Extracto
La activación de la señalización de Wnt debido a la incapacidad para degradar β-catenina se encuentra en & gt; 85% de los cánceres colorrectales. Aproximadamente la mitad de los cánceres de colon expresar una proteína KRAS constitutivamente activa. Una fracción significativa de los pacientes muestran ambas anomalías. Hemos informado anteriormente de que la simultánea baja regulación de ambas β-catenina y KRAS era necesaria para inducir una inhibición significativa de la muerte celular y el crecimiento tumoral de células de cáncer colorrectal. Aunque atractiva, un enfoque terapéutico basado en RNAi está todavía lejos de ser empleados en el ámbito clínico. Por lo tanto, hemos tratado de recapitular nuestros resultados anteriores con el uso de inhibidores de molécula pequeña de β-catenina y KRAS. Mostramos aquí que la β-catenina inhibidores PKF115-584 y pyrvinium de pamoato de bloques de β-catenina dependientes de actividad transcripcional y la sinergia con el inhibidor de KRAS
S-trans, trans del ácido
-farnesylthiosalicylic (FTS, salirasib) en el colon células de cáncer impulsados por señales oncogénicas Wnt y KRAS, pero no en células que portan mutaciones de BRAF. El uso combinado de estos compuestos fue superior a la utilización de cualquier fármaco solo en la inducción de la detención del crecimiento celular, la muerte celular, MYC y survivin abajo de la modulación, y la inhibición de crecimiento independiente de anclaje. Análisis de la expresión de los genes del cáncer relevantes seleccionados reveló baja regulación de CD44 como una respuesta común a los tratamientos combinados. Estos datos proporcionan una prueba de principio para una estrategia terapéutica en el cáncer colorrectal combinación
Visto:. Mologni L, Brussolo S, M Ceccon, Gambacorti-Passerini C (2012) Efectos sinérgicos de Combinado Wnt /KRAS inhibición en Colorrectal Células cancerígenas. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10.1371 /journal.pone.0051449
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 16 Agosto, 2012; Aceptado: 31 Octubre 2012; Publicado: 5 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Mologni et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Asociación italiana para la Investigación del cáncer (AIRC), Fundación Cariplo, el Ministerio de Salud de Italia y de Gobierno regional de Lombardía. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los recientes avances en nuestra comprensión de la biología del tumor han demostrado que, a pesar de su gran heterogeneidad, las células cancerosas a menudo siguen dependiendo de un subconjunto limitado de defectos genéticos para su supervivencia. El éxito de las terapias dirigidas en la LMC, GIST y subgrupos de NSCLC indica claramente que incluso la enfermedad avanzada necesita la función de sus fundadores oncogenes para crecer y sobrevivir [1], [2]. Este fenómeno, conocido como "adicción oncogén", ofrece la base para la terapia dirigida contra el cáncer, lo que debería ser, idealmente, desprovisto de efectos secundarios no deseados sobre las células normales [3].
El cáncer colorrectal (CRC) se caracteriza por bien defectos genéticos: conocidas: la gran mayoría (70-95%) de los CCR esporádicos llevan mutaciones que hiperactivar la vía Wnt, en última instancia conduce a la expresión del gen β-catenina que dependen anormal [4], [5], [6], [7]. Estas alteraciones ocurren temprano durante el desarrollo del tumor [8] y probablemente representan adictivos lesiones para el tumor. De hecho, la baja regulación de β-catenina induce la detención del crecimiento y la diferenciación de las células CRC [9]. Sin embargo, la orientación β-catenina no puede matar a las células [9], [10], [11]. Esto puede estar relacionado con el hecho de que CRCs llevar a una variedad de mutaciones adicionales que también parecen ser relevantes para la supervivencia. Por ejemplo, KRAS mutaciones activantes están presentes en aproximadamente el 35-50% de los cánceres de colon [4], [6], [12], [13], [14]. Si la dotación completa de los miembros de la vía Ras se tiene en cuenta, incluyendo ANR, BRAF, NF1, RASSF1A y receptores tirosina quinasas aguas arriba, a continuación, el 60-80% de los tumores muestran alteración de la vía [7], [15], [16 ]. los datos de secuenciación del genoma reveló que aproximadamente el 30-60% de las muestras de CRC albergan ambas mutaciones vía Wnt y Ras al mismo tiempo [6], [7], [16]. Los últimos modelos de ratones transgénicos de CRC destacaron la importancia tanto de Wnt y KRAS señalización en la génesis de tumores de colon [15], [17], [18]. Por lo tanto, doble focalización podría ser necesario con el fin de lograr importantes efectos terapéuticos.
