Extracto
pancreático ductal adenocarcinomas contienen un subconjunto de las células madre del cáncer exclusivamente oncogénicas (CSC), que son capaces de repoblar toda la población heterogénea de células de cáncer y son altamente resistentes a la quimioterapia estándar. Aquí demostramos que la metformina ablación selectiva células madre cancerosas pancreáticas como se evidencia por la disminución de la expresión de genes de pluripotencia asociada y los marcadores de superficie asociados-CSC. Posteriormente, la capacidad de las células madre cancerosas tratados con metformina para ampliar clonal
in vitro
fue irreversible abrogada mediante la inducción de apoptosis. Por el contrario, no CSC preferentemente respondió detención del ciclo celular, pero no se elimina por tratamiento con metformina. Mecánica, metformina aumenta la producción de especies reactivas del oxígeno en el CSC y reduce su potencial transmembrana mitocondrial. La posterior inducción de la crisis de la energía letal en los CAC fue independiente de la AMPK /mTOR. Finalmente, en tejido de cáncer de modelos de xenoinjerto metformina primaria reducido eficazmente la carga tumoral y impedido progresión de la enfermedad; si se combina con un inhibidor de la estroma de metas de suavizado de penetración en el tejido mejorado, mientras que la gemcitabina apareció realmente prescindible
Visto:. Lonardo E, M Cioffi, Sancho P, Sánchez-Ripoll Y, Trabulo SM, Dorado J, et al . (2013) La metformina se dirige a la del talón de Aquiles metabólica de las células madre del cáncer pancreático humano. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10.1371 /journal.pone.0076518
Editor: Anita B. Hjelmeland, Clínica de Cleveland, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2013; Aceptado: 1 de septiembre de 2013; Publicado: 18 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Lonardo y cols. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyada por el CEI para investigadores avanzados Grant (Pa-CSC 233.460), Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 /2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 256974, la Subdirección general de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria ( PS09 /02129), y el Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; tanto Innovación, España Ministerio de Ciencia e). E. L. con el apoyo del Programa Postdoctoral Fellowship Roche. M. C. con el apoyo del Programa de Becas Predoctorales La Caixa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) sigue siendo uno de los cánceres más devastadores, y es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países industriales, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 5% [1]. Muchos factores de riesgo como el tabaquismo, el consumo de alcohol, y la pancreatitis crónica han sido reconocidos como posibles factores de riesgo para el desarrollo de la PDAC [2]. Los estudios epidemiológicos sugieren también que la diabetes mellitus, en particular de tipo 2, se asocia con un riesgo mejorado para PDAC [3], [4]. Por lo tanto, los investigadores se han embarcado en la búsqueda de un enlace putativo entre el uso de medicamentos anti-diabéticos y un menor riesgo para el desarrollo y /o progresión de la PDAC. Sorprendentemente, en un análisis retrospectivo, se encontró que la administración oral de metformina en pacientes con diabetes mellitus tipo II que se asocia con un menor riesgo de desarrollar PDAC [5], así como un mejor resultado en los pacientes con establecido PDAC [6].
El efecto sistémica primaria de metformina (Met) representa una disminución en los niveles de glucosa en sangre a través de la gluconeogénesis hepática reducida y el aumento de la captación de glucosa en los tejidos periféricos [7]. Mecánicamente, la metformina activa indirectamente la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) de señalización [8] y posteriormente inhibe la actividad de mTOR, que se aumenta con frecuencia en las células de cáncer [9] incluyendo células madre de cáncer de páncreas (CSC) como una subpoblación altamente tumorigénico [10]. Este efecto inhibidor de la metformina sobre AMPK resultados /señalización de mTOR en la síntesis de proteína reducida y la proliferación celular [11], [12]. Por otra parte, en establecieron líneas celulares PDAC metformina también es capaz de inhibir PDAC [13]. Curiosamente, otro estudio reciente sugiere que los CAC podrían ser los objetivos de la metformina a través de la re-expresión de miRNAs implicados en la diferenciación, aunque estos datos se basan en la línea de células de cáncer derivado de células madre cancerosas no validados [14].
