Extracto
Identificación de perfiles de expresión génica de las células madre del cáncer puede tener importantes implicaciones en la comprensión de la biología del tumor y para el diseño de nuevos tratamientos dirigidos hacia estas células. Aquí mostramos un posible perfil de expresión génica de células madre de cáncer de ovario de población aislada lado de ascitis frescas obtenidas de mujeres con alto grado papilar etapa avanzada adenocarcinoma de ovario seroso. microarrays de Affymetrix U133 Plus 2.0 se utilizaron para interrogar a los genes expresados diferencialmente entre la población lateral (SP) y la población principal (MP), y los resultados fueron analizados por ensayo T por parejas utilizando BRB-ArrayTools. Se identificaron 138 hasta regulados y 302 genes regulados que son expresados diferencialmente entre todos los pares 10 SP /MP. datos de microarrays se validó mediante qRT-PCR y 17/19 (89,5%) los genes mostró correlaciones sólidas entre los datos de expresión QRT-PCR y microarrays. El análisis Pathway Studio identificado varios genes implicados en la supervivencia celular, la diferenciación, proliferación y apoptosis que son únicos para las células SP y un mecanismo para la activación de la señalización de Notch se identifica. Para validar estos resultados, hemos identificado y aislado células SP enriquecidas para células madre del cáncer de líneas celulares de cáncer de ovario humano. Las poblaciones SP estaban teniendo una mayor eficiencia de formación de colonias en comparación con su contraparte MP y también capaz de una expansión sostenida y la diferenciación a SP y MP fenotipos. 50.000 SP células del tumor producidos en ratones desnudos, mientras que el mismo número de células MP no dieron ningún tumor a las 8 semanas después de la inyección. Las células SP demostraron una sensibilidad dependiente de la dosis de inhibidores específicos gamma-secretasa que implican el papel de la vía de señalización de Notch en la supervivencia celular SP. Además se encontró el gen lista SP generada para ser enriquecido en los tumores de cáncer de ovario recurrente
Visto:. Vathipadiekal V, D Saxena, Mok SC, Hauschka PV, Ozbun L, Birrer MJ (2012) La identificación de un potencial de ovario madre del cáncer de expresión génica de células Perfil de la etapa avanzada papilar cáncer de ovario seroso. PLoS ONE 7 (1): e29079. doi: 10.1371 /journal.pone.0029079
Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: 21 Noviembre 2011; Publicado: 17 Enero, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud (5R01CA142832-02 216.288 2009A051746, 1RC4CA156551-01 217.168 y un 2010A053125 Programa de Investigación intramural del Instituto Nacional del cáncer) para MJB. PVH y DS fueron apoyados por becas de la CDMRP-DOD (W81XWH-06-1-0422 y 09-1-0292-W81XWH), Susan G. Komen for the Cure (BCTR 0.600.935), y la Fundación de Cirugía Ortopédica, Hospital de Niños Bostón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es la quinta causa principal de. muerte en mujeres en los Estados Unidos. En 2010, habrá un estimado de 21.880 nuevos casos y 13.850 muertes por Caner ovario en los Estados Unidos [1]. Aunque la tasa de supervivencia a 5 años es & gt; 90% para las mujeres con cáncer de ovario en estadio temprano, alrededor del 80% de las mujeres presentan con enfermedad en etapa tardía y tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 30%. El tratamiento estándar incluye cirugía citorreductora con quimioterapia combinada de primera línea [2]. El 75% de los pacientes que inicialmente responden a la quimioterapia convencional, sin embargo, & gt; 80% de estas mujeres finalmente recaída y mueren a causa de la quimioterapia resistente a las enfermedades [2]
Hay evidencia creciente de que las pequeñas poblaciones de células dentro de los tumores llamados cáncer. células madre (CSC) contribuye al mantenimiento y progresión del tumor y son intrínsecamente resistentes a las terapias diseñadas para destruir las células que se dividen rápidamente [3], [4], [5], [6], [7]. CSC se han descrito de varios cánceres sólidos humanos, como el de mama [8], el cerebro [9], [10], colon [11], [12], cabeza y cuello [13], y cáncer de páncreas [14]. Los experimentos realizados sobre la leucemia humana mieloide aguda [15] y tumores sólidos [8], [9] muestran que la visualización de los CAC tres características funcionales: 1) que tienen el potencial tumorigénico para formar tumores cuando se inyectan en ratones desnudos, 2) que exprese superficie distinta marcadores permite la purificación reproducible y diferenciado, y 3) tienen la capacidad de recrear la heterogeneidad fenotípica completa del tumor padre [16], [17]. Así, la definición de CSC es una funcional y comparte dos características funcionales importantes con las células madre normales:. Auto-renovación y diferenciación [3], [7]
La dificultad en la caracterización de las células normales y es madre de cáncer, estas poblaciones de células son raros y la ausencia de marcadores de superficie celular específicos representa un desafío para aislar e identificar poblaciones de células madre puras. La incapacidad para aislar una población pura de células madre ha creado un intenso debate sobre el modelo CSC [18], [19], [20]. Varios marcadores de células madre (CD133, CD44, Sca1) se han utilizado con éxito para aislar células madre en el tejido normal y el tumor [21], [22], [23]. Sin embargo, ningún marcador ha identificado que es exclusivamente presentes en las células madre [7]. marcadores de superficie celular que se encuentran en las células madre de un tejido no siempre son útiles para la identificación de células madre a partir de otro tejido, ya que muchos de estos marcadores también se encuentran en las células no madre de tejidos y órganos [7].