En nuestro trabajo anterior, hemos demostrado que el silenciamiento de β-catenina y KRAS combinado shRNA mediada por células en CRC dado lugar a la inducción de la apoptosis masiva de
in vitro
y la supresión del crecimiento tumoral
in vivo
, mientras que la focalización individual en cualquiera de las dos vías mostró efectos modestos [19]. Aquí, intentamos traducir nuestras conclusiones en un enfoque farmacológico. Dos compuestos no relacionados con diferentes mecanismos de acción, PKF115-584 y pamoato pyrvinium, se utilizaron para bloquear β-catenina dependiente de la transcripción. PKF115-584 es un inhibidor de molécula pequeña potente y específico de la interacción β-catenina /TCF4 y ha sido validado como un inhibidor de la señalización de Wnt en diferentes modelos de cáncer [20], [21], [22], [23]. Pyrvinium es un fármaco antihelmíntico [24] que se ha demostrado que induce la degradación de β-catenina y de su co-factor pygopus, a través de la activación de la caseína quinasa 1α [25].
S CD -
trans
,
trans
ácido -farnesylthiosalicylic (FTS, salirasib) ha sido descrito como un inhibidor de RAS específica [26]. FTS imita el carboxi-terminal
S
-farnesylcysteine mediación de reclutamiento de las proteínas ras a la membrana celular. Como consecuencia, FTS interrumpe selectivamente la asociación de RAS crónicamente activa con la membrana, bloqueando así su función [27], [28], [29].
Hemos encontrado que la combinación de la β-catenina inhibidores PKF115 -584 y pamoato pyrvinium con el inhibidor de RAS FTS induce sinérgicamente la detención del crecimiento y la apoptosis en células de CRC que albergan tanto Wnt y la activación aberrante KRAS. Estos datos representan una prueba de principio para la inhibición de Wnt /RAS combinada en el cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Líneas celulares, anticuerpos e inhibidores
SW837 fueron una especie de regalo de Dra Manuela Gariboldi (IFOM, Milán, Italia) que en un principio los obtuvo de la ATCC. Unidad de Biología Celular IFOM confirmó su identidad mediante la genotipificación de microsatélites. Todas las demás líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection, donde se verifican de forma rutinaria usando genotípica y fenotípica pruebas para confirmar su identidad. células LS174T y HCT-116 llevan mutaciones en el gen CTNNB1 que estabilizan la proteína β-catenina [30]. DLD-1, SW480, LoVo y SW837 células tienen un gen truncado APC [31], [32]. Estos seis líneas de células expresan una proteína constitutivamente activado KRAS [33], [34], [35]. líneas de células Colo-201 HT-29 y tienen KRAS no mutado, pero albergan un mutante BRAF
V600E alelo [33], [36]. anotación completa de estas mutaciones se presentan en la Tabla S1. células LS174T transfectadas de forma estable con construcciones shRNA doxiciclina-inducible se han descrito anteriormente [19]. Todas las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (excepto DLD-1 que se cultivaron en DMEM y LoVo en nutrientes F12 de Ham) complementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 2 mmol /L L -glutamine, y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 atmósfera. células LS174T con inducible β-catenina y KRAS shRNA fueron descritas anteriormente [19]. Los siguientes anticuerpos se utilizaron en este estudio: anti-KRAS (Abnova, clon 4F3, se diluyó 1:1000), anti-pygopus (biotecnología Santa Cruz, H-216, 1:200), anti-myc (Santa Cruz Biotecnología, 9E10 , 1:200), anti-actina (Sigma-Aldrich, 1:2000), anti-survivina (biotecnología Santa Cruz, D-8, 1:200), anti-β-catenina (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 fue proporcionado amablemente por Novartis, Inc. (Basilea, Suiza).
