Extracto
MTDH gratis (metadherin), un oncogén importante que es ampliamente sobreexpresa en varios tipos de cáncer, es un biomarcador potencial de malignidad del tumor. Variantes en
MTDH
se han asociado con la susceptibilidad al cáncer de mama. Sin embargo, no hay estudios que evalúan
Se han reportado MTDH
polimorfismos de genes y su posible relación con la susceptibilidad al cáncer de ovario. Por lo tanto, se investigó la asociación de
MTDH gratis (-470G & gt; A) polimorfismo con el desarrollo del cáncer de ovario en 145 pacientes con cáncer de ovario y 254 sujetos de control, utilizando el análisis de secuencias. Se encontró que la
MTDH
(-470G & gt; A) polimorfismo se correlacionó estadísticamente con el riesgo de cáncer de ovario (bajo el modelo genético aditivo, GG vs. GA vs AA, P = 0,042). En comparación con los genotipos que contienen el alelo G (GG y GA), el genotipo AA puede disminuir el riesgo de cáncer de ovario (P = 0,0198, OR = 0,33, 95% CI [0.12~0.78]). En comparación con el alelo G, el alelo A es de protección contra el riesgo de cáncer de ovario (P = 0,01756, OR = 0,66, IC del 95% [0.46~0.93]). Además, se observó una asociación estadísticamente significativa entre la GG y genotipos AA GA + y la etapa clínica (P = 0,038). Estos datos sugieren que
MTDH gratis (-470G & gt; A) podría ser un marcador molecular útil para evaluar el riesgo de cáncer de ovario y para predecir el pronóstico del paciente de cáncer de ovario
Visto:. C Yuan, Li X, Yan S, Q Yang, Liu X, B Kong (2012) El
MTDH gratis (-470G & gt; A) El polimorfismo se asocia con cáncer de ovario susceptibilidad. PLoS ONE 7 (12): e51561. doi: 10.1371 /journal.pone.0051561
Editor: Goli Samimi, Kinghorn Centro del Cáncer, Instituto Garvan de Investigación Médica, Australia |
Recibido: 5 de Octubre, 2012; Aceptado: 2 de noviembre de 2012; Publicado: Diciembre 11, 2012
Derechos de Autor © 2012 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81001166, 30872738), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (ZR2010HQ050), Fundación de Shandong Departamento de Salud Pública (2009Q2012), China Fundación postdoctoral Ciencia (201104636, 20100471551), Fundación Independiente Innovación de Universidad de Shandong (2012TS142). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario tiene la tasa de mortalidad más alta de todos los tumores malignos del sistema reproductor femenino, y en 2008 había un estimado de 225.500 nuevos casos y 140.200 muertes en todo el mundo [1]. Como es el caso para muchos tumores malignos, cáncer de ovario es una enfermedad multifactorial, y factores hormonales, cicatrización de heridas y la inflamación puede jugar un papel en su desarrollo. Las interacciones entre el medio ambiente y los factores genéticos también juegan un papel importante [2]. Muchos estudios han investigado la base genética de la susceptibilidad al cáncer de ovario. Por ejemplo,
BRCA1
,
BRCA2
,
MLH1
,
MSH2
,
RAD51C
,
RAD51D
,
RB1
,
SMAD6
,
CASP8
, y
LIN28B
han sido implicados en el cáncer de ovario [3], [4], [5 ], [6], [7], [8], [9], [10]. Recientemente, los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han encontrado una fuerte asociación entre el cáncer de ovario y varios alelos de susceptibilidad comunes en cuatro loci [11], [12], [13]. Braem et al. revisado 147 genes candidatos, y los 3 estudios GWAS publicados desde 1990 a octubre de 2010 identificaron aproximadamente 1100 variantes genéticas en más de 200 genes candidatos y 20 regiones intergénicas [8]. Sin embargo, las relaciones entre las variantes genéticas conocidas y cáncer de ovario son limitados, y se necesitan más estudios para dilucidar pueden realizar variantes genéticas causales y facilitar la identificación de subgrupos de alto riesgo dentro de la población general [5].
MTDH
, también conocido como astrocitos elevado gen-1 (
AEG-1 |) y
Letra
, se identificó originalmente como un gen inducible por el VIH en los astrocitos fetales humanos primarios [14] .
