Extracto
Con el objetivo de dilucidar la etiología de radioresistance, exploramos las alteraciones genéticas en no radioresistant vs . Las células de cáncer de esófago resistentes adquiridos por radiación fraccionada a largo plazo. Encontramos AKR1C3, un aldo-ceto reductasa expresado raramente en la mayoría de los tejidos humanos, la expresión más alta en las células adquirida radioresistance. Represión de AKR1C3 a través de RNAi o sus inhibidores químicos restaura la sensibilidad de las células tumorales adquiridos y de xenoinjerto de ratones BALB /c ratones desnudos a la radiación (IR) ionizante. monitoreo celular de la tensión oxidativa en las células AKR1C3-elevado indica que IR inducida por la acumulación de ROS y el daño en el ADN concomitante se alivió de manera significativa, y tales consecuencia protectora desapareció en caída AKR1C3. Estos hallazgos descubrir la posible participación de AKR1C3 en la eliminación de ROS celular y explicar, al menos parcialmente, la radioresistance adquirida por AKR1C3 sobreexpresión. Un análisis retrospectivo de los carcinomas esofágicos también indicó una expresión significativa de AKR1C3 en muestras quirúrgicas de radio sensible de radio-resistentes, pero no. Nuestro estudio puede proporcionar un biomarcador potencial para predecir el pronóstico de la radioterapia e incluso dirigir una terapia dirigida para el cáncer de esófago y otros tumores
Visto:. Xiong W, Zhao J, Yu H, Li X, Sun S, Y Li , et al. (2014) La expresión elevada de AKR1C3 aumenta la resistencia de las células cancerosas para la radiación ionizante a través de la modulación del estrés oxidativo. PLoS ONE 9 (11): e111911. doi: 10.1371 /journal.pone.0111911
Editor: Marianne Koritzinsky, Red de Salud de la Universidad, Canada |
Recibido: 18 Junio, 2014; Aceptado: 2 Octubre de 2014; Publicado: 24 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. De acuerdo con PLOS ONE requisito y directrices MIAME, nuestros datos de microarrays se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus como GSE61620, GSE61772 y GSE61816
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación Básica de China (Programa 973 2010CB12300 para DM Zhou), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (91029711, 20932001 y 20852001) y la financiación del Ministerio de Educación (20110001110054). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la radiación ionizante (IR) es el tratamiento no quirúrgico más efectivo para la mayoría de los tumores [1]. Tal intervención terapéutica por lo general se basa en la interacción entre las moléculas de IR y de agua en las células que produce especies reactivas de oxígeno (ROS) excesivas y por lo tanto coloca células cancerosas bajo extensa estrés oxidativo [2]. Los ROS altamente inestables reaccionan con el ADN y otras macromoléculas en las proximidades, produciendo defecto genético, aberraciones cromosómicas y otros daños [3]. Las mitocondrias daño por IR puede incluso conducir a estrés oxidativo prolongado y por lo tanto más daños del ADN y otras moléculas celulares [4]. La acumulación de daño en el ADN es un factor importante en el desencadenamiento de la insuficiencia IR inducida de la división celular y la proliferación celular que conduce a la apoptosis [5].
A pesar de la importancia terapéutica, la resistencia IR es un impedimento importante para la terapia del cáncer [ ,,,0],6]. Se ha informado de que la reparación del daño en el ADN inducido por IR, ya sea doble filamento se rompe o defectos de cadena sencilla, es un importante mecanismo subyacente y la recurrencia del cáncer radioresistance [7] - [11]. La eliminación de ROS generados por IR por enzimas antioxidantes constituye mecanismo alternativo que conduce a radioresistance. La glutatión peroxidasa (GPx), peroxiredoxin (TPx) y superóxido dismutasa (SOD), la clase más grande de enzimas antioxidantes, tienen tal capacidad de disminuir la acumulación de ROS IR inducida por [12] - [14]. Ciertas células cancerosas y las células madre cancerosas contienen una mayor expresión de enzimas antioxidantes y son por lo tanto preferentemente a salvo de la irradiación [15], [16]. Descubrimiento de otras enzimas celulares que participan en la lucha contra el estrés oxidativo puede ser útil para el diagnóstico de los pacientes no sensibles a la radioterapia e incluso dirigir una terapia dirigida eficaz para los tumores malignos.
