Extracto
microARN (miRNA) son pequeñas moléculas que regulan la expresión de genes posttranscriptionally. En un estudio anterior, hemos identificado el miR-96 a ser aumentada en muestras de cáncer de próstata en comparación con el tejido normal adyacente y para ser un marcador independiente de recaída bioquímica en un modelo multivariado de predicción. Por lo tanto, hemos investigado el papel funcional de miR-96 en la carcinogénesis de próstata. células de cáncer de próstata LNCaP y DU145 fueron transfectadas transitoriamente con se analizaron miR-96 precursores y los cambios fenotípicos. El miR-96 aumentó la proliferación y la apoptosis alterada inducida por camptothecine en estas células. En silico análisis de predicción de destino FoxO1 identificado como potencial pro-apoptótica de miR-96 diana. miR-96 era capaz de unirse a dos sitios de enlaces en el FoxO1 3 'UTR en un ensayo de gen indicador de luciferasa. La sobreexpresión de miR-96 en las células LNCaP dio lugar a una expresión reducida FoxO1. La sobreexpresión de FoxO1 indujo una fuerte fenotipo apoptótico que fue parcialmente rescatado por la co-expresión de miR-96. RT-qPCR e inmunohistoquímica de 69 especímenes de cáncer de próstata revelaron una regulación a la baja de FoxO1 y una correlación inversa de miR-96 y proteínas FoxO1 expresión. En conclusión, se muestra que el miR-96 se puede regular la apoptosis en el cáncer de próstata, inhibiendo el factor de transcripción FoxO1
Visto:. Fendler A, M Jung, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K, Yousef GM (2013 ) La función antiapoptótica de miR-96 en cáncer de próstata mediante la inhibición de la FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10.1371 /journal.pone.0080807
Editor: Kin Lau Mang, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 21 Enero, 2013; Aceptado: 16 de octubre de 2013; Publicado: 19 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Fendler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo de la FA y KJ fue financiado por la Fundación para la Investigación urológica, Berlín y el Sonnenfeld Stiftung, Berlín. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son una nueva clase de pequeños ARN no codificantes y regulan la expresión génica posttranscriptionally través de la inhibición de la traducción, sino también a través de la degradación de los ARNm correspondientes. Aproximadamente el 30% de todos los ARNm se prevé que pueden ser objetivo de miRNAs [1]. Dependiendo de sus objetivos, miRNAs función como tumorsupressors o oncogenes mediante el control de las principales vías de la carcinogénesis, incluyendo la proliferación celular, la apoptosis y la motilidad celular [2].
El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer maligno más común en los hombres y la segunda causa principal de cáncer en el mundo occidental [3]. Mecanismos de CaP tumorigénesis todavía no están completamente aclarada y hay una falta de marcadores de diagnóstico y pronóstico.
La desregulación de miRNAs en el CaP se ha demostrado en numerosos estudios [4-9]. Su expresión se correlaciona con el estadio del tumor y la agresividad [10]. Hemos identificado previamente miR-96 en un conjunto de miRNAs desregulados en el CP. Su expresión se correlaciona con el grado de Gleason y es un marcador independiente de recaída bioquímica [6].
predicción in silico de destino mediante miRecords identificados FoxO1 entre otros como putativo objetivo de miR-96. FoxO1 es un miembro de los factores de transcripción forkhead box. Ejerce su función tumorsuppressive a través de la regulación de la transcripción de importantes reguladores de ciclo celular y la apoptosis [11,12]. FoxO1 actividad transcripcional se regula a través de la vía PI3K /AKT [13]. En cánceres de mama y de endometrio, así como los linfomas de Hodgkin FoxO1 ha sido previamente demostrado ser regulado por el miR-96 [14-16].