A diferencia de la mayoría de las células diferenciadas en el tumor, células madre cancerosas han demostrado ser altamente resistentes a la quimioterapia [15]. Por lo tanto, los fármacos que se dirigen selectivamente células madre cancerosas pueden representar un enfoque más eficaz para superar la resistencia y /o tratamiento de la recaída en el PDAC. Aquí, ahora proporcionamos evidencia convincente de que los CAC derivados de un conjunto diverso de PDAC humanos primarios son altamente vulnerables a la reprogramación metabólica por la metformina que resulta en la supervivencia a largo plazo de los modelos preclínicos de ratón.
Resultados
hemos demostrado previamente que las CSC pancreático primario se pueden enriquecer
in vitro
como esferas tridimensionales independientes de anclaje, que están enriquecidas en células con propiedades de células madre [15]. Un total de nueve xenoinjertos PDAC humanos se utilizaron con A6L, 163, 185, 215, 247, 253, y 286 que se describe anteriormente [16], [17], así como 354 y JH029, que se obtuvieron utilizando la misma metodología. Es importante destacar que, para
in vitro
experimentos todas las células estaban recién aisladas de xenoinjertos principios de paso y se cultivaron en pasajes bajos como células adherentes o esferas independientes de anclaje. Esferas se enriquecen en CD133
+ células (Fig. S1A) y varios otros marcadores que se han asociado con un fenotipo CSC en comparación con las células adherentes [18].
metformina disminuye la expresión de marcadores de CSC
en primer lugar, se estableció la expresión del transportador de cationes orgánicos 1, 2, y 3 (OCT1-3) en nuestras células primarias PDAC (Fig. 1A), que son cruciales para la captación celular de metformina. La metformina se usa a concentraciones que no son directamente tóxicos para las células PDAC primarias y células no transformadas pancreáticas (PSC, las células estrelladas pancreáticas; HDPE, ductal humano las células epiteliales pancreáticas) (Fig 1B.), Que son significativamente más bajos en comparación con las concentraciones utilizadas en estudios previos con las líneas celulares (PDAC 10-30 mM) [14]. A continuación, encontramos cambios significativos en los niveles de ARNm de genes CSC (CD133, ALK4, nodales, Activina y Smad2) y genes de pluripotencia-asociado (Nanog, Oct4 y Sox2) después del tratamiento con metformina (Fig 1C;. Cebadores utilizados se listan en la Tabla S1), que también se confirmó a nivel de proteínas (Fig. 1D). Sorprendentemente, la metformina apareció para eliminar preferencialmente células madre cancerosas como las células positivas CSC-marcadores CD133, CD44, CXCR4 y SSEA-1 se redujo, mientras que el fabricante de la diferenciación del epitelio EpCAM aumentó (Fig. 1E).
PDAC células primarias (a) , pero no las células del páncreas normales expresan catión orgánico transportador 1, 2, y 3 (n = 3). (B) Definición del rango terapéutico de la metformina en células primarias PDAC. Número de células cultivadas en presencia de las concentraciones indicadas de metformina durante 24 h (n = 6). análisis (C) qPCR de genes asociados a células madre cancerosas en esferas tratados con 3 mM de la metformina durante 7 días. Se normalizaron los datos para la limpieza de genes y se presentan como el cambio veces en la expresión de genes en relación con las células control (n = 6). (D) Representante de transferencia de Western que ilustra la expresión de proteínas reducida Oct4 en respuesta al tratamiento con metformina (n = 3). (E) El flujo de Representante análisis de citometría de marcadores CSC en esferas tratadas durante 7 días con 3 mM de la metformina en comparación con las esferas sin tratar (panel superior). Resumen de los datos de PDAC-185, A6L, 215, 253, y 354 se muestra (panel inferior; n = 6) guía empresas
La metformina disminuye selectivamente in vitro e in vivo tumorigenicidad