S CD -
trans
,
-farnesylthiosalicylic ácido trans gratis (FTS) se sintetizó como se describe [26]. Pyrvinium pamoato se adquirió de Sigma-Aldrich. Todos los inhibidores se disolvieron en DMSO y se almacenan en pequeñas alícuotas a -20 ° C.
crecimiento celular y la muerte celular ensayos
El crecimiento celular y la viabilidad se evaluó a los tiempos indicados utilizando el CellTiter 96® Una solución acuosa de la célula Sistema de Ensayo de proliferación (Promega Corporation) siguiendo las instrucciones, como se informó anteriormente [37]. Para evaluar la inducción de la apoptosis, las células se sembraron en placas de 6 pocillos durante la noche y después se trata con inhibidores o vehículo. Después de 72 horas, las células se despegaron con tripsina, se lavaron, y la apoptosis se determinó utilizando el kit Annexin V-FITC Apoptosis Detección (Bender MedSystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los gráficos y IC
50 valores se generaron utilizando el software GraphPad.
luciferasa Dual ensayo
Las células en placa de 6 pocillos fueron tratados con inhibidores o vehículo y se transfectaron con 2 g de TOPflash o plásmidos FOPFLASH y 0,1 g de phRL-CMV (codificación para
Renilla luciferasa
, usado como un control interno para la eficiencia de transfección) con 3 l de FuGENE
TM 6 reactivo. Después de 24 horas, se recogieron las células, se lavaron, y se lisaron. señales de luciferasa se detectaron mediante el sistema de doble Luciferase® Reporter Assay (Promega). Firefly intensidad de la luciferasa se normalizó sobre la señal de luciferasa de Renilla
KRAS activo desplegable ensayo
Las células fueron tratadas con FTS o DMSO durante 15 horas y después se lisaron en tampón de lisis de magnesio (MLB: 25. Hepes mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl 10
2, 1% NP-40, desoxicolato de 0,25% de sodio, 10% de glicerol) que contiene inhibidores de proteasa (10 mmol /L de benzamidina-HCl y 10 mg /ml de cada uno de aprotinina, leupeptina y pepstatina A). Los lisados se clarificaron por centrifugación a la velocidad máxima y se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford. La misma cantidad de proteínas totales (1 mg) se incubaron con 10 g de Raf-1 perlas de agarosa RBD (Millipore) durante 45 minutos a 4 ° C en una rueda giratoria. Después de 3 lavados con MLB, las perlas se resuspendieron en tampón de muestra 2X Laemmli, hirvieron y se cargaron en SDS-PAGE. Activo, tirado hacia abajo KRAS fue revelada por el anticuerpo anti-KRAS. KRAS total (entrada) se evaluó a partir del lisado crudo.
análisis Sinergismo
Las células se trataron con vehículo o inhibidores, solo o en combinación a diferentes concentraciones y diferentes proporciones. Después de 3 días, las células se dividieron 1:10 y se sembraron de nuevo en presencia de inhibidores. En el día 6, el cultivo de células de crecimiento /viabilidad se monitorizó por el ensayo de MTS. crecimiento relativo, en comparación con los controles tratados con vehículo, se utilizó para calcular la fracción afectada y el índice de combinación para cada combinación experimental, utilizando el software Calcusyn.
Western Blot
Las células fueron cosechadas, se lavó con PBS helado y se resuspendieron en tampón de lisis como se describe [19]. extractos de células totales se cargaron en SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sondearon con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C. Las proteínas fueron reveladas por quimioluminiscencia después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (GE Healthcare, se diluyó 1:2500).
Soft-agar ensayo de colonias
Diez mil células fueron incorporados en RPMI que contiene el indicado compuestos y 0,3% bajo punto de fusión de agarosa tipo VII (Sigma-Aldrich) y se sembraron en la parte superior de una capa de soporte de agarosa /RPMI 0,5% en placas de 6 pocillos. Los inhibidores se añadieron frescos cada 7 días a la capa de agar superior. Las colonias se contaron después de 20 días.
Cuantitativa en tiempo real PCR
Las células se trataron con vehículo o con inhibidores durante 24 o 72 horas y se recogieron. El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen) y retrotranscrito con hexámeros aleatorios usando un procedimiento estándar. Para el conjunto de genes matriz de 96 pocillos, avance y retroceso mezcla de cebadores (5 pmol cada uno) fue descubierto en el pozo correspondiente para cada gen diana y las placas se mantuvieron congeladas a -80 ° C hasta que se necesite. La mezcla de reacción (2 ADNc l, 10 l Brilliant III Ultra-Fast QPCR SYBR verde Master Mix y 7 l de agua, por pocillo) se añadió a las placas pre-hechos y PCR cuantitativa se llevó a cabo en un sistema de detección de Stratagene MX3000P, bajo las siguientes condiciones: 95ºC, 3 min (1 ciclo); 95 ° C, 10 seg, 60 ° C, 20 seg (40 ciclos). La carrera de confirmación se realizó por triplicado usando el protocolo de PCR en tiempo real estándar recomendado por el fabricante. El gen GAPDH limpieza siempre se utilizó como referencia interna. Los cebadores para GAPDH eran TGCACCACCAACTGCTTAGC (hacia adelante) y GGCATGGACTGTGGTCATGAG (hacia atrás). Los cebadores para todos los demás genes se enumeran en la Tabla S2.