Goodell no relacionados et al reportado por primera vez una pequeña población de células que muestran una clara FACS perfil a un lado de la principal población debido a una mayor eficiencia de flujo de salida de colorante Hoechst y baja señal de intensidad de fluorescencia [24]. Este subconjunto de células se conoce como la población lateral (SP) y está enriquecida para las células madre hematopoyéticas de la médula ósea murina [24]. Muchos estudios de SP se han realizado en un número de cánceres tales como leucemias, cerebro, próstata, tracto GI, melanoma, retinoblastoma, y muchas líneas celulares de cáncer, que conduce a la hipótesis de que la SP está enriquecida con CSC [8], [25 ], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Ahora se ha demostrado que el cáncer de ovario, como muchos otros tumores, contiene células SP que, aparentemente, se corresponden con las células madre cancerosas responsables del crecimiento del tumor [32], [33]. SP células de cáncer de ovario se han demostrado por su sensibilidad hacia la sustancia inhibidora de Müller e IFN-α [32], [33]. Proponemos la población lado de la ascitis de las mujeres con alto grado papilar etapa avanzada adenocarcinoma de ovario seroso sería enriquecida para las células madre, como el cáncer, y sin expresar una tendencia firma genética para "troncalidad" en las células madre, como el cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
ascitis frescas se obtuvo a partir de 10 mujeres con adenocarcinoma de ovario en estadio avanzado de alto grado en el momento de la cirugía citorreductora primaria del hospital Brigham y de mujeres de Boston , MA. Todas las muestras fueron recogidas bajo los protocolos aprobados por las juntas de revisión institucional del Hospital Brigham y de la Mujer y se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes. cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y la aprobación por parte del Comité de Cuidado y Uso de Animales MGH (Protocolo no. 2009N000148).
muestra tumoral y el aislamiento de las subpoblaciones de células
ascitis frescas se obtuvieron de 10 mujeres con adenocarcinoma de ovario en estadio avanzado de alto grado en el momento de la cirugía citorreductora primaria del hospital Brigham y de mujeres de Boston, MA. Las muestras de ascitis se centrifugaron a 1400 RPM para aislar las células. Después de la lisis de los eritrocitos, las células restantes se sembraron y se cultivaron en placas de cultivo sin pases. Antes de la clasificación, las células se tiñeron con CD45 para descartar la contaminación con células de la sangre y con el anticuerpo CA125 para confirmar el origen de ovario de estas células. CD 45 y CA 125 análisis se realizaron utilizando FACS. anticuerpos CD45 y CA125 se compraron de Invitrogen y BioLegend respectivamente. Entre el día 7 y 10 células se tiñeron con Hoechst33342 o 0,5 mg /ml de rodamina 123 (Rho) [34] y ordenadas en una FACSAria BD equipado con un láser violeta. Los experimentos de control verifican que el Hoechst
DIM
vs. RHO
Población lado DIM (SP) fracciones aisladas por ambos métodos fueron similares por la abundancia% y el perfil de expresión génica.
Affymetrix hibridación GeneChip y adquisición de imágenes
el ARN total se extrajo de la SP y MP utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD). la calidad del RNA total se comprobó primero por Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) antes de la manipulación adicional. Se utilizaron dos rondas de amplificación como se describe anteriormente [35]. La hibridación, el procesamiento y la adquisición de imágenes se llevó a cabo como se describe anteriormente [35].