a continuación examinó los efectos funcionales de la metformina sobre la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas. El ensayo de formación de esfera mostró una fuerte disminución en el tamaño de las esferas formadas por metformina (Fig 2A & amp;. S1B) a través de la inhibición de la expansión de las progenies de células madre cancerosas, que representan la mayor parte de las células de las esferas formadas. Aún más importante, se encontró que la metformina disminuyó significativamente el número de esferas en realidad forman con la misma eficacia a las 3 y 10 mM (Fig. 2B). Con el fin de examinar el efecto a largo plazo del tratamiento con metformina en la capacidad de auto-renovación de las células que no mostró diferencia significativa durante la formación de la esfera primer paso (Panc-185 y Panc-215), esferas secundarias y terciarias se iniciaron sin más metformina tratamiento. La formación de esferas en el segundo y tercer pasajes se vio obstaculizado drásticamente lo que sugiere que el tratamiento con metformina irreversiblemente había eliminado la mayoría de las células madre cancerosas mediante la inhibición o supresión de su capacidad de auto-renovación (Fig. 2C). Consistentemente, pre-tratamiento con metformina dio lugar a la formación de menos y más pequeñas colonias en comparación con el control (Fig. 2D). El estándar de oro para la actividad CSC representa
in vivo
tumorigenicidad. La frecuencia de células tumorigénicas derivados de PDAC-354, 215, y esferas A6L era regularmente muy alta con valores por debajo de 1:500 y se hizo enrarecido notablemente por el tratamiento con metformina (Fig. 2E). Finalmente, encontramos que la metformina pretratamiento de células madre cancerosas pancreáticas posteriormente redujo su migratorio (Fig. S2A) y capacidad invasiva (Fig. 2F).
(A) La metformina disminuye el tamaño de las esferas. Imágenes representativas de esferas obtenidas después del tratamiento con metformina durante 7 días. La cuantificación de tamaño de la esfera (n≥6). capacidad de formación (B) de la esfera en la presencia o ausencia de la metformina durante 7 días (n≥6). (C) La capacidad de auto-renovación de las células madre cancerosas aisladas de los tumores que responden mal en términos de capacidad de formación de primera esfera pasaje. Las células fueron continuamente pasaje como esferas secundarias y terciarias tratados con metformina o el vehículo sólo durante la formación de esfera primera generación (n = 6). (D) La formación de colonias para los PDAC-185, A6L, 215, 253, y 354 evidencia por 0,05% de cristal violeta después de 21 días (n = 3). (E) enrarecimiento de
in vivo
células madre del cáncer oncogénicas en las esferas tratadas con metformina en comparación con el vehículo. (F) La invasión de las células derivadas de la esfera después de 24 h de tratamiento con metformina o control (n = 3).
La metformina elimina específicamente células madre cancerosas pancreáticas
duplicación de la población de células adherentes era marcadamente reducida por la metformina con una fuerte variación intertumoral (Fig. 3A). Consistentemente, se redujo la expresión de Ki67 lo que sugiere la inhibición de la proliferación celular (Fig. 3B), lo cual fue confirmado por la reducción de expresión de cyclinD1 en mRNA (Fig. 3C) y el nivel de proteína (Fig. S2B). A continuación, analizamos el perfil del ciclo celular de las células adherentes en comparación con células madre cancerosas mediante citometría de flujo. Curiosamente, los datos mostraron que el efecto funcional de la metformina sobre la progresión del ciclo celular era mucho más marginal para las células esfera derivados que sugiere un mecanismo distinto responsables de su posterior pérdida durante el tratamiento prolongado (Fig. 3D). De hecho, mientras que la metformina no alteró significativamente la tasa de células adherentes apoptóticas como se evidencia por la tinción de AnnexinV /DAPI (1,23 ± 0,37 veces el cambio), que dio lugar a una fuerte inducción de la apoptosis en células esfera derivados (2.95 ± 1.10 veces el cambio; P & lt ; 0,01) (Fig 3E).. Estos datos están en línea con una eliminación preferencial de las células madre cancerosas por metformina, mientras que sus efectos sobre la progenie diferenciada están principalmente relacionados con la inhibición de la proliferación.