El cáncer de esófago es un cáncer común con una de 5 años tasa de supervivencia de 5-19% [17]. Hay una fuerte evidencia que sugiere que radioresistance de cáncer de esófago puede ser congénita,
es decir.
Relación con el género y la etnia, o ser inducida por el estilo de vida tales como fumar [18]. Por lo tanto, el carcinoma de esófago puede proporcionar un modelo ideal para la identificación de factores celulares que se induce por radioresistance. En este estudio, se encontró que la adquisición de radioresistance coincidió con elevada expresión de AKR1C3 en células de cáncer de esófago, y supresión de la expresión AKR1C3 restaura la sensibilidad de las células tumorales adquiridos y los animales de xenoinjerto a la radiación (IR) ionizante. Además, el seguimiento celular del estrés oxidativo en las células AKR1C3-elevado indica que la acumulación de ROS y el daño en el ADN concomitante se alivió de manera significativa, y tales consecuencia protectora desapareció en caída AKR1C3. Un análisis retrospectivo indicó una expresión AKR1C3 significativo en carcinomas esofágicos quirúrgicos de radio-resistentes pero no resistentes. Nuestros hallazgos pueden proporcionar un nuevo biomarcador para la predicción de los pacientes no sensibles a la radioterapia e incluso dirigir una terapia dirigida para el cáncer de esófago y otros tumores.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y la irradiación
KY170 y TE13, dos líneas celulares de cáncer de esófago escamosas humanas, y sus líneas celulares derivadas radioresistant KY170R y TE13R se proporcionan como un regalo por el Departamento de Radiología, MD Anderson Cancer Center, EE.UU.. Estas líneas celulares, publicados originalmente por un grupo japonés [19], fueron autenticadas y probados por el proveedor mediante la repetición de perfiles y cariotipo pruebas cortas en tándem. Las células se pasaron por menos de 1 mes antes de la experimentación. Una alícuota del stock parcial se utilizó para los estudios descritos aquí. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 glucosa alta (
Invitrogen
) suplementado con suero bovino fetal 10% (
HyClone
) y 50 unidades /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron en un incubador humidificado con 5% de CO
2 a 37 ° C y se dividieron cada 3-4 días. la irradiación de las células tumorales se llevó a cabo con un acelerador lineal de rayos X 6MV.
ARNi, se construyeron AKR1C3 silenciador de células estables
AKR1C3-casetes de orientación shRNA y scramble-shRNA por PCR utilizando hasta -primer (promotor Hu6): TGGATCCaaggtcgggcaggaagag, abajo-imprimación (scramble): AGGATCCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCGTCCTTT; abajo-imprimación (shRNA1): 5'-AGGATCCAAAAACCA GAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ', (shRNA2): 5'-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCG AGTAGTGGAGATTTCTGTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3', (shRNA3): 5'-AG GATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 '. Los casetes obtenidos fueron clonados en pSD31 para la expresión constitutiva de shRNA siguiendo el método que se había prescrito anteriormente [19]. la producción de vector lentiviral se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de Invitrogen. Experimentos para lentivector transducción estable se llevaron a cabo como sigue: 1 × 10
6 de las células de replicón en un matraz T25 se sembraron y transducidas en día 2 en presencia de 8 mg /ml de polibreno. La selección se realiza después de día 3 por 800 ng /ml de puromicina hasta que las células parentales en experimentos paralelos murió por completo.
ensayo de formación de colonias y tumor irradiación
una monocapa de células en la fase exponencial de crecimiento se irradiaron usando un acelerador lineal 6-X-ray MV en dosis apropiadas (2, 4, 8 Gy), y se sembraron las células irradiadas para crecer en placas de seis pocillos. Después de la incubación durante 7-10 días, las células supervivientes se tiñeron con violeta de cristal y después se contaron. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado y se repitió dos veces. irradiación del tumor se realizó como sigue: cuando el diámetro de los tumores de xenoinjertos alcanzó 6-8 mm, las extremidades traseras de los ratones de xenoinjerto se irradiaron con una dosis única (15 Gy). Después de la irradiación del crecimiento tumoral se controló durante un máximo de 36 días.
