo de formación de colonias dependiente del anclaje. La media ± SE; n = 3; *
p Hotel & lt; 0,05. SEGUNDO). ensayo de formación de colonias de anclaje independiente. células C4-2 fueron sembradas en 0,3% de agarosa y se trataron con concentraciones variables de la curcumina para 9 días. El número de colonias se contaron y se representó gráficamente. el tratamiento de cúrcuma inhibe la formación de colonias de anclaje independiente de las células C4-2. La media ± SE; n = 3;
p * Hotel & lt; 0,01. C) ensayo de agregación de células de la célula. células C4-2 tratados con curcumina (15 mM) o DMSO durante 1 h se recogieron y se ensayaron para la agregación de célula-célula mediante la incubación en condiciones de agitación suave a 37 ° C en presencia de CaCl mM 5
2. Después de 6 h de incubación, se analizó una alícuota de la mezcla de reacción y se fotografió para la agregación de células de células bajo el microscopio de contraste de fase. No se observaron agregados de células grandes de células en las células tratadas de curcumina, en comparación con células de control DMSO. Aumentos original de 100 ×.
la adhesión célula-célula se ve facilitado por la interacción cadherina-cadherina intercelular. El aumento de la localización de la membrana de β-catenina refuerza las interacciones cadherina-catenina y reforzando así las interacciones célula-célula [12]. Con el fin de determinar el efecto de mejorar la localización de la membrana de β-catenina, la curcumina tratada C4-2 y PKD1 sobreexpresan se evaluaron células C4-2 (C4-2-PKD1) para la agregación de célula-célula. tratado curcumina células C4-2 forman agregados de células de células de mayor tamaño en comparación con las células tratadas de control (Figura 6C). Curiosamente, mientras C4-2-PKD1 formó agregados de células grandes, no se observaron agregados de célula-célula mucho más grandes en el tratamiento de cúrcuma de estas células (Figura S4). Estos datos implican un papel de la curcumina mediada por la activación de PKD1 en la agregación de célula a célula.
La curcumina inhibe la motilidad celular a través de la fosforilación de la cofilina mediada PKD1
Las células cancerosas por lo general presentan una mayor movilidad celular para facilitar la metástasis. Por lo tanto, la capacidad de un agente quimiopreventivo o quimioterapéutico para inhibir la motilidad celular ayudará en la prevención de la metástasis del cáncer. Por lo tanto, se investigó el efecto de la curcumina en la motilidad celular utilizando un "cicatrización de heridas" y ensayos de cámara de Boyden. Comparado con el control, el tratamiento de cúrcuma inhibe la motilidad celular de las células de cáncer de próstata C4-2 en ambos ensayos (Figura 7A, B). Un efecto similar sobre la motilidad celular se observó también en células LNCaP (Figura S3E).
A). ensayo de cero. Se hicieron crecer células C4-2, hasta la confluencia, en placas que contienen insertos ibidi. Los insertos se retiraron de las placas de generar huecos (líneas blancas continuas muestran anchura de la separación; líneas discontinuas bordean el hueco) y se tomaron imágenes de contraste de fase de la misma área de los huecos a intervalos de tiempo variables en la presencia o ausencia de 20 curcumina M. el tratamiento de cúrcuma inhibe la motilidad de las células de cáncer de próstata C4-2. SEGUNDO). ensayo de cámara de Boyden. Números iguales de células C4-2 se sembraron en cámaras de la Boyden y se incubaron en la presencia o DMSO curcumina (20 M) durante 24 h. Se fijaron las células migradas, manchadas, se contaron y se representan. La curcumina inhibe la motilidad de las células C4-2. La media ± SE; n = 3; *
p Hotel & lt; 0,05. DO). Efecto de la curcumina sobre la expresión de actina proteínas de remodelación. lisados totales de células preparados a partir de la curcumina (20 mM) o DMSO tratados fueron procesados C4-2 células por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos. La cuantificación densitométrica de las bandas de proteína normalizado a ß-actina nivel se muestra en el gráfico. tratamiento curcumina indujo un marcado incremento en la expresión de fosfo-cofilina inactivo en comparación con células de control DMSO tratados. Modificación de importancia menor se observó también en la expresión de Arp3. Au- unidades arbitrarias.
El proceso altamente coordinado de remodelación de actina subyace en el proceso de la motilidad celular. Esta remodelación en la parte delantera creciente requiere la acción orquestada de una serie de moléculas implicadas en la reorganización F-actina. Las proteínas relacionadas con la actina (ARP) juegan un papel importante en la ramificación de los filamentos de actina. La cofilina proteína es una molécula de generación de monómero de actina que está implicada en la remodelación de la actina. Cofilina se activa por tirachinas (SSH) fosfatasa mediada por reacción de desfosforilación y se inactiva por LIM quinasa (LIMK) reacciones de fosforilación mediados por [2], [21]. PKD1 está íntimamente involucrado en la inhibición de la motilidad celular mediante la interacción, fosforilación y la inhibición de las funciones de muchas proteínas relacionadas con la motilidad incluyendo una honda 1 como (SSH1L) fosfatasa [21]. Dado que la curcumina activa PKD1, hemos tratado de investigar el efecto de la curcumina sobre la actividad y los niveles de proteína y cofilina Arp3 por inmunotransferencia. tratamiento de cúrcuma aumentó los niveles de fosfo-cofilina inactivo en las células de cáncer de próstata C4-2 con poco o ningún efecto sobre la expresión de la proteína total (Figura 7C). el tratamiento de cúrcuma también causó una ligera disminución en la expresión de la proteína Arp3. Estos datos sugieren un posible papel de PKD1 en la curcumina mediada por la inhibición de la motilidad celular
a través de la fosforilación de la cofilina
.