(A) Número de células cultivadas en presencia de las concentraciones indicadas de metformina por 24 h. (N = 3). (B) Cuantificación de Ki67 y DAPI en células adherentes después de 7 d de tratamiento con metformina o control (n = 3). análisis (C) qPCR para CyclinD1 en células adherentes y esfera derivados después de 7 días de tratamiento con metformina o control. Se normalizaron los datos para la limpieza de genes y se presentan como factor de cambio en la expresión génica en relación con las células no tratadas (n = 6). análisis (D) del ciclo celular se determina por tinción con yoduro de propidio en células adherentes y esferas después de 7 d de tratamiento con metformina o control (n = 3). análisis (E) Citometría de células apoptóticas mediante doble tinción de anexina V /DAPI después del tratamiento con metformina o el control de adherentes frente a las células derivadas de la esfera (n = 3).
Mecanismo de acción
la metformina uniformemente reducido nivel de ATP tanto en células adherentes y esferas de todo el grupo de tumores investigados incluidos respondedores tardíos (Fig. 4A). Consistentemente, la metformina indujo un aumento dependiente del tiempo de pAMPK en células madre cancerosas (Fig. 4B, panel superior) sin diferencia aparente a la no-CSC (datos no mostrados). Por otra parte, se observó una disminución neta similar en p70S6K, lo que sugiere un bloqueo eficaz de la vía mTOR (Fig. 4B, panel inferior). A medida que la vía mTOR es un regulador central de la autofagia, analizamos si la metformina podría inducir distintivos característicos de la autofagia en las células madre cancerosas dependientes y no dependientes células madre cancerosas, pero nuestros resultados no apoyan la noción de que la eliminación selectiva de las células madre cancerosas por la metformina puede ser racionalizada por alteraciones en autofagia (Fig. S3 A /B). Para proporcionar evidencia adicional de que la vía /mTOR AMPK no está mediando los efectos nocivos de la metformina sobre células madre cancerosas, se investigó si los efectos de la metformina son imitados por el activador directo de la AMPK A769662 y /o el inhibidor de mTOR rapamicina (Rapa). Sorprendentemente, ni formación de esferas (Fig. 4C), ni la formación de colonias (Fig. 4D) se inhibió significativamente por los dos inhibidores, esencialmente, descartando la AMPK /mTOR como el mecanismo de accionamiento de la metformina en la selección de células madre cancerosas pancreáticas.
( A) los niveles celulares de ATP en células adherentes y esferas después de 7 d de tratamiento con metformina o control (n = 3). (B)
Panel superior
: Western blot de pAMPK, la AMPK, y GAPDH en los ámbitos tratados con metformina o control. panel de
Baja
: Western blot de pAMPK, pp70S6K, y GAPDH en células adherentes y esferas tratados con metformina o control durante 7 días (n = 3). (C) efecto global de metformina (3 mM), la inhibición de mTOR (rapamicina; 100 ng /ml), y la activación de AMPK dirección (A769662; 10 M) sobre la formación de esfera y (n = 6). (D) la formación de colonias para los PDAC-215, 253, y 354 células (n = 3). (E) y la producción total mitocondrial (Mito) ROS después de 8 horas de control o el tratamiento con metformina. potencial transmembrana (F) mitocondrial después de 8 horas de control o el tratamiento con metformina.
A continuación, se planteó la hipótesis de que la sensibilidad particular de los CAC a la metformina podría ser atribuible a las propiedades anti-oxidantes a la metformina [19]. De hecho, el tratamiento con metformina aumentó significativamente la producción mitocondrial de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células madre cancerosas derivadas de todos los tumores utilizados, pero estos cambios fueron más pronunciados en respuesta rápidos (PDAC-253 y 354) en comparación con los respondedores tardíos PDAC-215 y 286 (donde los efectos de la metformina no son detectables en la formación de esfera primera generación) (Fig. 4E). Curiosamente, se obtuvieron datos consistentes para el potencial transmembrana mitocondrial, que se redujo más prominente en pacientes con respuesta rápida (Fig. 4F). El uso de la sonda mitocondrial TMRE, se demuestra que en estos tumores metformina disminuye su potencial transmembrana mitocondrial (utilizado como un marcador general de la toxicidad mitocondrial y la inducción de apoptosis), mientras que se mantuvo sin cambios o sólo ligeramente reducida en respondedores tardíos. Este efecto directo sobre las mitocondrias también puede explicar la sensibilidad diferencial entre la falta de células madre cancerosas y células madre cancerosas ya que éste parece ser más dependiente de la mitocondria para la generación de energía, mientras que los no-células madre cancerosas se basan principalmente fuentes de mitocondrias independientes tales como la glucólisis aeróbica (efecto Warburg) [20]. Además, también confirmamos que el efecto de la metformina sobre las mitocondrias es independiente de la AMPK /mTOR ya que ni el activador de AMP A769662 ni el inhibidor de mTOR rapamicina directa eran capaces de imitar los efectos de la metformina (Fig. S4A /B).