extracción de RNA y de microarrays
El ARN fue extraído de cada línea celular cultivada utilizando SV Total RNA Isolation Kit (
Promega
) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, el ARN extraído se trató con juego de RNasa libre de DNasa (
QIAGEN
) para eliminar cualquier contaminación de ADN genómico de acuerdo con el protocolo del fabricante. perfiles de genes, por triplicado, se llevó a cabo por Illumina Shanghai Corporación usando una micromatriz de Illumine se recogieron y analizaron con el software de aplicación Iluminado BeadStudio (GSE61620, GSE61772 y GSE61816) Human-6 V3 y datos. Se consideraron los genes con un Illumina DifferScore de ≥20 para representar la regulación, mientras que aquellos con un Illumina DifferScore de ≤-20 fueron considerados como baja regulación. P & lt; 0,05 indican una diferencia significativa
Real-time RT-PCR
El ARN total aislado se cuantificó con un espectrofotómetro UV (
Eppendorf
) y luego 1,0 g de. ARN transcrito fue inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena (
Toyobo, Japón
) con cebadores aleatorios en un volumen de reacción de 20 l. La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando el kit Taq Go qPCR Master Mix (
Promega
) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante y el cDNA se utilizó luego como molde para la detección de las diferentes expresiones de genes. PCR primers fueron diseñados por el Primer 3.0 y una explosión de búsqueda para comprobar su especificidad. Los cebadores para la amplificación por PCR de AKR1C3 eran 5'ATTTGGCACCTATGCACCTC 3 '(aguas arriba) y 5'TGAGTTTTCCAAGGCTGGTC 3' (downstream) y β de acción 5 'AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT 3' (aguas arriba) y 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3 '(aguas abajo). Los niveles de ARNm relativas de los diferentes genes se calcularon como sigue: Ct (muestra) = CT (gen) - CT (GAPDH); ΔΔCT = Ct (después de la irradiación punto de tiempo) - Ct (0 h); Expresión relativa = 2
-ΔΔCT. Cada RT-PCR se repitió al menos dos veces.
ensayo de transferencia Western
Las células cultivadas se lavaron una vez con tampón de PBS después se lisaron en tampón de lisis (1% de SDS, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, mM NaF 1, 10 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, ortovanadato 1 mM de sodio, EDTA 1 mM) durante 5 min y se pasó a través de una aguja de calibre 27. Los lisados se centrifugaron a 12.000
g
durante 1 min y las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de proteína Bio-Rad DC. Cantidades iguales de proteína fueron separadas por 4~20% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% de leche descremada o 3% de albúmina sérica bovina en TBST (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20) durante 1 h. Los anticuerpos primarios y secundarios se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y esto fue seguido por la detección con una técnica de quimioluminiscencia (
Amersham Biosciences
). cuantificaciones Western se realizaron como sigue: Western blots fueron escaneados con un densitómetro para obtener la densidad de cada banda. Entonces, la relación de la densidad de una banda de interés a la de su banda de control interno (GAPDH) era relativa a la relación de los experimentos de control negativo. Cada Western Blot se repite al menos dos veces
La sobreexpresión de AKR1C3
Humano AKR1C3 ADNc fue comprado (
Origene
, Cat. No: SC321532)., Clonado en pcDNA3.1 y, a continuación transfectado en células KY170 de acuerdo con el protocolo proporcionado.
ensayos de citometría de flujo
células fijados con etanol se trataron con ARNasa a (0,1 mg /ml) durante 30 min seguido de incubación con PI (35 mg /ml). contenido de ADN de las células PI-manchado se analizó por FACScan (Becton Dickinson) y el porcentaje de células con G1, S, G2 y el contenido de ADN /M se calculó utilizando software MODFIT. La citometría de flujo mediciones de dihydroethidium (DHE)-fluorescencia se utilizaron para medir los niveles de ROS celulares. Los cultivos monocapa fueron incubadas en 10 mM DHE para 45 min y después se recogieron. DHE-fluorescencia se analizó por citometría de flujo (longitud de onda de excitación 488 nm, emisión 585 nm). La intensidad media de fluorescencia (MFI) se calculó después de la corrección de la autofluorescencia y el pliegue del cambio se calculó en relación células que revolver-KY170R. Cada ensayo de citometría de flujo se repitió dos veces.