En vivo
efectos de la curcumina en el crecimiento del cáncer de próstata
un modelo de xenoinjerto de ratón se utilizó para examinar la
in vivo
efecto de la curcumina sobre el crecimiento del tumor de próstata y β-catenina localización subcelular. Los ratones desnudos se inocularon por vía subcutánea con células C4-2 independientes de andrógenos. Siguiendo el desarrollo del tumor, los ratones se les administró inyecciones intra-tumorales de la curcumina o control del vehículo. En el día 7, se midieron los volúmenes de los tumores y se determinó la tasa de crecimiento del tumor después del tratamiento curcumina. La curcumina inhibió el crecimiento del tumor de manera eficiente por más de dos pliegues en comparación con los ratones tratados con control (*
p Hotel & lt; 0,05) (Figura 8A). Además, se observó cambio en la β-catenina localización subcelular en los tejidos tratados con curcumina tumorales (Figura 8B), similar a
in vitro
observaciones (Figura 3 y 5A). Estos resultados sugieren que la curcumina inhibe el crecimiento del tumor de próstata mediante la modulación de las funciones de β-catenina.
A) Efecto de la curcumina en el crecimiento del cáncer de próstata. Se utilizaron células de cáncer de próstata C4-2 generar xenoinjertos en ratones desnudos masculinos. Siguiendo el desarrollo del tumor, los ratones fueron tratados intratumoralmente con curcumina (n = 4) o DMSO (n = 3). La tasa de crecimiento del tumor se midió después de 7 días y se representa gráficamente el crecimiento ciento tumor después del tratamiento. La curcumina inhibe eficazmente el crecimiento del cáncer de próstata. B) Efecto de la curcumina en la localización β-catenina. Los tejidos tumorales de la curcumina o los ratones tratados de control fueron procesadas para la tinción IHC usando el anticuerpo anti-β-catenina. tinción mejorada de membranosa β-catenina se observó en los ratones tratados con curcumina en comparación con los ratones control. Aumentos originales 400 ×.
Discusión
La desregulación de PKD1, una serina-treonina quinasa, se ha asociado con la progresión del cáncer [2], [4], [6]. PKD1 se expresa en el nivel más alto de la glándula de la próstata y juega un papel fundamental en la fisiología normal de la próstata [9], [10]. El trabajo previo de nuestro laboratorio ha puesto de manifiesto la asociación de PKD1 regulación a la baja con la progresión del cáncer de próstata [3], [11]. Nuestro trabajo previo también ha iluminado el papel de PKD1 de la fosforilación de E-cadherina, la modulación de la motilidad celular y la agregación de célula-célula en células de cáncer de próstata [13]. Además, hemos demostrado PKD1 para interactuar con, fosforila y modula la función de β-catenina [12]. El macrolactona naturales Briostatina 1 activa PKD1 en células de cáncer de próstata [12]. El PKD1 activado fosforila y se transloca β-catenina nuclear del núcleo resulta en la inhibición de la β-catenina /TCF transcripcional actividad [12]. Por lo tanto los compuestos naturales que modulan la activación de PKD1 pueden ayudar en la prevención y tratamiento del cáncer de próstata. La curcumina es un compuesto natural que se encuentra actualmente en ensayos clínicos para la prevención y el tratamiento de diversos tipos de cáncer [33] - [35]. En este estudio, hemos demostrado que la curcumina activa PKD1, atenúa β catenina /TCF transcripcional actividad y enriquece membrana β-catenina que resulta en la supresión del crecimiento del cáncer de próstata.
β-catenina es una proteína multifuncional que juega un papel importante en la ontogénesis y la oncogénesis. En combinación con TCF y p300, funciona como un factor de transcripción en la vía de señalización Wnt [36]. Además, β-catenina, junto con las funciones de E-cadherina en la membrana celular como un componente crítico de la unión adherentes para mejorar la adhesión célula-célula [37]. Así, la desregulación de la β-catenina se ha asociado con el desarrollo de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [36], [38], [39]. Hemos demostrado anteriormente un nuevo mecanismo de regulación de β-catenina a través de la acción de PKD1 [12]. Aquí, hemos puesto de manifiesto que la curcumina activa PKD1 dentro de 1 h de tratamiento (Figura 2B). Además, usando un ensayo de indicador de luciferasa, hemos demostrado que la actividad β-catenina es inhibida por la curcumina, después de la activación PKD1 (Figura 5C).
Desde β-catenina es una importante molécula de señalización, sus funciones son reguladas por múltiples vías [40]. Mientras que la curcumina se ha demostrado que inhiben la β-catenina actividad /TCF transcripción [41], sus mecanismos moleculares precisos no se conocen completamente. Aquí, por primera vez demostrado que la curcumina atenúa β-catenina /actividad de transcripción TCF
vía
activación de PKD1 en células de cáncer de próstata. Los estudios también han informado de la inhibición de la actividad transcripcional β-catenina en el tratamiento de cúrcuma en células de cáncer de colon a través de la caspasa-3 mediada por la degradación de β-catenina [42]. Sin embargo, no se observó una disminución marcada de los niveles globales de expresión de β-catenina en líneas celulares de cáncer de próstata. UN). SEGUNDO). UN). UN). SEGUNDO). * P & lt; 0,05. RE). * P & lt; 0,01.