MTDH
está localizado en 8q22, se compone de 12 exones y 11 intrones y codifica una proteína de 582 amino ácido con una masa molecular calculada de 64 kDa.
MTDH
sobre-expresión se ha detectado en el carcinoma esofágico de células escamosas [15], cáncer gástrico [16], cáncer renal [17], el cáncer de próstata [18], el cáncer de pulmón de células no pequeñas [19], carcinoma hepatocelular [20], cáncer de mama [21] - [22], y neuroblastoma [23], en comparación con las células normales y las regiones coincidentes no neoplásicas [24]. El nivel de
MTDH
sobreexpresión se correlaciona significativamente con la tumorigénesis, la invasión, la migración, la progresión, la angiogénesis [25], EMT (transición epitelio mesénquima), la quimio-resistencia y radioresistance en diversos tipos de cáncer [17], [26 ], [27], [28], [29], [30], [31]. MTDH overe-Xpression se correlaciona con diseminación peritoneal, metástasis en los ganglios linfáticos, la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia etapa, el grado histológico, la presencia de tumor residual y la recurrencia tumoral en el cáncer de ovario [32], [33]. Alto
MTDH
expresión se asoció con la progresión y pronóstico del cáncer de ovario [32], [33].
Nuestro grupo también ha encontrado previamente que las variantes en
¿Cuáles son MTDH significativamente asociado con el cáncer de mama [34]. Sin embargo, la asociación de
MTDH
variantes con la susceptibilidad al cáncer de ovario no se ha investigado
Resultados
La relación entre el
MTDH gratis (& gt -470G.; A) el polimorfismo y el riesgo de cáncer de ovario
los participantes en los grupos de casos y controles eran todos de la china continental. No hubo diferencias clínicas significativas (es decir, el índice de masa corporal [IMC], la edad mediana, la historia menstrual u otros parámetros relacionados) entre los 2 grupos.
Hardy-Weinberg mostraron que los valores de chi-cuadrado de la grupo de casos y el grupo de control fueron 0,1 y 3,94, respectivamente; ambos eran p & gt; 0,05. Como se muestra en la Tabla 1, el
MTDH gratis (-470G & gt; A) y genotipos alelo distribuciones tuvieron una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos de casos y controles. Se ha observado una correlación estadísticamente significativa con el riesgo de cáncer de ovario (el modelo genético aditivo, GG vs GA vs AA, P = 0,042). Usando el modelo genético dominante (GG + GA vs AA), se observó una diferencia estadísticamente significativa en el riesgo de cáncer de ovario (CI P = 0,0198, OR = 0,33, 95% [0,12 ~0. 78]). Estos datos mostraron que el genotipo AA homocigótica puede ser protector contra el desarrollo del cáncer de ovario y puede disminuir el riesgo de cáncer de ovario. El alelo parece ser protector (P = 0. 01756, OR = 0,66, IC del 95% [0.46~0.93]) contra el cáncer de ovario. cromatogramas de secuenciación de casos elegidos al azar se utilizan para ilustrar las variantes de
MTDH gratis (Fig. 1).