Los experimentos con animales
Hombre Balb /c ratones nude (SPF, comprado a Vital River Laboratories, Pekín, China), con edades entre 4-6 semanas, fueron alojados con un 12 horas ciclo día-noche inversa con las luces encendidas a las 8:30 horas, en una temperatura de (22 ± 1 ° C) y humedad (55 ± 5%) ambiente controlada. Todos los ratones se les administró agua y pienso
ad libitum
en todo momento. ratones desnudos de xenoinjerto se generaron como sigue: KY170R-shRNA1 y células KY170R-revueltos fueron cultivadas en medio completo a 70% a la densidad de 80%. Después de tripsinización, las células se lavaron una vez con PBS, y se contaron. El macho, de 4 semanas de edad, a ratones desnudos de 6 semanas de edad fueron distribuidos aleatoriamente en dos grupos y se inyecta en la parte superior de una pata trasera con una densidad de 2 * 10
6/100 l de KY170R-shRNA1 y células KY170R-scramble, respectivamente. El crecimiento del tumor se controló a diario y cuando el diámetro del tumor alcanzó 6-8 mm, los animales "grupo" irradiación fueron irradiados una vez con una dosis de 15 Gy. El retroceso en el crecimiento del tumor ortotópico fue seguido por hasta 36 días, el volumen del tumor se calculó como la fórmula V = π /6 (a * b
2), donde a es el más largo y b es el eje del tumor perpendicular más corto. El volumen del tumor se midió hasta que los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 1,0 cm
3. A continuación, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical para experimentos posteriores.
La inmunohistoquímica de secciones de tejido
inmunohistoquímica de secciones de tejido de cáncer de esófago humanos, adquiridos del departamento de patología de la Universidad de Pekín Primer Hospital, y xenoinjertos de tumores fue realizado como sigue: 4-6 secciones de tejido micras se montaron y se calentó a 72 ° C durante 30 min. Las secciones se desparafinaron con xileno, se rehidrataron en EtOH graduada y se enjuagó con 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6). actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las secciones de tejido con 3% de H
2O
2 para 30 min. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con sodio M tampón de ácido cítrico 0,01 (pH 6,0) a 95 ° C durante 1 h. La unión no específica fue bloqueada por incubación de las secciones de tejido con 0,1 M Tris-HCl que contiene 10% de suero de cabra durante 2 h. AKR1C3 continuación se determinó mediante la incubación de las secciones con anticuerpo monoclonal de ratón anti-AKR1C3 a una dilución 1:200 en la solución de bloqueo por encima en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Después de lavados con 0,1 M Tris-HCl, las secciones se trataron con 1:400 dilución de anticuerpo secundario de caballo biotinilado anti-ratón y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Después de un aclarado adicional con 0,1 M Tris-HCl, la unión del anticuerpo se detectó mediante la incubación de las secciones de tejido con estreptavidina conjugada con HRP a temperatura ambiente durante 30 min. DAB-H
2O
2 de sustrato se añadió a los portaobjetos que se incubaron a temperatura ambiente durante un 4 minutos adicionales. Las secciones de tejido fueron teñidas con hematoxilina, se deshidrataron en alcohol clasificado, limpiado en xileno, y montadas con Permount medio de montaje para la visualización por microscopía de luz.
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba t de Student para determinar la diferencia estadística entre medio de dos grupos y datos. los valores & lt P;. 0,05 se consideraron significativos
Declaración de Ética
El estudio en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de salud. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvieron de todos los pacientes o sus familias para la investigación que utilizan estas muestras de tejido. Todos los celulares, los experimentos con animales e inmunohistoquímica de secciones de tejido estudio han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pekín (Certificado Nº IRB00001052-12037).
Resultados
Las expresiones diferenciadas de AKR1C3 en las células cancerosas
Para dilucidar la etiología de radioresistance, dos clones de tumores esofágicos, radioresistant KY170R y TE13R, han sido establecidos por la irradiación fraccionada continua de sus células parentales, KY170 y TE13 [20]. de perfiles de todo el genoma de la expresión génica en KY170R
v.