La hipótesis de que el miR-96 también puede tener una función oncogénica en CaP. Para probar esta hipótesis, que (a) estudiaron la influencia de la expresión de miR-96 en las características celulares fundamentales, tales como la proliferación, la apoptosis y la migración en líneas celulares de CaP, (b) realizado en la predicción in silico de destino, (c) estudió la unión de miR 96 a los sitios predichos de unión en la FoxO1 3 'UTR y los cambios posteriores en el ARNm y los niveles de proteína, (d) estudiaron el rescate de la apoptosis FoxO1 inducida por miR-96 y (e) correlacionados miR-96 expresión con transcripción FoxO1 y proteínas expresión en PCa humana y tejido adyacente normal correspondiente. Se demuestra que miR-96 inhibe la apoptosis inducida por camptotecina y regula la expresión FoxO1 mediante la unión a la 3'-UTR. En las muestras de CaP, hemos identificado una correlación negativa de los niveles de proteína FoxO1 y miR-96 expresión.
Materiales y Métodos
Los tejidos y líneas celulares
apareadas muestras de tejidos normales y malignos de 69 pacientes con CaP se recogieron después de la prostatectomía radical entre 2001 y 2005 en el hospital Universitario Charité. Para cada uno se recogieron datos clínico-patológicas de pacientes (Tabla 1). El estudio denominado "microRNAs como las firmas de diagnóstico y pronóstico en los tumores urológicos" (EA1 /153/07) fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario Charité y se ha obtenido el consentimiento informado por escrito.
Pacientes para RT-qPCR (N = 69)
pacientes para el análisis TMA (N = 64)
N (%)
N (%) guía empresas edad, años Median6363Range50-7246-74Pre-operatorio PSA
a, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T etapa
apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) la etapa N
apN0 /pNx67 (97) PN12 (3) M etapa
AM0 /Mx69 (100) M10 (0) Surgical marginsR041 (60) R127 (39) Rx1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) Seguimiento, la recurrencia monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical
a10 ( 15) 12 (19) Tabla 1. las características del tumor y los datos clínico-patológicas de cohortes de pacientes.
recaída aBiochemical se definió como la primera PSA postoperatorio de mayor que 0,1 ng /ml, según lo confirmado por al menos 1 subsiguiente valor creciente ( aumento de PSA persistente) después de lograr PSA indetectable después de la operación, que se define como un límite de detección de menos de 0,04 ng /ml.RT-qPCR, cuantitativa en tiempo real PCR, TMA, los microarrays de tejidos, PSA, antígeno específico de la próstata, el estadio T, el estadio del tumor, N etapa, metástasis de ganglios linfáticos etapa, M etapa, metástasis etapa. Descargar CSV CSV
Los tejidos se congelaron rápidamente directamente después de la cirugía y las muestras como se describe anteriormente [6]. En pocas palabras, las áreas del tumor y el tejido normal se identificaron mediante tinción con hematoxilina-eosina por un patólogo y Punch-biopsia con una aguja matriz de tejido micro. Sólo núcleos con contenido tumoral al menos el 90% se consideraron para su posterior análisis.
LNCaP, DU-145, PC3 y células 22rv-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA,) suplemento con 10% de suero de ternera fetal y penicilina /estreptomicina. Las células se cultivaron en una incubadora a 37 ° C en atmósfera de 5% CO2. células HPB-1 fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal 20%, 20 ng /ml DHT, ml de transferrina, 5 ng selenito de 5 mg //l de sodio y 5 ng /l de insulina. Las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) o en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ). Las líneas celulares y se controlan periódicamente para la contaminación micoplásmicas por RT-qPCR según van Kuppeveld et al [17]. Además, la identidad de las células del cáncer de próstata fue verificado por el Consorcio de Cáncer de próstata alemán.
fue utilizado microarrays de tejidos
fijados con formalina, tejido incluido en parafina de 64 pacientes para la construcción de un microarray de tejido como se describe anteriormente [18]. tinción de hematoxilina-eosina se realizó para identificar áreas malignos y benignos. Las áreas de interés fueron punch-biopsia con una aguja microarray de tejido de 1,5 mm y se transfieren al bloque receptor. Cada tumor estuvo representado por un núcleo. El tejido normal del colon, páncreas, riñón y próstata 2 y el tejido conectivo se utilizó como control.
aislamiento de ARN
El ARN total a partir de cultivos de células y tejidos frescos congelados fue aislado utilizando el Minikit miRNeasy (Qiagen , Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante tal como se describe previamente en detalle [6].