la metformina puestos de progresión PDAC in vivo
en primer lugar, se estudiaron los efectos de la metformina
in vivo
utilizando un breve tratamiento con metformina 7 días de la PDAC-185. Durante el posterior seguimiento de 40 días se observó una reducción significativa en el crecimiento del tumor y una remisión completa en 3 de 8 tumores de metformina-ratones tratados en comparación con no remisión en el grupo de control (Fig. S5). Se obtuvieron datos consistentes para otros PDAC con la monoterapia con metformina ser muy eficaz en la inducción de regresión de la enfermedad (Fig. 5A-F). Varias observaciones importantes fueron hechas durante estos estudios. En primer lugar, no se observó toxicidad bruto durante el tratamiento con metformina prolongada como el peso corporal se mantuvo sin cambios (Fig. 5A, panel derecho). En segundo lugar, los tumores recayeron lentamente, pero regularmente después de la retirada de la metformina en día 100 (Fig. 5A, panel izquierdo). En tercer lugar, mientras que la adición de gemcitabina
in vitro
mostró un efecto aditivo sobre la población CSC (Fig. 5C), no hay efecto aditivo podría señalar
in vivo
para metformina más gemcitabina (Fig. 5D)
(A)
Panel izquierdo
:. PDAC tejido-215 fue implantado y el tratamiento se asignó tras toma tumor inicial fue verificada. Los ratones se trataron con gemcitabina (Gem) o metformina (Met). La metformina se suspendió el d100 para poner a prueba el potencial de las lesiones restantes para iniciar la recaída de la enfermedad. Después de recaída de la enfermedad documentada, se volvió a administrar el tratamiento con metformina.
Panel derecho
: El peso corporal durante el tratamiento. (B)
panel de la izquierda
: El análisis histológico: hematoxilina & amp; Eosina (H & amp; E), CyclinD1, y Caspase3.
Panel derecho
: Contenido de células CD44 +. (C) Efectos de
in vitro
tratamiento como se indica en la capacidad de formación de esferas. tejido (D) PDAC-A6L implantado en ratones y tratados como se indica. (E) Contenido de células CD44 + (
panel superior
) y la capacidad de formación de esferas (
panel inferior
). (F) El análisis histológico:. H & amp; E y cytokeratin19 (CK19; n = 6) guía empresas
Estos datos nos llevaron a la hipótesis de que la gemcitabina no se entregó adecuada al tejido PDAC [21] y /o el estroma protegida las CSC de los efectos nocivos de la metformina, promoviendo su stemness y, posteriormente, la resistencia [22]. Por lo tanto, hemos añadido el inhibidor de C1-smoothened SIBI como agente estroma /estrelladas células de metas a la combinación de gemcitabina más metformina. Dado que ya hemos demostrado que la combinación de gemcitabina más alisada inhibidor no previene la recaída [10] y gemcitabina representa en la actualidad el tratamiento estándar para la PDAC, sólo a prueba esta combinación. Además de mejorar la entrega de tejido de gemcitabina, [21] el triple combinación también dio lugar a una duplicación de la concentración de metformina de tejido (23,1 ± 0,82 frente a 10,8 ± 1,9 mg /g). Posteriormente se observó regresión de la enfermedad reproducible (Fig. 6A-C) y, más importante aún, esta combinación también fue eficaz en tumores previamente demostrado ser resistentes a la inhibición de mTOR (Fig. 6D) [23].