Resultados
PKF115-584 (figura 1A) y pamoato pyrvinium (figura 1B) han demostrado que interfiere con la β-catenina complejo transcripcional -asociado a través de diferentes mecanismos. Con el fin de verificar la actividad de los dos fármacos en células de CRC, que caracteriza sus efectos en la línea celular LS174T, llevando β-catenina y KRAS mutaciones activadoras [30], [33]. Esta línea celular fue elegido inicialmente como un modelo, ya que fue utilizado anteriormente para caracterizar los efectos de siRNA mediada por silenciamiento de genes [19]. Como se informó en la figura 1D-E, ambos fármacos inhiben el crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis. inhibición del crecimiento similar se obtuvo en las células DLD-1, que expresan un alelo APC truncada (figura S1A-B). Al mismo tiempo, los dos compuestos inhiben la transcripción de la β-catenina /TCF4 sensible plásmido reportero TOPflash (figura 1G-H). El IC
50 valores observados para la proliferación celular y curvas TOPflash están de acuerdo, lo que sugiere que la detención del crecimiento está mediada por la inhibición de β-catenina. Como era de esperar, pyrvinium pérdida de la expresión inducida pygopus (figura 1C). El mismo resultado se obtuvo en las células DLD-1 (Figura S1E). Además, pyrvinium ha informado a la fuerza β-catenina degradación [25]. Sorprendentemente, la expresión de β-catenina se mantuvo sin cambios en las células DLD-1 pyrvinium tratados (figura S1e), mientras que disminuyó ligeramente en las células LS174T (figura 1C). El análisis de secuenciación del gen de la β-catenina confirmó la presencia de la sustitución S45F en las células LS174T y la secuencia de tipo salvaje en las células DLD-1 dentro de la región de fosforilación N-terminal (Figura S2). Ambos fármacos bloquean la expresión endógena de MYC, un objetivo transcripcional conocido β-catenina y un fuerte promotor de crecimiento de las células (Figura 1J-K y la figura S1D-E). Para confirmar la inhibición de la vía Wnt, la expresión de dos genes adicionales diana conocidos se analizó por PCR en tiempo real cuantitativa. Tanto AXIN2 y CCND1 (ciclina D1 codificación de) los genes se redujeron reguladas por el tratamiento con PKF115-584 y pyrvinium (Figura 1 M-N).
(A-C) Las estructuras químicas de PKF115-584, y pyrvinium FTS, como se describe anteriormente (ver ref. 20 a 29) (D-F) efectos de dosis-respuesta de PKF115-584, pyrvinium y FTS sobre el crecimiento de células LS174T. Las células se expusieron a dosis crecientes de cada inhibidor durante 72 horas. ensayo de MTS se utilizó para evaluar el efecto de los compuestos sobre la proliferación celular. IC
50 valores se muestran para cada compuesto. se determinó (G-H) La actividad de luciferasa a partir del plásmido TOPflash después de la incubación durante 24 horas con o PKF115-584 pyrvinium. Los valores son unidades de luz relativas (RLU) con células tratadas con DMSO establecidos como 1,00. (I) Análisis de transferencia Western de activo KRAS desplegable GTP-cargado (panel superior) y KRAS totales (parte inferior) a partir de células LS174T tratados con FTS. (J-L) análisis de transferencia de Western que muestra la expresión de c-myc en células LS174T tratados con concentraciones crecientes de cada compuesto durante 48 horas. A partir de células tratadas con pyrvinium, pygopus y expresión β-catenina también se muestran (K). Actina siempre se muestra como control de carga. (M-N) Análisis cuantitativo de PCR de AXIN2 y expresión D1 CCND1 /ciclina después del tratamiento con dosis crecientes (0,125 a 1,0 M) de PKF115-584 (M) y pyrvinium (N). (O) El análisis de transferencia Western de la fosforilación de MEK en células tratadas con FTS. MEK total y la actina se muestran como controles. (P-Q) Las curvas de dosis-respuesta de PKF115-584 y pyrvinium en ausencia (círculos vacíos) o (círculos rellenos) de presencia de 100 mM FTS. Cada curva individual es normalizado en la correspondiente muestra sin inhibidor β-catenina.