para la extracción de RNA total de cultivo de células, las células se sembraron en placas de 6 pocillos en una concentración final de 3 x 10
5 células por pocillo y se transfectaron como se describe a continuación. Después de 24 horas se recogieron, 1 x 10
6 células en Qiazol (Qiagen).
rendimiento de ARN y la relación A260 /280 fueron monitorizados con un espectrómetro de Nano gota ND-100 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y los números de ARN de Integridad (RIN) se evaluaron con un 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Sólo las muestras de ARN con una RIN & gt; 6 se incluyeron en los análisis.
cuantitativos PCR
niveles de mRNA en tiempo real se analizaron por RT-qPCR. ARN de las células se sometió a transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa Omniscript y cebadores oligo-dT (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las reacciones se realizaron en un volumen total de 20 l utilizando 1 g de ARN total. Las reacciones se incubaron con un paso uno ciclador térmico (Applied Biosystems, Foster City, CA). La cuantificación de la FOXO1 partir de líneas celulares se realizó utilizando los 2 x Fast SYBRgreen Mastermix (Applied Biosystems) utilizando ADNc 1 l de 20 l de volumen total. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1. Los cebadores se diseñaron para producir un amplicón de expansión al menos 1 intrón. La especificidad de la amplificación se aseguró por medio de chorro de imprimación y análisis de curva de fusión.
ARNm a partir de muestras de tejido se sometió a transcripción inversa utilizando el kit de Transcriptor Primera Strand cDNA Synthesis (Roche, Mannheim, Alemania) a partir de 1 g de ARN en 20 l de volumen total de . La cuantificación de la FOXO1 se realizó mediante sonda UPL#11 (Roche) y Universal Sondas Maestro Mastermix (Roche) en 10 l de volumen total.
miRNAs fueron detectados por RT-qPCR utilizando el miARN ensayo TaqMan tal como se describe anteriormente [6 ].
Todas las muestras se realizaron por triplicado y el valor de la media y se calcularon. FoxO1 expresión se normalizó a TUBA1B [19], mientras que el miR-96 se normalizó a miR-130b [6]. Las curvas de calibración se midieron para cada gen para corregir la eficiencia (FoxO1: E = 1,95; TUBA1B: E = 1,96; miR-96: E = 1,83; miR-130b: E = 1,83). La normalización se realizó como se describió anteriormente [6].
La construcción de vectores de luciferasa
Objetivo gen 3 'UTR secuencias fueron clonados en el vector de informe PMIR (Ambion Austin TX, EE.UU.). Las secuencias diana de la FoxO1 3 'UTR se amplificaron a partir BPH1 ADNc usando AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y cebadores específicos de genes (Tabla S1), clonado en el pCR 2.1-TOPO vector (Invitrogen) y amplificada en TOP10 células químicamente competentes (Invitrogen). El plásmido de ADN a partir de clones positivos se extrajo con el QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) y se envía a secuenciación utilizando M13 uni (-21) y M13 rev (-29) cebadores (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg, Alemania). Las digestiones de restricción de los vectores pCR2.1 positivas y los vectores de informe PMIR se realizaron con SacI y SpeI (New England Biolabs, Ipswich, MA). inserciones y restringidas informe PMIR vector se ligaron utilizando 1 U de T4 ADN ligasa (Invitrogen) y se amplificaron en células DH5a químicamente competentes (Invitrogen). Los clones positivos se identificaron mediante PCR de colonias. El ADN del plásmido se aisló utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen).
La transfección de líneas celulares de CaP con pre-miRNAs, inhibidores de miRNA y el plásmido de ADN
p>
Ensayo
luciferasa gen reportero
células LNCaP fueron cultivadas a 80% de confluencia y se sembró en 6 -Bueno placas a una densidad final de 2 x 10
5 células por pocillo. Cuarenta y ocho horas después de la transfección las células fueron separadas con un raspador y la proteína total se extrajo en 80 l de tampón de lisis (Applied Biosystems). Luciferasa y la actividad β-galactosidasa en los extractos se detectaron usando el sistema de doble luz combinada gen reportero de ensayo (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de luciferasa se normalizó a ß-galactosidasa expresión. Cada reacción se realizó por duplicado y los resultados se muestran como media de tres ensayos independientes.