KY170 y TE13R v.
TE13 utilizando Illumine humano-6 V3 microarrays indicaron que se encontraron más de 900 genes que diferenciarse notablemente (Fig. 1A), en consonancia con el informe anterior [21]. Entre ellos, AKR1C3, un aldo-ceto reductasa existentes en un nivel bajo en la mayoría de los tejidos humanos, nos llamó la atención debido a su expresión significativa tanto en las células radioresistant. en tiempo real RT-PCR (Fig. 1B) y transferencia Western (Fig. 1C) análisis confirmaron la expresión elevada de AKR1C3 en células KY170R y TE13R, respectivamente, en comparación con sus células parentales: ~ 10 veces en el ARNm y mucho superior a nivel de proteínas. Este perfil reveló la coincidencia de elevada expresión de AKR1C3 y radioresistance en KY170R de esófago y cáncer de células TE13R. Los ensayos de formación de colonias verificaron que KY170R y TE13R eran de hecho más resistente a los infrarrojos que sus células KY170 y TE13 los padres, con la dosis estimada para la reducción de la supervivencia en un 90% para KY170 vs. KY170R como 5,5 Gy vs. 7,8 Gy (Fig. 1C ).
(a) de perfiles de todo el genoma de la expresión génica en KY170R radioresistant y TE13R
frente
KY170 sensibles a la radiación y TE13, respectivamente, a las 0, 8 y 24 h después de la irradiación. (B) Validación de la expresión elevada de AKR1C3 en el nivel de mRNA en KY170R vs. KY170 y TE13R vs. células TE13 antes y 8 y 24 horas después de la irradiación tal como se determina por RT-PCR. (C) Validación de la expresión elevada de AKR1C3 en KY170R radioresistant determinada por Western blot y la sensibilidad de las células KY170 y KY170R a la irradiación tal como se determina mediante un ensayo de colonias de formación.
El efecto de AKR1C3 en el respuesta de las células tumorales a la irradiación
Dada la diferencia significativa en la expresión de AKR1C3 entre las células de cáncer de esófago resistentes y no resistentes, que se preguntaban si podría ser una causa primaria o simplemente una consecuencia aguas abajo de radioresistance. Para examinar esta cuestión, los niveles de expresión de AKR1C3 en KY170R y TE13R se redujeron regulado por shRNAs entregados por pSD31 lentivirus y los efectos de la caída de AKR1C3 radioresistance se caracterizaron. Para excluir problemas de fuera de objetivo, tres shRNAs se utilizaron en paralelo para dilucidar el efecto de RNAi en células KY170R con un scramble shRNA como control negativo. análisis de transferencia de Western demostró que los tres shRNAs utilizados en este estudio ejercieron una fuerte potencia en las células transducidas con KY170R & gt; 80% se AKR1C3 las reguladas en comparación con el scramble-shRNA (Fig 2A.). Caracterización de caída AKR1C3 sobre la proliferación celular indicó que KY170R-shRNA1, KY170R-shRNA2 y KY170R-shRNA3 (tres líneas de células estables generadas por transducción mediada por pSD31) proliferado en casi la misma velocidad que las células KY170R-scramble, que en sí tenía una tasa casi idéntica a la observada en KY170R y KY170 células (Fig. S1A en File S1). Esto sugiere que AKR1C3 no es un gen necesario para la proliferación de estas células cancerosas. Por el contrario, la irradiación da a conocer el efecto biológico de AKR1C3 en la promoción de la supervivencia celular. ensayos de colonias de formación de indicaron que las células KY170R-shRNA1, -shRNA2 o -shRNA3 transducidas se hicieron sustancialmente más sensibles a la radiación con un menor número de clones formados de células KY170R-scramble (Figs. 2B-C y Fig. S1B en S1 File), que tenía una dosis estimada de 6,5 Gy para la reducción de la supervivencia en un 90%, mucho mayor que las células KY170R-shRNA1 (~4.5 Gy).