Los FTS inhibidores de RAS (figura 1C) inhibe el crecimiento de células en concentraciones micromolares altas (Figura 1F y la figura S1C), en línea con los informes anteriores [38], [39], [40]. FTS agotan la (activo) de la piscina KRAS GTP-cargado, dejando cantidad total KRAS sin cambios (figura 1I). Esta actividad anti-KRAS traducido en una marcada disminución de los niveles de myc (figura 1 l) y la fosforilación de MEK (Figura 1O), pero no de la expresión de FOS (datos no mostrados) en las células LS174T. Sin embargo, el tratamiento FTS dio lugar a diferentes respuestas moleculares en las células DLD-1: señal de fosfo-MEK no fue modificado y MYC fue afectada de forma mínima, mientras que la expresión FOS disminuye considerablemente (figura S1F). Para evaluar si la actividad antiproliferativa de los inhibidores de β-catenina podría ser potenciada por el FTS, las curvas de dosis-respuesta se generaron mediante la exposición de las células LS174T a dosis crecientes de PKF115-584 (figura 1P) y pamoato pyrvinium (figura 1T) en ausencia o presencia de 100 mM FTS. En ambos casos, la adición de FTS desplazó la curva de manera significativa. En particular, la sensibilidad a pyrvinium aumentó en alrededor de 10 veces (IC
50 pyrvinium, 0,1 M; IC
50 pyrvinium + FTS, 0,01 M). Estos resultados en conjunto indican que los efectos anti-proliferativos de dos inhibidores de la β-catenina y los RAS con inhibidor FTS se correlacionan con la inhibición específica de las actividades de KRAS β-catenina y, respectivamente, en las células LS174T. Por otra parte, el FTS potencia la citotoxicidad de inhibidores de β-catenina en estas células.
Con el fin de definir mejor la cooperación de β-catenina y la inhibición del gen KRAS en las células de CRC, la actividad de PKF115-584 y pyrvinium, solo y en varias combinaciones con FTS, se puso a prueba mediante el ensayo de MTS en un panel de líneas celulares de CRC que llevan diferentes mutaciones oncogénicas (tabla S1). Los resultados obtenidos a concentraciones fijas se muestran en la figura 2 como gráficos de barras (PKF115-584: 125 o 250 nm; pyrvinium: 50 nM; FTS: 100 M). Curiosamente, mientras que la sensibilidad a los agentes individuales difería entre las diferentes líneas celulares, en todas las células KRAS mutado los tratamientos combinados causaron la inhibición del crecimiento significativamente mayor en comparación a los tratamientos individuales. entonces sinergismo se estudió más extensamente en un rango de concentraciones de inhibidores, utilizando el método descrito por Chou y Talalay, basado en el principio de la ley de acción de masas [41]. Los valores del índice de combinación (IC) se calcularon a partir de los datos experimentales a lo largo de toda la gama de efectos fraccionarios y se muestran como gráficos XY en la Figura 2. Los valores específicos de CI en DE50, DE90 Ed75 y se exponen en la Tabla 1. Como se predijo por el estado de mutación del oncogén, todas las líneas celulares que portan mutaciones, tanto en vía Wnt (APC o β-catenina) y KRAS mostraron interacciones sinérgicas (CI & lt; 1), excepto en los puntos extremos de la fracción afectadas, donde los efectos son insignificantes o demasiado fuerte. En contraste, las células HT-29 (que llevan de tipo salvaje KRAS y BRAF mutado un
alelo V600E) no mostraron sinergismo. Por el contrario, los efectos antagónicos (IC & gt; 1) No se notó. Sin embargo, la combinación de PKF115-584 con un inhibidor de BRAF (PLX-4032) mostró sinergismo débil en células HT-29 a dosis altas (Figura S3). Los datos adicionales obtenidos con pyrvinium /FTS en dos KRAS- y una líneas celulares BRAF mutado se muestran en la figura S4. En general, el análisis de los valores de CI en ED50 (pyrvinium /FTS) muestra una correlación entre KRAS /BRAF estado mutacional y la interacción sinérgica (p = 0,0021): todos los KRAS células mutantes mostraron sinergismo, mientras que ninguno de los dos líneas de células mutante BRAF hicieron (Figura S5) , aunque el número limitado de líneas celulares mutante BRAF probados no permite extraer conclusiones definitivas. En contraste, los efectos no se correlacionaron con p53 o el estado MSI (tabla 1). En conjunto, estos resultados sugieren que PKF115-584 y pyrvinium se pueden combinar con FTS en células CRC albergar anormalidades genéticas concomitantes Wnt /KRAS, para lograr mejores efectos terapéuticos
.