Western Blot
Para la extracción de proteína total del cultivo de células, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos en una concentración final de 3 x 10
5 células por pocillo y se transfectaron como se describe anteriormente. La proteína se extrajo después de 72 horas en 100 tampón NENT l (20 mM de Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, 2% de NP40, 0,2% SDS, pH 7,5) o tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,5 % desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, Tris base 50, 100 mM PMSF, 1 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de inhibidor de tripsina de soja, EDTA 2 mM). La proteína total se resolvió en 10% de geles de SDS-PAGE y transferidos a una membrana de 0,45 micras polivinildifluoruro. El Membranas fue bloqueada por 2% de leche desnatada y se sondeó con los siguientes anticuerpos: conejo anti-FoxO1 pAb, ratón anti-ACTB MAB (Sigma Aldrich, Munich, Alemania), de conejo anti-Akt pAb, conejo anti-pAkt Pab (Señalización Celular tecnologías, Danvers, MA), y de cabra anti-conejo, conjugado con HRP o conejo anti-ratón, conjugado con HRP Ab secundario (Dako, Hamburgo, Alemania). Las membranas se tiñeron con ECL (Pierce, Bonn, Alemania) o solución avanzada de la ECL (GE Healthcare, Munich, Alemania) durante 5 min y se desarrollaron en el fluoro-S MultiImager (BioRad, Munich, Alemania). Para determinar la concentración de proteína relativa, intensidad de la banda se calculó con ImageJ 1.43r (http://rsb.info.nih.gov/ij) y normalizado a ß-actina.
ensayo y análisis de ciclo celular
proliferación de las células pre-miR-96 transfectadas LNCaP se evaluó mediante la conversión metabólica del ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil bromid de tetrazolio (MTT) (Sigma Aldrich). Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia y se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración final de 6 x 10
3 células por pocillo y se transfectaron como se describe anteriormente. Las células se dejaron en reposo durante 24 horas y posteriormente fueron suero de hambre. Los cultivos se incubaron en 5 mg /ml de MTT durante 4 h y se lisaron en 10% de SDS en HCl 0,01 M. Los lisados se incubaron a 37 ° C durante la noche y se midió la absorbancia del formazán a 550 nm. Cada reacción se realizó por triplicado y los resultados se muestran como media de tres ensayos independientes. Para las células de análisis del ciclo celular se cultivaron hasta 80% de confluencia y se sembraron en placas de 6 pocillos a una concentración final de 1,5 x 10
5 células por pocillo y se transfectaron como se describe anteriormente. Las células se dejaron en reposo durante 24 horas y posteriormente se privaron de suero durante 24 horas. Las células se tiñeron con yoduro de 20 mg /ml de propidio suplementado con 200 mg /ml de ARNasa en 0,1% de Triton X-100 y se analizaron utilizando el citómetro de flujo FACSscan y el Software CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). Cada muestra se midió por duplicado y los resultados se presentan como media de tres ensayos independientes.
cicatrización de heridas ensayo
Para evaluar la phenotyp migrative de las células DU-145 sobre el miR-96 se realizó la transfección un ensayo de cicatrización de heridas. Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia, se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron como se describe anteriormente. Las células se dejaron crecer hasta la confluencia y la monocapa se rayó con una punta de pipeta de 100 l. Prestaciones de retorno de las células a la herida se evaluó mediante la vida de imágenes de células durante 24 h en la privación de suero. Porcentaje de área abierta se midió con el software TScratch software [20] en los puntos de tiempo definidos (0,5,10,15,20 h). Todos los valores se normalizaron al porcentaje de área abierta en 0 h. Se analizaron dos áreas elegidas al azar de cada uno de cero. Los datos se representan como media de tres ensayos independientes.