(a) observaciones representativas de caída estable de AKR1C3 en las células KY170R por tres shRNAs independientes y la sobreexpresión de AKR1C3 en KY170 células. (B) Los efectos de AKR1C3 caída en células KY170R y sobreexpresión AKR1C3 en KY170 sobre el resultado de la irradiación, dosificado 0-8 Gy, determinado por el ensayo de colonias de formación. Una pelea shRNA (SCR.) Y el vector pcDNA3.1 vacío actuaron como control negativo, respectivamente. (C) Las curvas de supervivencia para las comparaciones del efecto de AKR1C3 en la sensibilidad de las células KY170R (knockdown) y (D) KY170 células (sobreexpresión) de la irradiación, como se determina por ensayos de colonias de formación.
Confirmación del efecto AKR1C3 en la respuesta de las células tumorales a la irradiación
con el fin de confirmar el efecto protector de AKR1C3 descrito por RNAi, la KY170R radioresistant y sus células KY170 parentales fueron cultivadas en presencia de 200 mM jasmonato de metilo (MJ) y luego irradiado. MJ es una molécula pequeña bien establecido con su estructura se asemeja a las prostaglandinas, el sustrato de la aldo-ceto reductasas, y por lo tanto actúa como un inhibidor competitivo de AKR1C3. Mej muestra una gran potencia en el sistema celular debido a la mayor absorción celular con su IC
50 para AKR1C3 en ~150 mu M [22]. Se encontró que el tratamiento con mej también mejoró sustancialmente la respuesta de las células a irradiación KY170R y dicha mejora mediada por MJ no se observó en las células KY170 (Fig. S1c en File S1). Parece que la supresión de la actividad AKR1C3 a través de su inhibidor químico también podría sensibilizar a las células KY170R a IR. Además, se examinó si la expresión elevada de AKR1C3 solo podría causar KY170 células que son resistentes a la irradiación. Una construcción de expresión AKR1C3, pcDNA3.1-AKR1C3, se introdujo en células KY170 parentales para generar transfectantes AKR1C3 sobreexpresan (Fig. 2A). Se encontró que la sobreexpresión de AKR1C3 en KY170 células, acerca de un aumento de 5 veces, permitió más colonias de sobrevivir que en el caso de células pcDNA3.1-transfectadas en la misma dosis de irradiación (Figs. 2B y 2D). Claramente, es la elevada expresión de AKR1C3 que hace que las células tanto KY170R y TE13R sustancialmente resistentes a la radiación.
El impacto de AKR1C3 sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumores irradiados
A continuación, exploró si AKR1C3- radioresistance celular mediada era también operativa en tumores de xenoinjertos. Dos modelos de xenoinjertos fueron establecidos por vía subcutánea la implantación de células KY170R-scramble KY170R-shRNA1 y, por separado, en ratones desnudos. Se encontró que tanto los tumores crecieron xenotrasplante rápido con el anterior crecimiento ligeramente más lento que el segundo (Figs. 3A y B), apoyando la observación basada en células que AKR1C3 tiene mucho menos efecto sobre el crecimiento del tumor. Cuando los tumores habían alcanzado un volumen promedio de aproximadamente 100 mm
3 (Fig. 3A), se seleccionaron 20 ratones de xenoinjerto de cada tipo, la mitad de ellos se sometieron a la radiación local en una sola dosis de 15 Gy y medio permaneció sin tratar . Encontramos todos los tumores xenotransplantes en ratones irradiados 10 KY170R-shRNA1 fueron sensibles al tratamiento con IR 8 ratones llegando a ser casi 5 semanas después de la irradiación libres de tumor (Fig. 3A-B y Fig. S1 S2 en archivos). La tinción con hematoxilina y eosina (HE) reveló la ausencia de neoplasia pero sólo un pequeño residuo de encogido en los xenotrasplantes irradiados (Fig. 3A). Por el contrario, los tumores de xenoinjertos no irradiados en KY170R-shRNA1 y ratones KY170R-scramble crecieron hasta un volumen promedio de 1.000 mm
3 con células proliferantes completas (Figs. 3A-B y Fig. S2 en S1 File). En el caso de los ratones con xenotrasplantes KY170R-revueltos, la irradiación llevó a un mal resultado: el crecimiento del tumor fue reprimida inicialmente tras la irradiación pero se reanudó el plazo de dos semanas (Fig 3B.); extensa neoplasia y fuerte expresión AKR1C3 se detectó en los tejidos tumorales (Fig. 3A). Estos resultados dan a conocer el efecto de la elevación AKR1C3 en la protección de tumores de xenoinjertos de la irradiación, lo que confirma la hipótesis derivadas de los experimentos basados en células.