( a) tejido PDAC-185 implantado en ratones y tratados como se indica incluyendo el inhibidor de smoothened SIBI-C1. (B) Contenido de EpCAM + y células CD133 +, respectivamente, (
panel superior
) y la capacidad de formación de esferas (
panel inferior
). (C) El análisis histológico: hematoxilina & amp; eosina (H & amp; E) y cytokeratin19 (CK19). resistentes (D) inhibidor de mTOR tejido PDAC-253 implantado en ratones y tratados como se indica (n = 6).
Discusión
Aquí demostramos que las poblaciones heterogéneas de células cancerosas albergaba PDAC en los tejidos humanos primarios difieren en su respuesta a la metformina en función de su nivel de troncalidad. Aunque la mayor parte de las células cancerosas más diferenciadas hace reaccionar con el tratamiento con metformina con la detención del ciclo celular, un subconjunto de células con características stemness distintas, a saber, células madre cancerosas en realidad experimentó una rápida muerte apoptótica debido a la crisis de la energía. Aunque el efecto más evidente para el tratamiento con metformina en esferas primarias fue una marcada reducción de tamaño de la esfera consistente con una tasa de proliferación reducida de las células más diferenciadas albergado en estas esferas, pasos en serie posterior de las esferas reveló claramente su pérdida casi completa e irreversible de clonogénico capacidad de propagación, a pesar del hecho de que el tratamiento con metformina se detuvo ya después de la primera paso. Estos datos demuestran que la metformina prácticamente agotado la fracción CSC, pero también son consistentes con la noción de que no CSC no reponer la piscina CSC de páncreas después de la terminación del tratamiento con metformina. En consonancia, el trasplante de las células pretratadas en ratones inmunodeprimidos reveló que la tumorigenicidad de las células fue de hecho reduce drásticamente por la exposición a corto plazo a la metformina. Lo más importante, sin embargo,
in vivo
tratamiento de cánceres humanos primarios establecidos respondió fuertemente a la metformina con la regresión de la enfermedad y la estabilización de la enfermedad subsiguiente.
El mecanismo de acción identificadas por la metformina en los CAC se ha mantenido en gran parte desconocida . La mayoría de las investigaciones en las células tumorales a granel apoyan un modelo de trabajo simplificado en el que la metformina ejerce efectos anti-tumorales mediante la activación de AMPK indirectamente seguido por la supresión posterior de mTOR [8]. Directamente orientación mTOR con rapálogos también ha sido considerado como un objetivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Si bien esto fue eficaz en pacientes con varios tipos de cáncer [24], los estudios preclínicos en PDAC no sugirió una velocidad particular de respuesta alta (23%) [23]. Es importante destacar que uno de los tumores insensibles en ese estudio fue PDAC-215, que hemos sido capaces de probar también en el presente estudio el uso de la metformina. Células madre cancerosas derivadas de este tumor mostraron una inhibición de la formación de la esfera sólida secundaria
in vitro
y la regresión del tumor eficiente
in vivo
. Por otro lado, la activación directa de mTOR por A769662 o la inhibición de mTOR por rapamicina no imitan los efectos fuertes que hemos logrado con metformina lo que sugiere que los efectos del tratamiento de la metformina en células madre cancerosas pancreáticas son independientes de las alteraciones del eje AMPK /mTOR.
células PDAC Humanos son conocidos por su tolerancia inherente a la inanición nutrición, lo que les permite sobrevivir en un microambiente tumoral hipovascular (austeridad). Es un paradigma emergente que las células madre normales se caracterizan por la glucólisis aeróbica predominante y suprimen la oxidación mitocondrial con posteriormente menor producción de ATP mitocondrial y la liberación de ROS [25]. Nuestros datos están en línea con la noción de que los CAC pancreáticas en realidad tienen un perfil metabólico altamente mitocondrial dependiente, que está en fuerte contraste con las células madre normales, sino que también las distingue de las células cancerosas a granel. Previamente se ha demostrado que la metformina se acumula lentamente 1.000 veces dentro de la mitocondria y directamente inhibe Complejo 1 (NADH deshidrogenasa), que se transloca cuatro protones de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, produciendo de este modo un gradiente de protones. La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa se acoplan por este gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, y su inhibición parece ser particularmente letal para células madre cancerosas [26]. Por lo tanto, los medicamentos como la metformina que se dirigen al metabolismo oxidativo mitocondrial representan poderosas herramientas terapéuticas para atacar a la piscina CSC.