Apoptosis ensayo
células LNCaP y DU145 se cultivaron hasta 80% de confluencia y se sembraron en placas de 6 pocillos a una concentración final de 2 x 10
5 células por pocillo y se transfectaron como se describe anteriormente. La apoptosis se indujo con 10 mM de camptotecina (CPT) (Sigma Aldrich) en medio libre de suero durante 24 h. Las células se tiñeron con Anexina V-FITC (Invitrogen) y yoduro de propidio (PI) (Invitrogen) Los cultivos se analizaron mediante el flujo FACSscan citómetro y el Software CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). Cada muestra se midió por duplicado y los resultados se presentan como media de tres ensayos independientes.
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó en 2 micras diapositivas de la micromatriz de tejido como se describe anteriormente [21]. En resumen, el tejido se deparaffinized en xileno y los antígenos se desenmascarado en una olla a pressur. Los portaobjetos se probaron con conejo anti-FoxO1 mAb (Tecnologías de Señalización Celular), biotinilado enlazador-Ab y Ab secundario conjugada con estreptavidina (DAKO) y se tiñeron con rojo rápido a la intensidad deseada. Los núcleos se counterstained con haemalaun. Las láminas fueron cubiertos usando Aquatex medio de montaje (Merck KGH, Darmstadt, Alemania). La tinción de FoxO1 se analizó en las glándulas tumorales y tejido adyacente normal para cada paciente si es aplicable. Desde tinción general para FoxO1 ser débil, se anotó como presente (1) o ausente (0) solamente.
En la investigación de destino silico
En busca de destino silico de miR-96 objetivos era realizadas utilizando miRecords (http://mirecords.biolead.org/). Se utilizó el criterio de que un objetivo putativo tuvo que ser detectado por TargetScan, Miranda, PicTar y otros dos algoritmos de predicción. Localización de sitios de unión de miR-96 en el 3 'UTR de FoxO1 se analizaron mediante TargetScan 5.1.
Los análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc versión 10.3.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica) o SPSS 19.0 (IBM, Somers, Nueva York). La prueba t de Student, de una vía o de dos vías ANOVA, prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnof, prueba de Wilcoxon, prueba de McNemar, el análisis de Kaplan-Meier y regresión de Cox de riesgos proporcionales se lleva a cabo. Todas las pruebas se llevaron a cabo dos colas y P-valores. & Lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Caracterización funcional de miR-96
Hemos informado anteriormente de que miR 96 es regulada al alza y predice la recaída bioquímica en el anuncio de cáncer de próstata, por tanto, la hipótesis de una función oncogénica de miR-96 en la próstata. La mayor expresión de miR-96 expresión en células de cáncer de próstata líneas en comparación con la línea celular benigna de próstata HBP-1 (Figura S1 A) señaló además una función oncogénica. Establecer un papel funcional de miR-96, las células LNCaP y DU145 se transfectaron con el miR-96 moléculas precursoras sintéticos o el inhibidor antisentido. En primer lugar, se evaluó el papel de miR-96 en la proliferación celular. células LNCaP y DU145 transfectadas con miR-96 mostraron una tasa de proliferación más alta en comparación con los controles de transfección (Figura 1A + B). Este efecto pro-proliferativa se invirtió parcialmente por la co-transfección con su inhibidor antisentido.
células LNCaP y DU145 fueron transfectadas con 10 nM de pre-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC#1 o combinación de pre-miR-96 y anti-miR-96. El efecto en LNCaP (A) y (B) DU145 sobre la proliferación celular bajo la privación de suero se midió por el ensayo de MTT durante tres días. Todos los datos se normalizaron sobre la proliferación de los cultivos de control en el día 1 y se muestran como media (± SD) de tres ensayos independientes. * P & lt; 0,05, ANOVA de dos vías. transición del ciclo celular se midió mediante tinción con PI en transfectadas LNCaP (C) y las células DU145 (D). Las células se privaron de suero un día después de la transfección durante 24 horas y posteriormente se fijaron y se tiñeron. , La fase G1 negro; gris claro, la fase S; , G2 /M fase de color gris oscuro. Los datos se muestran como la media de tres ensayos independientes. Apoptosis en CPT-tratado (E) células LNCaP y DU145 (F). 24 h después de la transfección las células se trataron con 10 CPT mu M durante 24 h. Las células se tiñeron con Anexina V-FITC y PI. Fracción de los primeros (barras negras) y tardías (barras blancas) en apoptosis se midió por citometría de flujo. Los datos se muestran como la media (+ SD) de tres ensayos independientes. * P & lt; 0,05; después de la prueba de Bonferroni (P & lt; 0,001, ANOVA de dos vías).