Datos
La normalización de datos y el análisis
Todos los datos de la matriz es mínima información sobre un experimento de microarrays (MIAME) conforme y el crudo tiene sido depositado en una base de datos compatible con MIAME (GEO, el Número de Acceso: Serie GSE33874)
GeneChip imágenes y conjuntos de datos se cargan en base de datos de análisis de microarrays del Instituto Nacional del cáncer (MADB) para la evaluación (http: //nciarray.nci .nih.gov /index.shtml). El análisis a nivel de baja gama incluye la normalización y la estimación del nivel de expresión. Esto se logró mediante la normalización conjunto invariante para ajustar el nivel de la señal global de las matrices para el mismo nivel de comparación adicional [36]. A continuación, se aplicó un enfoque basado en el modelo para calcular el nivel de expresión génica. El análisis de bajo nivel se realizó utilizando datos normalizados MAS5.0 en el software BRB ArrayTools versión 3.6.0 diseñado por el Dr. Richard Simon y Amy Peng Lam de la Rama de Investigación Biométrica, NCI, NIH.
real cuantitativa PCR en tiempo
QRT-PCR se realizó en 50 ng de ARN amplificado utilizando un Sistema de iCycler en tiempo real de detección (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [37], utilizando el superíndice III Platinum SYBR Green One-Step QRT-PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Niveles relativos de expresión de cada gen se obtuvieron mediante la normalización de los niveles de expresión de tres genes de limpieza (
ciclofilina, GUSB, GAPDH
) [38]. En tiempo real los valores de expresión de PCR se utilizaron para análisis de correlación con la intensidad de la señal de microarrays. Pearson 'y' Spearman rango de correlación se realizó utilizando GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Las líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3, A224, OVCAR-3, y UCI-107 se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina /estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% de CO
2 a 37 ° C como se describe por Mok et al [39].
citometría de flujo análisis
Las células se separaron mediante tripsinización, se centrifugaron y se resuspendieron en medio de cultivo tisular que contiene 2% de suero a una concentración de 1 × 10
6 células /ml. Las células se marcaron con 5,0 g de colorante /ml Hoechst33342 a 37 ° C durante 90 min ya sea solo o en combinación con inhibidor de la bomba de eflujo de ABCB1 verapamil (100 M). Al final de la incubación las células se centrifugaron en el frío y se resuspendieron en medio fresco fría con 2% de suero. 7-amino-actinomicina D (7AAD) se añadió a las células a una concentración final de 2 mg /ml antes del análisis FACS para excluir las células muertas del análisis. El análisis SP se realizó utilizando un sistema LSRII BD (BD Biosciences). El colorante Hoechst fue excitado con láser UV y su fluorescencia se midió con tanto 675LP (Hoechst rojo) y los filtros 440/40 (Hoechst azul).
La tinción para marcadores de células madre putativa
caracterización Inmunofenotípicos de SP células se llevó a cabo usando isotiocianato fluorescente (FITC), ficoeritrina (PE), y aloficocianina (APC) anticuerpos monoclonales conjugados. Antes de la tinción de anticuerpos, las células se tiñeron para células SP utilizando Hoechst 33342 como se describe anteriormente. Después, las células se lavaron y se incubaron con CD24-RPE (ABD Serotec), CD34-FITC (Miltenyi Biotec), CD44-FITC (AbD Serotec), CD117-PE (Miltenyi Biotec), y CD133-APC (Miltenyi Biotec) en PBS a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad. El ajuste de compensación de fluorescencia para citometría de flujo multicolor análisis se realizó utilizando BD CompBeads Ig anti-ratón, κ (BD Biosciences) y todos los análisis se llevó a cabo utilizando el Sistema de LSRII BD (BD Biosciences). Los anticuerpos FITC y PE se excitaron a 488 nm y se recogieron usando 530/30 nm (FITC), 575/26 nm filtros (PE). El anticuerpo APC se excitó a 633 nm y se recogió en 660/20 nm.