Las líneas celulares indicadas se cultivaron durante 6 días en el presencia de inhibidores como agentes únicos o en combinación, o vehículo solo. ensayo de MTS se utilizó para evaluar los efectos de cada tratamiento sobre el crecimiento del cultivo de células y la viabilidad. (A) PKF115-584 /FTS y (B) pyrvinium combinación /FTS. Para cada línea celular, el gráfico de barras (izquierda) muestra el efecto de una dosis única (PKF115-584, 0,25 M [LS174T y DLD-1] o [M 0,125 SW480 y HCT-116]; pyrvinium, 50 nm; FTS, 100 M). El gráfico XY (derecha) muestra los índices de combinación como una función de la fracción afectada (véase Materiales y Métodos). Para cada línea celular, los genes que están mutados, afectando Wnt y Ras vías, se indican entre paréntesis. CTRL = control; Pyrv = pyrvinium. En todos los paneles, los símbolos de número (#) indican importancia en comparación con el inhibidor de β-catenina (PKF115-584 o pyrvinium); asteriscos (*) indica la significación frente FTS; un símbolo, p & lt; 0,05; dos símbolos, p & lt; 0,01; tres símbolos P & lt; 0,001.
A continuación, caracterizan, además, las combinaciones sinérgicas utilizando ensayos independientes adicionales (Figura 3 y Figura S6). El crecimiento celular se controla durante el curso de varios días, después de exponer LS174T y células DLD-1 para los tres fármacos, solos o en combinación, lo que demuestra que FTS potenciada PKF115-584 y pyrvinium toxicidad ya después de 3-4 días (Figura 3A y figura S6A). La inhibición del crecimiento fue acompañada por la inducción de la apoptosis: el número de células apoptóticas tempranas fue significativamente mayor en las muestras de combinación en comparación con cualquiera de los fármacos solos (figura 3B y la figura S6B). Como comparación, la apoptosis en las células LS174T se evaluó en paralelo después de la inducción de anticuerpos anti-β-catenina y anti-KRAS shRNAs, alcanzando un nivel comparable de apoptosis temprana en la muestra de doble silenciado (figura 3B). El silenciamiento de las proteínas diana se muestra en la figura S7. A continuación, ya que los tres compuestos son capaces de inhibir la expresión de MYC en células LS174T (figura 1J-L), se determinó si la combinación de concentraciones subóptimas de los fármacos podría inducir un mejor bloqueo de la transcripción MYC. Los informes anteriores han demostrado que tanto KRAS y β-catenina son capaces de regular la expresión de MYC en células de cáncer de colon [19], [42], [43]. De hecho, los tratamientos de combinación durante 24 horas mostraron una mejora significativa en la inhibición de la expresión MYC comparación con los tratamientos individuales (Figura 3C). Este resultado sugiere que MYC es un efector común de las dos vías y su regulación por disminución se correlaciona con el crecimiento celular y la inhibición de la viabilidad en estas células. En contraste, se observó ningún efecto de las combinaciones sobre los niveles de Myc en células DLD-1 (Figura S6c), en línea con la falta de myc baja regulación por FTS en estas células. Además, la inhibición combinada provocó una fuerte abajo de la modulación de la expresión de survivina, mientras que poco o ningún cambio se obtuvo mediante tratamientos individuales (Figura 3D y figura S6D). La survivina es un objetivo transcripcional de ambos Wnt y vías KRAS [19], [44], [45] y tiene un papel crucial en la supervivencia de cáncer de KRAS impulsada [46]. Por último, para estudiar los efectos a largo plazo de β-catenina y KRAS inhibición combinada, el crecimiento independiente de anclaje se evaluó después de una sola adición de dosis subletales de PKF115-584 o pyrvinium, y FTS. Como se muestra en la figura 3E-F y en la figura S6E-F, cada combinación de inhibidor de β-catenina con FTS tuvo un profundo efecto sobre el crecimiento en agar blando de las células LS174T y DLD-1.