A continuación, se abordó la cuestión de si esta mayor proliferación podría ser debido a una liberación de control del ciclo celular o la disminución de la apoptosis. Para determinar el efecto de miR-96 en la regulación del ciclo celular, el número de células LNCaP y DU145 en G1, S o G2 /M fase se evaluó por citometría de flujo después de la transfección con miR-96 en las células privadas de suero. La mayoría de las células LNCaP fueron en G1 en virtud de la privación de suero (71,0 a la 76,7%) y las fracciones más pequeñas estaban en fase S (4,8 al 5,3%) o en G2 /M (18,6 a la del 23,7%, Figura 1C). No hubo diferencias significativas (segunda forma-ANOVA, p = 0,12) en transición del ciclo celular en las células transfectadas con miR-96 precursores y los inhibidores en comparación con los controles. DU145 se transición más rápido a través del ciclo celular, resultando en un mayor número de células en G2 /M (30,1 a 34,4%) y la fase S (19,2-22,7%) y menos células en G1 (43,9 a 50,7, la Figura 1D). No se observaron diferencias significativas en la transición del ciclo celular después de la transfección, afirmando de este modo las observaciones en células LNCaP (Segunda ANOVA de una vía, p = 0,2).
A medida que la mayor proliferación no puede ser explicado por el aumento de transición del ciclo celular, se investigó el efecto de miR-96 de transfección sobre la apoptosis. células LNCaP y DU145 se transfectaron con pre-miR-96, miR-96 o inhibidores revueltos control y la apoptosis se indujo con 10 M camptotecina (CPT). apoptosis inducida por CPT en los cultivos de control LNCaP con 13,2% de células apoptóticas y principios de 5,6% de células apoptóticas tarde y en las células DU145 (24,2% temprano y 5,9% de células apoptóticas tarde) (Figura 1E + F). La transfección transitoria con miR-96 precursores reduce la fracción de apoptosis temprana y finales de células apoptóticas por 28% (LNCaP) y 25% (DU145) (Segunda vías ANOVA, P & lt; 0,001). La especificidad del efecto observado de miR-96 fueron confirmados por el miR-21, que sirvió como control positivo [22] y exhibió una inhibición similar de la apoptosis y miR-16, que sirvió como control negativo y no afectó a la apoptosis en las las células del cáncer de próstata.
además, investigó la migración de las células DU-145 tras la transfección con el miR-96. DU-145 mostró un fenotipo migrative y fueron capaces de volver a migrar a 60% del área de la herida inicial dentro de los 20 h (Figura S2). La transfección con miR-96 precursor o miR-96 inhibidor no tuvo efecto sobre la migración de células en comparación con la transfección con el control revueltos o de control no transfectadas (Segunda Way-ANOVA, p = 0,71).