A-C, los resultados de la secuenciación del cromatograma del genotipo GG, GA y AA, respectivamente. Las muestras fueron escogidos al azar
La relación entre el
MTDH gratis (-470G & gt; A). El polimorfismo y variables clinicopatológicas
La Tabla 2 muestra la asociación de los genotipos GG y GA + AA con las características clínico-patológicas, incluyendo la edad al momento del diagnóstico, el grado de diferenciación del tumor, estadio clínico, metástasis en los ganglios linfáticos, la expresión CA125, el tamaño del tumor y la histología del tumor. Se encontró una asociación estadísticamente significativa con el estadio clínico (p = 0,038). No hay relación entre el polimorfismo y la edad al momento del diagnóstico, se encontró que el grado de diferenciación tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, la expresión CA125, el tamaño del tumor o la histología del tumor. Por lo tanto, el
MTDH gratis (-470G & gt; A). Polimorfismo puede ser un indicador de la etapa clínica en el cáncer de ovario
La relación entre el
MTDH gratis (- 470G & gt; a) polimorfismo y la proteína MTDH niveles
a continuación, estudiamos la posible relación entre el
MTDH gratis (-470G & gt; a) polimorfismo y el nivel de expresión de la proteína MTDH in vivo. Como se muestra en la Fig. 2, los niveles de proteína MTDH en 15 tejidos de cáncer de ovario eran significativamente mayores que los de 17 tejidos normales (P & lt; 0,01). Como se muestra en la Fig. 2B y 2C, la expresión de la proteína MTDH fue mayor en los pacientes con genotipos GG o GA que en aquellos con el genotipo AA, pero estas diferencias no fueron significativas (P & gt; 0,05). Estos hallazgos sugieren que el SNP -470G & gt;. A no pueden afectar significativamente la expresión de la
MTDH
gen
A, nivel relativo de expresión de la proteína MTDH en los tejidos de cáncer de ovario en comparación con tejidos ováricos normales . B, nivel relativo de expresión de la proteína MTDH en los tejidos de cáncer de ovario de pacientes con diferentes -470G & gt; A genotipos. C, nivel relativo de expresión de la proteína en los tejidos normales MTDH de individuos con diferentes -470G & gt; A genotipos. Un círculo representa la media de tres mediciones independientes de un paciente. La distribución de los tres genotipos fueron al azar entre los grupos. N representa el número de muestras de grupo respectivo. Las barras representan la desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para evaluar las diferencias en los niveles de expresión de diferentes construcciones.
Discusión
MTDH
juega un papel crítico en la biología del tumor, y se está implicado en una variedad de comportamientos biológicos tumorales. Nuestro grupo fue el primero en descubrir una asociación significativa entre el
MTDH
y la susceptibilidad del tumor: es decir, que el 2
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variantes están asociadas con el cáncer de mama [34]. En este estudio, se analizaron además varios SNPs en
MTDH
y encontramos otro SNP (rs16896059, -470G & gt; A) con diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de casos y control del cáncer de ovario. Por otra parte, rs16896059 fue estadísticamente significativamente asociado con la etapa clínica del tumor. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio de asociación variante de
MTDH
SNPs y el riesgo de cáncer de ovario. Esperamos que
MTDH
habrá un marcador molecular útil para evaluar el riesgo de cáncer de ovario y para predecir el pronóstico del paciente de cáncer de ovario. Sin embargo, este hallazgo debe ser verificada en una muestra mayor.
El rs16896059 SNP se encuentra en el promotor de
MTDH
y por lo tanto los polimorfismos no alteran la secuencia o la estructura de la proteína. Se investigó el nivel de expresión de la proteína de MTDH por el Western Blot. Como se informó anteriormente, los niveles de expresión de MTDH en los tejidos de cáncer de ovario eran significativamente mayores que los niveles en los tejidos normales adyacentes (P & lt; 0,0001) [32], [33]. Sin embargo, no encontramos ningún efecto estadísticamente significativo de la -470G & gt; A SNP en la expresión de la proteína de la
MTDH
gen en tejidos de cáncer de ovario o de los tejidos normales. Por lo tanto, ningún impacto del SNP en
MTDH
expresión era evidente. Debido a la gt -470G y; A SNP se encuentra en la región promotora, y entonces también podría afectar activeity promotor. Por lo tanto, la asociación de la
MTDH gratis (-470G & gt; A) polimorfismo con
MTDH
promotor activeity y su efecto en el desarrollo del cáncer de ovario deben ser estudiados in vitro para investigar más a fondo los mecanismos moleculares implicados.
Como se indicó anteriormente, la mayoría de los pacientes que participaron en nuestro estudio estaban viviendo en la provincia de Shandong, china. Debido a la homogeneidad genética general de esta población étnica, especular que estos resultados serán consistentes en muestras de mayor tamaño de toda China. Sin embargo, la relación entre el
MTDH
polimorfismo y el riesgo de cáncer de ovario requiere una mayor investigación en diferentes poblaciones étnicas [34].