La capacidad de la metformina para eliminar selectivamente células madre cancerosas está en marcado contraste con los efectos de gemcitabina, un fármaco quimioterapéutico que mata las células cancerosas a granel, pero no las células madre de cáncer [15]. Sobre la base de sus propiedades distintas, la metformina debe estar en sinergia con gemcitabina para reducir tanto los no-células madre cancerosas y células madre cancerosas en la población mixta. De hecho, se ha demostrado recientemente en cuatro genéticamente diferentes tipos de líneas celulares de cáncer de mama que la metformina mata selectivamente células madre cancerosas y que la combinación de metformina y el agente quimioterapéutico doxorrubicina estándar mataron ambas células madre cancerosas y no CSC
in vitro como
así como la masa tumoral reducida y remisión prolongada de manera más eficaz
in vivo
que cada fármaco por separado [27]. Si bien pudimos confirmar esta hipótesis para el PDAC
in vitro
, nuestro
in vivo
estudios de tratamiento sugieren que la gemcitabina es realmente prescindible, siempre y cuando la metformina se continuó durante todo el estudio. Si bien estos datos sin duda merecen una mayor validación parece razonable especular que la monoterapia con metformina podría representar una opción de tratamiento novedoso para los pacientes que son demasiado frágiles para tolerar los efectos secundarios del agente quimioterapéutico gemcitabina [28].
Por desgracia, sin embargo , todos los tumores ensayados finalmente progresaron bajo terapia con metformina. Queda por determinar si células madre cancerosas expuestas a tratamiento con metformina a largo plazo cambian su fenotipo metabólico haciéndolos resistentes a los efectos de la metformina sobre las mitocondrias (resistencia adquirida) o si una subpoblación preexistente de células madre cancerosas en realidad es resistente a la metformina y, finalmente, se convierte en el clon dominante (hereditaria resistencia). Esta cuestión debe abordarse en estudios futuros mediante la comparación de células madre cancerosas aisladas de tumores que retrocedido en tratamiento con metformina y células madre cancerosas aisladas de los tumores que con el tiempo evolucionaron en las mismas condiciones. Extensa caracterización de clones resistentes debería proporcionar información crucial acerca de si esto es en realidad línea de opciones de tratamiento pueden prevenir o segundo podrían ser ofrecidos.
Es importante destacar que, el inhibidor sin embargo, la adición de un estroma focalización alisado aparece obligatoria para conseguir más fuerte y más largo las tasas de respuesta duradera. La explicación más probable podría ser doble. Un factor que contribuye al fracaso de las terapias sistémicas puede ser el abundante contenido del estroma tumoral que es la característica del PDAC. El estroma representa la mayoría de la masa tumoral, y se compone de una variedad dinámica de los componentes de la matriz extracelular y células no neoplásicas incluyendo fibroblástica, vascular, y las células inmunes. El trabajo reciente ha revelado que el estroma apoya CSC, [18], [22], [29] promueve la invasividad y la metástasis, así como al mismo tiempo sirve como una barrera física para la administración de fármacos [21]. Por lo tanto, la inhibición vía hedgehog, además de proporcionar un mejor acceso de fármaco administrado por vía sistémica, puede también abrogar el nicho de CSC haciéndolos más susceptibles a los efectos del tratamiento con metformina y /o gemcitabina. Futuros estudios más amplios tendrán que mostrar si el desarrollo de la resistencia se puede prevenir eficazmente por esta estrategia de tratamiento.