Identificación de miR 96 genes diana
para identificar los objetivos regulados, lo que potencialmente dan cuenta de los efectos apoptóticos, se realizó en busca de destino silico en miRecords y considerado la predicción sólo es válido si el objetivo fue identificado por Miranda, TargetScan y PicTar, y dos los algoritmos de predicción adicionales. De este modo, se identificaron 209 objetivos de miR-96 (S2 tabla). Además, se analizaron el conjunto de genes objetivo previsto con respecto a su ontología de genes (GO) términos para identificar los genes relacionados con la apoptosis. 21 de los 209 predijo miR-96 blancos tenían una relacionada con la apoptosis GO término asignado (tabla S2). También se investigó el número de sitios de unión y su conservación evolutiva en TargetScan 5.1. y realizó una búsqueda bibliográfica para identificar objetivos con una función tumorsuppressive conocido en el CaP. Uno de los objetivos previsto, FoxO1 fue elegido para una validación adicional debido a su función tumorsuppressive conocido en el cáncer de próstata. Correlación de miR-96 y la transcripción FoxO1 expresión en células LNCaP y DU145 muestra una correlación inversa de expresión (Figura S1 A + B). El FoxO1 3 'UTR alberga dos de 8-mer miR-96 sitios de unión en la posición 264-270 y la posición 2138-2145. Mientras que el primero sitio de unión está altamente conservada, el segundo sitio de unión no es miRNA. Hemos construido luciferasa-reporteros que contienen secuencias de 200-300 pb de longitud que encierran los sitios objetivo previsto. La co-transfección de ambos FoxO1 3 'reporteros de luciferasa UTR con pre-miR-96 en las células LNCaP mostraron una reducción del 40% de la actividad luciferasa en comparación con el control de transfección (ANOVA de una vía, P & lt; 0,01), mientras que la transfección con el miR 96 inhibidor o control mezclado no afectaron significativamente la actividad de la luciferasa (Figura 2A). Además de las secuencias antisentido de miR-96 lanzó su inhibición sólo ligeramente. Aunque el segundo sitio de unión de miR-96 en el FOXO 3 'UTR se conserva sólo parcialmente, una actividad de unión similar con reducción del 42% de la actividad de la luciferasa; se observó en comparación con el control (Figura 2B) (ANOVA, P & lt; 0,05). La adición de la secuencia antisentido miR-96 disminuye parcialmente este efecto, mientras que la secuencia antisentido solo no afectó a la actividad de luciferasa. La secuencia de los genes miARN revueltos resultó en una pequeña, pero no una inhibición significativa de la actividad de luciferasa.
células LNCaP fueron transfectadas con 10 nM pre-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC#1 o combinación de pre-miR-96 y anti-miR-96, así como 500 ng informe PMIR β-galactosidasa plásmido de control y 500 ng PMIR informe plásmido para FoxO1 3 'UTR a) sitio de unión 1 en la posición 264-270 y B) de unión El sitio 2 en la posición 2138-2145. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey posterior
Reducción de miR-96 expresión del gen diana in vitro
miRNAs. se sugieren para inhibir principalmente la traducción de proteínas, pero algunos miRNAs también se han demostrado que conducen a una degradación al menos parcial de los ARNm correspondiente [23]. Para establecer el mecanismo principal por el cual el miR-96 inhibe la FOXO1 en el CaP y para demostrar que la unión mecánica de miR-96 a la 3-UTR puede resultar en una disminución de expresión de FoxO1, transfectadas las células LNCaP y DU145 con miR-96 precursor y /o el inhibidor. miR-96 niveles en ambas líneas celulares eran 400 veces mayor en las células transfectadas miR-96 y en las células cotransfectadas, en comparación con los cultivos de control (ANOVA, P & lt; 0,001; Figura 3A + B). Correspondientemente, FoxO1 mRNA se redujo más de dos veces en el miR-96 células transfectadas (ANOVA, P & lt; 0,01, Figura 3C + D), mientras que la transfección con la secuencia antisentido miR-96 y el miARN revueltos no mostró ningún efecto en FoxO1 los niveles de expresión (Figura 3C + D). Adicional a la reducción de la transcripción FoxO1, se observó una reducción de 1,6 veces y 2,6 veces de la proteína FoxO1 en células LNCaP y DU145 a la sobreexpresión ectópica de miR-96 precursora, mientras que los niveles de proteína no se alteraron de manera significativa en las células transfectadas con el MIR -96 inhibidor o el control mezclado (Figura 3E + F, Figura S3 A + B). Tomados en conjunto, los datos apoyan la hipótesis de que el miR-96 inhibe la expresión FoxO1.
células de cáncer de próstata fueron transfectadas con 10 nM pre-miR-96, anti-miR-96, pre-miR-NC#1 o combinación de pre-miR-96 y anti-miR-96. miR-96 expresión en LNCaP (A) y las células DU145 (B) y la expresión FoxO1 en (C) y las células LNCaP DU145 (D). Los datos se muestran como la media (+ SD) de tres ensayos independientes. ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, ANOVA de una vía. FoxO1, expresión de la proteína AKT, y pAKT en (E) células LNCaP y DU145 (F) fue visualizado por Western Blot. ß-actina se utilizó como control de carga.