En conclusión, el alelo A del
MTDH
SNP rs16896059 (-470G & gt; a) es protector contra el cáncer de ovario, y el genotipo AA homocigotos pueden ser un genotipo de protección. El polimorfismo es estadísticamente significativamente asociado con el estadio clínico.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
El estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Shandong. Todos los participantes dieron su consentimiento informado para participar en este estudio escritos. 145 pacientes (edad media de 51,8 ± 13,1 años) participaron en el estudio, con diagnóstico de cáncer de ovario en el Hospital de la Universidad de Shandong Qilu entre septiembre de 2008 y julio de 2011. La información clínica de datos, incluyendo la edad al momento del diagnóstico, el grado de diferenciación, estadio clínico, positivo los ganglios linfáticos, CA125, el tamaño de la histología del tumor y el tumor se obtuvieron de los registros médicos de los pacientes. 254 mujeres sanas de la misma edad (edad media de 49,2 ± 12,8 años), fueron reclutados como control. La mayoría de los participantes eran chinos Han que residen en la provincia de Shandong, China. ADN a partir de sangre periférica de células s se extrajo con TIANamp ADN genómico Kit (Tiangen, Pekín, China), por instrucciones. La pureza del ADN y la concentración se midió por espectrofotometría ultravioleta (GE Healthcare, EE.UU.). Las muestras de ADN se almacenaron de forma convencional a -80 ° C como se ha descrito anteriormente [34], [35]
Análisis Genotipado de la
MTDH gratis (-470G & gt; A).
Genotipado de la rs16896059 SNP (-470G & gt; A) polimorfismo se determinó por PCR y el método de secuenciación. La secuencia de
MTDH
gen se obtuvo de NCBI (Identificación de genes: 92140, nucleótidos: AC_000140.1, GI: 157734173). Los cebadores se diseñaron con Primer Premier 5 de acuerdo con la secuencia de rs16896059 como sigue: cebador directo 5 'CTGGCAACTGGTAGGCACGC -3' y cebador inverso 5'-GAGGGACTCGCAGGATGACG -3 '. El tamaño producciones PCR era 893 pb. la amplificación PCR se realizó en sistemas de reacción de 50 l que contenía 1 l de ADN genómico (100 ng /l), 4 l de dNTPs 2,5 mM, tampón de 10 l, 2 l de cada cebador (0,4 M) y 0,5 U Primestar SA ADN polimerasa (TAKARA , Dalian, china). Las condiciones de amplificación de PCR fueron: 94 ° C durante 5 min, 35 ciclos a 98 ° C durante 10 segundos, 55 ° C durante 15 segundos, y 72 ° C durante 2 min, y una etapa de extensión final de 72 ° C durante 5 minutos . Todas las producciones de PCR fueron secuenciados por BioSune Biotecnología Co., Ltd. (Shanghai, China), y los datos de la secuencia se analizaron con Chromas 2.31 y MegAlign software 7.0.
Western Blot
Western blot se realizó como se describe anteriormente [31], [36], el tejido se disolvió en tampón RIPA (1 × PBS, 0,1% de dodecil sulfato de sodio, 1% de NP40, EDTA 5 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, inhibidores de desoxicolato de sodio y la proteasa 0,5% ). 40 g de proteínas se sometieron a electroforesis en un 10% SDS-PAGE y se transfirieron a PVDF (Millipore) utilizando una célula Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). La inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando un anticuerpo primario
MTDH gratis (ab45338, 1:500, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) y β-actina (1:5,000, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU. ). Los anticuerpos secundarios (1:5,000, KPL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) fueron marcadas por el HRP (peroxidasa de rábano picante). Las membranas se visualizaron utilizando un kit ECL (Merck, Darmstadt, Alemania). El control de carga era β-actina.
Análisis estadístico
Los datos estadísticos se analizaron como se ha descrito anteriormente [34]. prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg se realizó d usando una herramienta estadística basada en la web Oege (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Las distribuciones genotípicas y alélicas en los grupos de cáncer de ovario y grupos de control se analizaron mediante pruebas de chi-cuadrado, y se utilizó la prueba exacta de Fisher cuando uno recuento de células fue & lt; 5. El riesgo de desarrollo de cáncer de ovario se estimó como odds ratio (OR) con un intervalo de confianza del 95% (IC) utilizando un análisis de regresión logística incondicional. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras con un nivel de significación de p = 0.05. Los datos estadísticos se analizaron con el programa SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.).
Reconocimientos
Agradecemos Ning Yang, Xiao Guan para la recogida de datos para este estudio.