Colonia eficacia de formación de ensayo
Para el análisis de la eficiencia de formación de colonias (CFE), células SP y MP se sembraron en 100 células por pocillo en una placa de cultivo de seis tejido bien y se hicieron crecer durante 14 días. Después las células se fijaron con metanol frío durante 20 min a 4 ° C y se tiñeron con solución de cristal violeta 0,5% con el fin de contar el número de colonias por microscopía. El análisis se realizó para dos pasajes posteriores. la eficiencia de formación de colonias también se calculó como el porcentaje de células individuales que generó colonias en el día 14. Las células se tiñeron con colorante Hoechst y células individuales fueron ordenados usando FACS para MP y SP en una placa de 96 pocillos que contiene 200 l de medio de cultivo tisular. Las células se cultivaron durante 14 días antes de la fijación y tinción con una solución de metanol y el cristal violeta.
Anchorage crecimiento independiente
crecimiento independiente del anclaje se examinó por clonación en agar blando. A 7% stock de bajo gelificante de agarosa en PBS se diluyó en RPMI suero media /10% a una concentración final de 0,7% de agarosa. Para la capa de fondo, se añadieron 1,5 ml de 0,7% de agarosa para placas de 6 pocillos y se dejaron enfriar a 4 ° C. El sobrante de agarosa al 0,7% en los medios se diluyó adicionalmente en RPMI suero media /10% a una concentración final de agarosa de 0,35%. Para la capa superior, 2500 células (SKOV3) /5000 células (A224) se sembraron en 6 ml de 0,35% de agarosa. Después de la incubación durante 1 hora a 4 ° C, las placas se transfirieron a 37 ° C y se incubaron durante 14 días. Las células fueron teñidas durante la noche con 0,5 mg /ml de nitroazul de tetrazolio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y las colonias entre 100-2000 micras se contaron con el Biocount 4000P (Biosys, Alemania). Dos experimentos independientes se realizaron con cada muestra chapada por triplicado por experimento.
El crecimiento de las células SKOV SP y MP
in vivo
Mujer ratones desnudos atímicos (Balb /C atímicos ratones) se adquirieron en el río Laboratorios Charles (Wilmington MA, EE.UU.). Los ratones fueron utilizados en estos experimentos cuando tenían 4 a 6 semanas de edad. Para producir tumores, SKOV3-SP y MP (5 × 10
4 células /100 l de PBS) se inyectaron las células por vía subcutánea en la zona dorsal de los ratones. Para
in vivo
inyecciones, las células se clasifican en fracciones de SP y MP y se cultivaron durante 8 días. Después las células se trataron con tripsina y se centrifugaron a 800 rpm durante 7 minutos a 4 ° C, se lavó dos veces con PBS, y se reconstituyó en PBS (GIBCO /Invitrogen). Sólo una sola célula suspensiones con & gt; 95% de viabilidad., Según lo determinado por exclusión de azul de tripano, se utilizaron para la
in vivo
inyecciones
Repoblación de SP y MP por fracciones SKOV3 y A224 SP células
Las células se tiñeron con colorante Hoechst 33342 como se describe anteriormente para la clasificación. Las células SP ordenados y células MP se cultivaron por separado en las mismas condiciones durante 8 días antes de ser restained con Hoechst 33342 y volverse a analizar.
Efecto de la γ-secretasa Inhibidor IX (GSI-IX), las células SKOV3 SP y MP
El γ-secretasa Inhibidores GSI-IX (Calbiochem, EMD Biosciences Inc., La Jolla, CA) se disolvió en 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para hacer las soluciones madre (5 mg /ml), que a continuación, se diluyó en medio de cultivo para obtener las concentraciones deseadas. Las células SKOV3 SP y MP según fueron tratados con 10 y 20 mg de inhibidores de evaluar el efecto del inhibidor sobre la eficiencia de formación de colonias de las células. Las células de control SKOV3 SP y MP se trataron con DMSO en cantidades iguales a la concentración de DMSO necesario para solubilizar los inhibidores.
Enriquecimiento de la firma gen SP en pacientes con cáncer ovárico recurrente base de datos de expresión
El enriquecimiento de SP firma genética en pacientes con cáncer de ovario recurrente en comparación con el tumor primario se analizó utilizando las bases de datos de expresión clínica de cáncer de ovario humano. que contienen archivos de expresión de la información del paciente para seis muestras (12 primarias y recurrentes) estaban disponibles en nuestra base de datos clínicos. Hemos obtenido los valores de expresión para cada sonda conjunto utilizando el método robusto multichip media (RMA) de la biométrica Subdivisión de Investigaciones (BRB) Herramientas de matriz. Los conjuntos de sonda marcados como ausente fue excluido y los genes regulados positivamente única de SP firma genética de células se incluyeron en el análisis. QRT-PCR se llevó a cabo en muestras de tumor de ovario primarios y recurrentes utilizando genes seleccionados al azar de la lista de genes SP.