(A) observaciones representativos del crecimiento de xenoinjerto KY170R-scramble y tumores KY170R-shRNA1 y las respuestas de estos tumores a una dosis única (15 Gy) de radiación en términos de volumen del tumor, tinción HE y tinción inmunoquímica de AKR1C3. (B) El curso temporal de crecimiento de KY170R-scramble y xenoinjertos de tumores KY170R-shRNA1 con o sin un tratamiento local de IR.
elucidación de los mecanismos de acción AKR1C3 mediada radioresistance
Para explorar el mecanismo por el cual AKR1C3 ejerce su efecto sobre el resultado de IR, se compararon los niveles de celular daños ROS y el ADN, los mediadores críticos y la consecuencia inmediata de la muerte celular inducida por IR [23], en KY170R-shRNA1 frente KY170R-scramble Células. Se encontró que antes de la irradiación de aproximadamente 2 veces menos ROS estaba en KY170R-scramble que en las células KY170R-shRNA1 (Figs. 4A-B). Tras la irradiación, el nivel de ROS se mantuvo baja en las células KY170R-scramble pero aumentó notablemente en las células KY170R-shRNA1 con la diferencia de casi 3 pliegues (Fig. 4B). Coincidente con caída AKR1C3 simultánea y aumento de ROS en células KY170R-shRNA irradiados, el número de focos de fosfo-γ-histona (Figs. 4C-D), un biomarcador del daño de ADN [24], acompañado de muchos más roturas cromosómicas y bruto anomalías nucleares (Figs. S3A-B en S1 File), fue mucho mayor que en las células KY170R-scramble irradiados 48 h post irradiación. Un experimento paralelo realizado en presencia de N-acetil cisteína (NAC), un eliminador de química de ROS [25], indicó que el daño en el ADN IR inducida en las células KY170R-shRNA1 y las características morfológicas derivados se les impidió (Fig. 4E) . Hemos llegado a la conclusión de que AKR1C3 tiene la misma capacidad que la NAC para aliviar el estrés oxidativo y por lo tanto disminuir el daño del ADN inducido por radiación, que confiere radioresistance.
(A) Vista microscópica Representante de la acumulación de ROS en KY170R-scramble
v.
células KY170R-shRNA1 manchados por DHE. (B) cuantificaciones de los niveles de ROS en KY170R-scramble
v.
células antes de shRNA1 KY170R y 24 h después de IR a una dosis de 4 Gy. (C) vista microscópica Representante de focos fosfo-γ-histona en KY170R-scramble
v.
Células KY170R-shRNA1. (D) Las caracterizaciones de fosfo-γ-histonas en células de la prueba de Western Blot. (E) N-acetil cisteína (NAC) de eliminación de ROS mediada a una dosis de IR de 4 Gy. Cada medición cuantitativa se llevó a cabo por triplicado y se repitió al menos dos veces con una barra de error inferior al 25%.
Los estudios retrospectivos de radioresistance y expresión AKR1C3 en carcinomas esofágicos
Se realizó retrospectiva estudios para evaluar la posible pertinencia de radioresistance relacionados AKR1C3-en carcinomas esofágicos. muestras de tumores de esófago, un pedazo pequeño de las muestras de tumor tomadas para el diagnóstico patológico, se obtuvieron de 28 pacientes que no podían o no aceptar la cirugía (Tabla S1 S1 en el archivo). Estas muestras de tumores fueron entonces examinados a través de inmunohistoquímica para determinar los niveles de expresión de AKR1C3. Todos los pacientes aceptaron la terapia con radiación de conformación zona de la cama de esófago con la dosis de radiación en 58-64 Gy. Los efectos curativos fueron evaluados mediante la revisión de la TC de tórax de un mes después de la radioterapia. De estos pacientes, 20 estaban congénitamente resistente con volúmenes de tumor se redujo a menos de 50% a la IR; 8 eran sensibles a la radiación y se convirtió casi libre de tumor tras el tratamiento IR. Los análisis
La tinción inmunohistoquímica indicó que 7 (35%) de las muestras de tumor radioresistant muestra niveles altos (+++,
es decir, Hotel & gt ; 75% de células tumorales son AKR1C3 positivo), y 8 (40%) muestran niveles intermedios de expresión AKR1C3 (++,
es decir
75% de células tumorales ~ 50% de proteína contiene AKR1C3) (figura 5A-B. y la Fig. S4 en S1 File). El 5 (25%) restante tenía niveles bajos o indetectables de expresión (+/- AKR1C3,
es decir.