Se puede argumentar que las concentraciones de metformina utilizadas en nuestros
in vitro
estudios, si bien ya significativamente más bajos que los utilizados en los estudios anteriores, siguen siendo no alcanzable
in vivo
y por lo tanto irrelevante desde un punto de vista mecanicista. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la metformina se acumula en los tejidos y en particular en las mitocondrias a concentraciones varias veces más altos que los medidos en la sangre [26]. Esto es particularmente cierto para las células que están equipadas con los respectivos transportadores pertinentes para la absorción de la metformina, es decir OCT1-3. Como se muestra aquí, las células PDAC expresan las tres isoformas, pero muestran particularmente alta expresión de OCT1. Si bien es difícil evaluar las verdaderas concentraciones de metformina intracelulares en células PDAC debido al contenido de estroma masivo y áreas de necrosis en tumores recogidos, nuestro análisis de la concentración de metformina reveló concentraciones más altas de metformina en el tejido PDAC (10,8 mg /g de tejido) que en el hígado (8,9 mg /g) y más aún si la metformina se administró en combinación con el inhibidor de smoothened SIBI-C1 (23,1 mg /g). Por lo tanto, nuestra mecanicista
in vitro
estudios son de hecho muy relevante para el
in vivo
ajuste.
La metformina lleva un perfil de seguridad excepcional, ya que sólo los hepatocitos, pero no otra no las células transformadas (tallo) expresan PTU para su captación celular eficaz de metformina. Varios ensayos clínicos (NCT01210911, NCT01167738 y NCT01488552) están probando actualmente metformina en PDAC localmente avanzado y metastásico. Se espera que esto proporcionará una evaluación definitiva de los efectos clínicos de la metformina en PDAC. Sería de especial interés si los pacientes también en última instancia, el progreso durante el tratamiento con metformina y si esto podría ser evaluado y /o predicho por el análisis de las células cancerosas circulantes (STEM). Su aislamiento prospectivo durante la recaída puede proporcionar importantes conocimientos sobre mecánica sobre la causa de la recaída.
Materiales y Métodos
Las muestras tumorales
Después de escrito el consentimiento informado se había obtenido de los pacientes, el exceso de tejidos de carcinomas pancreáticos resecados fue de xenoinjerto en Johns Hopkins Medical Institutions (Ética aprobación de la junta: JHMIRB: 05-04-14-02 "un estudio de factibilidad para el tratamiento individualizado de los pacientes con cáncer pancreático avanzado") y el hospital de Madrid - Centro Integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 "creación de un banco de tumores y el tejido sano en pacientes con cáncer"), respectivamente, bajo los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional indicadas [30]. En pocas palabras, el exceso de tejidos tumorales que no sean indispensables para el diagnóstico clínico de rutina durante las resecciones Whipple realizadas por los cirujanos que no participaron en el presente estudio se implantaron posteriormente en ratones inmunodeprimidos. Toda la información del paciente se hizo anónimo por la eliminación de cualquier información, que identifica, o podría conducir a la identificación de la paciente. Ninguno de los pacientes había sufrido la radiación o la quimioterapia neoadyuvante antes de la resección del tumor.
PDAC células humanas primarias
Para los estudios in vitro, se picaron fragmentos de tejido, digeridos enzimáticamente con colagenasa (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Colombia) durante 90 min a 37 ° C [10] y después de la centrifugación durante 5 min a 1200 rpm los sedimentos se resuspendieron y se cultivaron en RPMI, 10% de FBS y 50units /ml de penicilina /estreptomicina. Para algunos experimentos, la línea celular humana PDAC L3.6pl se utilizó como se describe anteriormente [15].
madre del cáncer de células enriquecedora Cultura y
esferas PDAC se generaron y se expandieron en DMEM-F12 ( Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con B-27 (Gibco, Karlsruhe, Alemania) y bFGF (PeproTech CE, Londres, Reino Unido). 10
3 Se sembraron las células /ml en placas de fijación ultra-bajas (Corning BV, Schiphol-Rijk, Países Bajos), como se describe anteriormente [31] Después de 7 días de incubación, las esferas fueron típicamente & gt;. 75 micras grande con ~ 97% CD133high. Para pasos en serie, esferas 7 días de edad se recogieron usando 40 micras coladores celulares, disociadas a las células individuales con tripsina, y luego volver a crecer durante 7 d.