Resultados
perfiles de expresión de células SP /MP a partir de muestras de ascitis
la tinción positiva CA 125 usando FACS confirmó el origen ovárico de células aisladas de ascitis (Figura S1) y estas células se analizaron para determinar células SP y MP utilizando Hoechst y /o tinción Rho. Un gráfico representativo de la SP y MP tipo de muestra de ascitis se muestra en la Figura S2, y en todas las muestras de los pacientes la SP varió alrededor de 0,25% (Tabla 1). especímenes de ascitis no fueron examinados sin cultura, y para descartar la contaminación con células de la sangre, se utilizó sólo las células que fueron negativas para CD45 en nuestro análisis. SP aislados y subpoblaciones MP se subcultivaron y se obtuvieron los perfiles de expresión génica global utilizando los Affymetrix U133 Plus 2 matrices. Un conjunto de datos informativa de 16964 secuencias se generó después de la filtración inicial de los datos. 446 probesets expresados diferencialmente representan 432 genes fueron identificados por análisis de ensayo T por parejas en un significado de
P
& lt; 0,01. 142 probesets fueron reguladas, y 304 probesets se redujeron regulado, en el SP en comparación con el MP. Un mapa de calor que muestra los 438 probesets expresados diferencialmente para todas las muestras de SP y MP se muestra en la figura 1A.
(A) Mapa de calor que muestra el patrón de expresión de 438 probesets que discriminaban SP células a partir de células MP en pacientes con cáncer de ovario. columnas verticales representan muestras individuales; filas horizontales representan genes individuales. El color rojo y azul indica arriba y hacia abajo-regulación, respectivamente. (B) Validación de datos de microarrays utilizando QRT-PCR: 19 genes seleccionados al azar fueron utilizados para validar los datos de microarrays. Para el cálculo de la expresión relativa de cada gen, se utilizó la 2
método -ΔΔCT un promedio de los valores de CT para los tres genes de limpieza (ciclofilina A, GUSB, GAPDH) para un único valor de referencia de genes. (C) parcelas representativas para análisis de correlación entre los microarrays y QRT-PCR datos: El 2
valores -ΔCT (QRT-PCR) se representaron frente a los valores de intensidad de señal (microarrays). El análisis de correlación se realizó para cada gen mediante el método de Spearman de Pearson y de utilizando GraphPad Prism versión 4.00.
Los resultados de microarrays se validaron mediante la realización de análisis de QRT-PCR en 19 genes expresados diferencialmente seleccionados al azar. Las diferencias de expresión QRT-PCR para los genes sobreexpresados y bajo-expresados en el SP en comparación con el MP fueron validados para 17/19 genes (Figura 1B). La correlación de los datos generados con microarrays y QRT-PCR se analizaron mediante Pearson 'y' Spearman análisis de correlaciones de rangos (Figura S3 & amp; Tabla S1, S2). 17/19 genes mostraron correlaciones significativas entre los datos de microarrays de expresión y la expresión de datos qRT-PCR resultantes en un índice de validación de microarrays de 89,5%. Parcelas lineales de regresión de dos genes representativos (Kitlg y GEMIN6) se muestran en la figura 1C.