Las células (A) se trataron con 100 mM FTS, 0,25 M PKF115-584 o 50 nM pyrvinium, solo o en combinaciones, o vehículo, durante 6 días. la viabilidad del cultivo celular se evaluó en los días 3, 4 y 6 por MTS. El OD relativa en comparación con células de control tratadas con vehículo se registró como la fracción superviviente. (B) células LS174T se cultivaron durante 3 días en presencia de los compuestos indicados (mismas concentraciones que en [A]); en paralelo, las células que llevan LS174T siRNAs inducible (sint, no director; SIBC, anti-β-catenina; siKR, anti-KRAS) fueron tratados con doxiciclina durante el mismo tiempo. La apoptosis se determinó por la anexina V /propidio doble tinción con yoduro. El porcentaje de células apoptóticas tempranas (anexina V-positivo /yoduro de propidio-negativo) se presenta en el gráfico. células LS174T (C) se trataron con PKF115-584 (0,5 M), pyrvinium (50 nM) y FTS (100 M), solo o en combinación, durante 24 horas y la expresión de c-myc se evaluó mediante PCR en tiempo real usando GAPDH como un gen de referencia. La expresión se normalizó en el control de las células tratadas con vehículo. Se incubaron (D) Las células durante 72 horas con inhibidores y lisados de células sondadas con anticuerpos anti-survivina y beta-actina. (E-F) Diez mil células LS174T se hicieron crecer en agar blando en presencia de PKF115-584 (0,1 M), pyrvinium (25 nM), FTS (50 M), solos o combinados. colonias grandes se contaron 20 días más tarde. El número de colonias formadas por las células de control no tratadas se establece como 100% (E). fotografías representativas se muestran en el panel (F). Análisis estadístico: véase la leyenda a la figura 2.
Con el fin de obtener una mayor comprensión de las modificaciones transcripcionales inducidos por los tratamientos combinados, la expresión de un panel seleccionado de genes relacionados con la señalización de Wnt y KRAS, colon el cáncer y la apoptosis, se ha estudiado el uso de una matriz de PCR cuantitativa de fabricación casera. El mapa de calor en la figura 4A muestra los cambios relativos en la expresión después de 72 horas de tratamiento con fármacos simples o combinadas, en comparación con células de control tratadas con vehículo. Como era de esperar, los agentes individuales dejaron mayoría de los genes sin cambios, mientras que las combinaciones indujeron una represión general del conjunto de genes seleccionados. En particular, CD44, COX2, CtBP2, ciclinas D1 y D2, ITF2, p70S6K2 y RASSF7 fueron fuertemente las reguladas por ambas combinaciones, en comparación con los tratamientos individuales. Además, el pyrvinium combinación /FTS causada abajo de la modulación de genes adicionales, tales como BCL2, Bcl2l1 (codificación para la Bcl-X
L factor anti-apoptótica), BCL9L, KRAS, CDKN1A (p21
WAF1) y PRKCA. Con el fin de captar los cambios de la transcripción temprana que se producen antes de cualquier signo de estrés celular, un pulso de 24 horas se llevó a cabo con la combinación pyrvinium /FTS. Esta combinación se prefiere sobre el uno con PKF115-584 para este análisis, como pyrvinium mostró un mayor grado de gen baja regulación. Los datos se muestran en la columna derecha del mapa de calor. A pesar de algunas diferencias con la exposición al fármaco más, muchos de los cambios fueron conservados, incluyendo la baja regulación de CD44, COX2, BCL2 y ciclinas D. Además, la regulación de la proteína pro-apoptótica se observó APAF1. Curiosamente, p21
WAF1 fue transitoriamente hasta reguladas a las 24 horas antes de ser regulados hacia abajo a las 72 horas. A fin de confirmar estos datos, algunos genes se analizaron de forma independiente en tiempo real PCR estándar en cuatro líneas celulares. La Figura 4B muestra los resultados de las células LS174T, confirmando la regulación de genes observada en el conjunto de datos original. Los datos de las cuatro líneas celulares se analizaron adicionalmente para identificar la modulación de la expresión génica sinérgico, definida como & gt; 2 veces el cambio de expresión en una combinación en comparación con los tratamientos individuales (Figura 4C). Curiosamente, la expresión de BCL2 fue sinérgicamente el regulado en las cuatro líneas celulares de pyrvinium /combinación FTS (lleno de cuadros grises). Ciclina D1 y CD44 marcados sinérgica en tres de cuatro líneas celulares. CD44 fue también el regulado en las células DLD-1, pero el grado de modulación no alcanzó el umbral para un efecto sinérgico (figura S8). La combinación PKF115-584 /FTS resultó ser menos eficaz en este análisis, sólo mostrando CD44 sinérgica baja regulación en al menos dos líneas celulares (LS174T y SW480). Estos resultados indican CD44 como una respuesta común a la doble β-catenina /KRAS orientación.