FoxO1 actividad está directamente regulada por la fosforilación por Akt de las señales de crecimiento externo, lo que resulta en translocalization del núcleo. Para comprobar si la sobreexpresión de miR-96 altera significativamente la señalización Akt aguas arriba, se evaluó la expresión de Akt y Akt fosforilada en el miR-96 células que sobreexpresan. Ni Akt ni los niveles de Akt fosforilada se alteraron de manera significativa después de la transfección con miR-96 precursores o inhibidores (Figura 3E + F), lo que demuestra que la actividad de FoxO1 no fue afectada por cambios en la expresión o la actividad de Akt.
Para apoyar aún más la hipótesis de que el miR-96 controles FoxO1 en cáncer de próstata y por lo tanto protege a las células de la apoptosis, transfectadas las células LNCaP y DU145 con una longitud total de cDNA FoxO1. La expresión ectópica de FoxO1 resultó en una fuerte regulación por incremento de FoxO1 como validado por RT-PCR y westernblotting tanto en células DU145 (Figura 4A-D) y LNCaP. Debido a la fuerte intensidad de la tinción de FoxO1 en las células transfectadas, FoxO1 en células de control no es todavía visible en la transferencia y sólo se hizo visible después de tiempos de exposición más largos. La co-transfección con el miR-96 redujo los niveles de ARNm FoxO1 de 2.5 y 1.7 veces mayor en células LNCaP y DU145 (ANOVA de una vía, p & lt; 0,001), mientras que los niveles de proteína se redujeron en un 2,8 y 2.1- veces (Figura 4 C + D, Figura S3C + D).
células LNCaP y DU145 se transfectaron con 500 ng FoxO1 clon de longitud completa o vector vacío, 10 nM pre-miR-96 o pre-miR-NC 1 #. expresión FoxO1 en células (A) LNCaP y DU145 (B). Los datos se muestran como la media (+ SD) de tres ensayos independientes. *** P & lt; 0,001, ANOVA de una vía. expresión de la proteína FoxO1 en LNCaP (C) y las células DU145 (D) fue visualizado por Western Blot. ß-actina se utilizó como control de carga. La apoptosis en las tratadas con CPT (E) LNCaP y DU145 (H) de las células. 24 h después de la transfección las células se trataron con 10 CPT mu M durante 24 h. Las células se tiñeron con Anexina V-FITC y PI. Fracción de los primeros (barras negras) y tardías (barras blancas) en apoptosis se midió por citometría de flujo. Los datos se muestran como la media (+ SD) de tres ensayos independientes. ns, P & gt; 0,05, * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, ANOVA de dos vías, después de la prueba de Bonferroni). transición del ciclo celular se midió mediante tinción con PI en transfectadas LNCaP (F) y las células DU145 (I). Las células se privaron de suero un día después de la transfección durante 24 horas y posteriormente se fijaron y se tiñeron. , La fase G1 negro; gris claro, la fase S; , G2 /M fase de color gris oscuro. Los datos se muestran como la media de tres ensayos independientes. *** P & lt; 0,001, ANOVA de una vía. Análisis de pico subG1 en LNCaP (G) y las células DU145 (J). Los datos se muestran como la media de tres ensayos independientes. *** P & lt; 0,001, ANOVA de una vía
En el siguiente paso, se evaluó, si FoxO1 tiene un papel opuesto al miR-96 en células de cáncer de próstata y si el efecto podría ser rescatado. por cotransfección con miR-96. FoxO1 fuertemente inducida por la apoptosis en ambas líneas celulares (ANOVA de dos vías, P & lt; 0,001, Figura 4E + H). El tratamiento con CPT sólo tenía un efecto adicional suave en las células. la sobreexpresión simultánea de miR-96 rescató parcialmente la apoptosis inducida FoxO1 en no tratado así como las células tratadas con CPT, aunque el efecto era pequeño y no significativo en todos los tratamientos (Figura 4E + H).
proliferación también se redujo fuertemente en FoxO1 transfectadas las células LNCaP y DU145, pero el miR-96 no revirtió significativamente el efecto (Figura S4A + B).