Identificación de las vías que contribuyen a la supervivencia del cáncer de ovario de células SP, auto-renovación y mantenimiento del tumor
de la señalización 438 genes regulados diferencialmente, poco se underexpressed más (68%) en las células SP en comparación con las células MP. La firma de genes expresados diferencialmente se enriqueció para genes en los procesos biológicos de ontología de genes (
P
& lt; 0,01) de la apoptosis, ciclo celular, la proliferación celular, el transporte, la transducción de señales, la transcripción, la traducción, la modificación de proteínas, el metabolismo y la proteolisis (Figura 2A). Una parte importante de los genes no eran asignados con cualquiera de las funciones biológicas, y que puede contener nuevos genes asociados con potenciales características de las células madre similares. Para identificar las vías asociadas con la supervivencia celular y la diferenciación SP se analizan los datos de microarrays utilizando Pathway Studio 6.0 (Ariadna Genómica) de señalización. La minería de datos para los procesos biológicamente relevantes muestra los procesos biológicos asociados con los genes expresados diferencialmente (Figura 2B). Los genes implicados en la función de células madre NUP normal [40], ST3Gal [41], LTBP [42] fueron upregulated en SP. Aparte de esto; SP células se manifestaban diferentes genes asociados con un mecanismo de apoptosis contra activa (Figura 2B)
(A) Gene ontología análisis de datos de microarrays (valor de P & lt; 0,01):. El diagrama circular muestra las funciones biológicas de la forma diferencial genes expresados entre células SP y MP. La firma gen fue enriquecido para los genes en el gen ontología procesos biológicos de la apoptosis, ciclo celular, la proliferación celular, el transporte, la transducción de señales, la transcripción, la traducción, la modificación de proteínas, el metabolismo y la proteólisis. Otro representa genes implicados en la respuesta de defensa, vasculogénesis, coagulación de la sangre, la percepción visual, la ontogénesis, adhesión de la matriz celular, y el inicio del crecimiento del folículo ovárico primordial. (B) Representación gráfica de los hechos derivado de la literatura sobre las vías biológicas que participan en células SP. software vía Studio 6.0 se utilizó para identificar las vías activadas en células SP. símbolos sólidos que representan a los genes (EGFR, TNFRSF6, BCL2L11, FOXO3A, RUNX1) según lo regulado en células SP, los símbolos abiertos representan los genes regulados positivamente (EPHB4, EPHB2, PAWR, AKT1) y los símbolos grises son los genes cuya expresión no cambió significativamente entre SP y las células MP. (C) La vía de señalización Notch: La figura muestra el esquema de los elementos de transducción de señales Notch. Las proteínas sobreexpresados en células SP (FPTG, ST3GAL6 y ADAM19) se muestran en color azul. modificación post-traduccional del precursor de Notch-proteína incluye la escisión por proteasas y glicosilaciones en el trans-Golgi. La adhesión de Notch dominio extracelular (ECN) con resultados Notch dominio intracelular (ICN) en heterodímeros Notch madura y se transfieren a la membrana celular. la interacción del receptor con los ligandos de la familia DSL (Delta, Serrate, Lag3) sobre las células vecinas es modulada por glicosilaciones de ECN. interacción exitosa de las regiones extracelulares de ligandos con repeticiones similares a EGF de ECN plomo a las escisiones proteolíticas de dominio transmembrana Notch por dos etapas secuenciales por proteasas y presenilinas ADAM con la actividad de γ-secretasa. El dominio intracelular Notch liberado se transloca a la nucleasa donde interactúa con CSL1, en sustitución de represores de CSL y la formación de un complejo de transcripción con factores Mastermind-como y coactivadores transcripcionales. Este complejo de transcripción activa los genes diana y puede dar cuenta de supervivencia de las células madre del cáncer, la auto-renovación y mantenimiento del tumor en el ovario.
Hemos identificado varios genes que pueden impartir características stemness a SP células ováricas. Debido a la heterogeneidad de la población celular en el SP, anticipamos que las vías claras pueden no ser obviamente presente. ADAM19, FPGT y ST3GAL6 se encontró que eran más expresa en células SP y pueden ser potenciales genes relacionados con el cáncer de tallo como de células. Con base en el perfil de expresión de FPGT, ST3GAL6 y ADAM19 en la lista de firmas gen SP, se propone un mecanismo probable, que puede ser activo en las células SP que explica la supervivencia de las células SP, diferenciación y mantenimiento del tumor en el ovario (Figura 2C). La figura muestra la participación de los tres enzimas en la activación de la vía de señalización de Notch. FPTG activa la síntesis de GDP-fucosa y que fue incorporado a los receptores Notch por transferasas fucosil. El ST3GAL6 enzima puede activar la adición de residuo de ácido siálico terminal, promover las escisiones proteolíticas de dominio transmembrana Notch en el exterior de la célula fue catalizada por ADAM19.