LS174T células fueron tratadas durante 24 ó 72 horas con inhibidores y un panel de genes Wnt se centraron en, se estudió Ras y vías de apoptosis por QPCR utilizando una matriz de 96 pocillos (a) o estándar PCR en tiempo real (B). Los gráficos de la (B) muestran el cambio de expresión veces en comparación con los controles tratados con vehículo. (C) Resumen mesa de informes en tiempo real PCR análisis de los datos de todas las líneas celulares. cajas llenas indican efecto sinérgico sobre la expresión génica (& gt; 2 veces el cambio frente a cada tratamiento individual). PY = pyrvinium.
Después de haber demostrado la eficacia de la inhibición doble de Wnt /KRAS
in vitro
, tratamos de traducir estos resultados en una nueva estrategia terapéutica
in vivo
. Sin embargo, PKF115-584 ya no se produce por Novartis y su síntesis en gran escala demostró ser extremadamente difícil y requiere mucho tiempo. En cuanto a pamoato pyrvinium, se informa de que se absorbe mal [47]. Sin embargo, la administración oral de pyrvinium fue descrito por dos grupos [48], [49]. Por lo tanto, un experimento piloto se llevó a cabo para verificar si el medicamento podría alcanzar el objetivo en ratones desnudos, al ver la expresión pygopus en xenoinjertos LS174T después de tres administraciones orales diarias de 10 mg /kg pyrvinium. Los resultados fueron negativos (Figura S9), por lo tanto, no se intentó más
in vivo
análisis.
Discusión
Casi todos los cánceres colorrectales muestran alteración de la vía Wnt que controla ß-catenina activación. Por lo tanto, la inhibición de la β-catenina puede conducir a avances significativos en el tratamiento de esta enfermedad. Sin embargo, datos recientes revelaron que más de un "controlador" vía oncogénica a menudo se activa en un solo tumor [50], [51]. Por lo tanto, la orientación oncogén múltiple es probable que sean necesarios para erradicar la enfermedad. En una fracción significativa de los tumores colorrectales, Wnt y las alteraciones de la vía KRAS coexisten [6], [13], [14]. A pesar de que se ha conocido durante casi 30 años, el oncogén KRAS ha sido un objetivo difícil de alcanzar hasta ahora. Agentes que bloquean KRAS modificaciones post-traduccionales han sido ineficaces en ensayos clínicos [52]. Estrategias que aborden los efectores de KRAS [53], [54], [55] o para establecer interacciones sintéticas letales [56], [57], [58] han demostrado diferentes respuestas de un caso a otro, posiblemente debido a la complejidad de la vía KRAS. Esto también se pone de relieve por el diferente resultado molecular de la inhibición del gen KRAS observado en dos líneas celulares de CRC en nuestro estudio. Tomando un enfoque diferente, FTS interfiere específicamente con KRAS de acoplamiento a la membrana celular, al imitar su resto farnesylcysteine [29].
En este trabajo, se investigó los efectos de β-catenina y la inhibición combinada KRAS por moléculas pequeñas . La sinergia fue evidente en un panel de líneas celulares de CRC que llevan diferentes tipos de mutaciones que afectan a las vías de destino, mediante el uso de varios ensayos independientes. La combinación de dosis subóptimas de β-catenina y los inhibidores de KRAS se observó inhibición significativa del crecimiento y la apoptosis, lo que se refleja en una fuerte baja regulación de la expresión de survivina. Survivin inhibe la activación de las caspasas efectoras y es hasta reguladas en muchos tipos de cáncer. Al golpear dos vías que controlan su expresión en células de CRC, se obtuvo una supresión completa de su actividad anti-apoptótica y por lo tanto la inducción de la apoptosis.