Células tumorales 0-50% eran AKR1C3 positivo). Por el contrario, no se encontró ninguno de los 8 muestras de tumores radiosensibles para expresar un nivel alto (+++) de AKR1C3. Sólo 3 (37%) de las muestras de tumores radiosensibles habían niveles intermedios de AKR1C3 pero 5 (63%) mostraron un nivel bajo o indetectable (+/-) de la expresión AKR1C3 (Fig. 5A-B y Fig. S4 en S1 File) . Es evidente que una fuerte correlación (p & lt; 0,017) existe entre la expresión elevada de AKR1C3 y radioresistance del carcinoma de esófago, lo que implica que AKR1C3 podría ser un marcador pronóstico de la radioterapia del cáncer
(A) los niveles subjetivos de expresión de AKR1C3. , a saber, alto (+++), intermedio (++), bajo o ninguno (+/-), en los carcinomas esofágicos. (B) Los niveles de expresión de AKR1C3 en el carcinoma esofágico de 28 pacientes que estaban congénitamente sensibles o resistentes a la IR.
Discusión
ROS son los principales mediadores del estrés oxidativo celular que determina el medio ambiente redox celular [26]. Los niveles excesivos de ROS son críticos en la muerte celular inducida por IR. Las células irradiadas, en particular los menores de la exposición intermitente que generan exceso de ROS, existirán en un estado de sitio oxidativo en el que la supervivencia requiere células para potenciar sus sistemas de defensa para escapar de daño oxidativo. Se ha demostrado que la superóxido dismutasa constituye la primera línea de los sistemas de defensa antioxidantes - cataliza la ruptura de la superóxido en peróxidos de hidrógeno, que se eliminan a continuación por la catalasa [23]. expresiones elevadas de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) se han reportado en los gliomas humanos y por lo tanto confiere radioresistance [15], [16]. La glutatión peroxidasa y la metionina son también enzimas antioxidantes que metabolizan ROS [23].
En este estudio, se informó de la coincidencia de la diferenciación de expresión AKR1C3, el nivel de ROS celular y daño del ADN en radioresistant KY170R frente a no-resistentes KY170 células. Proponemos que AKR1C3 es un componente celular que participa en el proceso de compactación de los ROS celular, compartiendo las mismas propiedades que las enzimas antioxidantes, por lo menos en
in vivo
escapar el daño oxidativo (Fig. 6). La eliminación de ROS, ya sea por las enzimas antioxidantes, AKR1C3 u otros factores celulares no identificados, podría ser una cuenta de mecanismo común para radioresistance. A diferencia de la glutatión peroxidasa (GPx), peroxiredoxin (TPx) y superóxido dismutasa (SOD) que se encuentran en esencialmente todos los organismos vivos, AKR1C3 se expresa a un nivel relativamente bajo en la mayoría de los tejidos normales, excepto la próstata y la glándula mamaria [27], [28 ]. Por lo tanto, el nivel de expresión de AKR1C3 en las células tumorales podría ser útil como un marcador biológico para la predicción de radioresistance celular.
AKR1C3 ha recibido amplia atención debido a su fuerte actividad reductora hacia una variedad de sustratos. Se cataliza la reducción dependiente de NADPH de aldehídos y cetonas endógenos a los alcoholes correspondientes [28], [29]. También cataliza la conversión de prostaglandina D
2 (PGD2) para 11β-PGF2, PGH2 a PGF2a y quinona a catecol [30].