Identificación de población lateral (SP) células de células de cáncer de ovario líneas
Se identificaron células SP a partir de cuatro líneas celulares de cáncer de ovario humano utilizando análisis de citometría de flujo de la exclusión de colorante de unión de ADN, Hoechst33342. Como control se utilizó verapamilo, que bloquea la actividad de las proteínas transportadoras de drogas, lo que les impide effluxing el tinte. La Figura 3A muestra el perfil de clasificación de células fluorescentes activadas de SKOV3 y líneas celulares de cáncer de ovario A224. Las células SP cerradas se describen y se muestran como el porcentaje de la población celular total. El SP es destruida cuando el verapamilo está incluido en la incubación Hoechst. Detectamos células SP en las cuatro líneas celulares de cáncer evaluadas, SKOV3 (1,54%), A224 (1,02%), OVCAR-3 (0,08%), y UCI-107 (0,12%). Además de comprobar la autenticidad de las células aisladas de población lado, QRT-PCR se llevó a cabo en los genes seleccionados al azar de la lista de genes paciente SP (ADAM19, FPGT, ST3GAL6, LLGL1 y TK2). Todos los genes estaban bien validados en células SP aisladas de SKOV3 que apoyan el enriquecimiento de células madre, como el cáncer en las células aisladas de las poblaciones laterales (Figura 3B). La expresión de ADAM 19 y FPGT en células SP fueron validados a nivel de proteína usando métodos de inmunofluorescencia y Western Blot, respectivamente (figura S4). Para validar los genes de la vía Notch identificados mediante el estudio vía, se evaluaron los genes diana de Notch usando QRT-PCR en las poblaciones SP y MP. Una regulación al alza significativa de Notch genes diana incluyendo la identificación
HES1
y
NOTCH1
se detectó en la población SP en comparación con MP homólogo (Figura S5).
(A) de SP células en líneas celulares de cáncer de ovario humano establecidos. SKOV3 y líneas de células A224 fueron marcadas con colorante Hoechst 33342 y se analizaron por citometría de flujo. Las células SP, que desaparecieron en presencia de verapamilo (un inhibidor del transportador de múltiples fármacos), se describen y se muestran como el porcentaje de la población celular total. Se obtuvieron resultados similares para los tres mediciones independientes. (B) La validación de los genes seleccionados al azar de la lista de genes SP en el SP y MP células aisladas de las líneas celulares SKOV3. (C, D) de formación de colonias ensayo de eficacia: Formadoras de Colonias eficiencia de SP ordenada y células MP de SKOV3 y líneas de células A224. Para el análisis de la eficiencia de formación de colonias (CFE), se clasificaron células SP y MP y se sembraron en igual número en cultivo de tejidos placas de seis pocillos y se cultivaron durante 14 días. Las células fueron fijadas con metanol frío y se tiñeron con solución de cristal violeta 0,5% para contar el número de colonias por microscopía. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. (E, F) Número del paso: la eficiencia de formación de colonias de SP ordenados y células MP de SKOV3 y líneas de células A224 fueron evaluadas como una función del número de pases. Las células se fijaron con metanol frío y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta.
validación biológica de células SP aisladas a partir de líneas celulares
La eficiencia de formación de colonias (CFE) de SP y las células MP se evaluaron aislado de SKOV3 y líneas de células A224. células SKOV3 MP tenían un CFE de 13,0 ± 2,0% en comparación con un CFE de 27 ± 1,0% para las células SP (
P = 0,0077
) (Figura 3C). Las células A224 MP mostraron una CFE de 3,0 ± 1,0% en comparación con un CFE de 9,0 ± 1,0% para las células SP (
P = 0,0043
) (Figura 3D). Las colonias no teñidas de células SP y MP de SKOV3 de estas placas se tripsinizaron y las células se sembraron de nuevo en una placa de cultivo de seis tejido bien a 100 células por pocillo y se cultivaron durante otros 14 días y el CFE se estimó. células SKOV3 MP tenían un CFE de 8,0 ± 1,5% en comparación con un CFE de 44,0 ± 4,0% para las células SP. La diferencia original de 2 veces en la CFE entre MP y SP de SKOV3 encontró que aumentarse a 5 veces después del primer paso (
P & lt; 0,001
) (Figura 3E). Se observó una tendencia similar para las células A224 SP (Figura 3F). El aumento de la CFE como una función del pasaje indica el enriquecimiento de células madre, como el cáncer presentes en la fracción SP de SKOV3 y A224, y su capacidad para la expansión sostenida.
Para evaluar el crecimiento de anclaje independiente de SP y células MP de cada líneas celulares, se evaluaron su capacidad de formar colonias en agar suave. Las células A224 SP formaron aproximadamente 90 colonias /5000 células por placa, mientras que las células A224 MP forman un par de colonias solamente (
P & lt; 0,001
) produciendo una eficiencia en placas de 1,8% a las células SP. En el caso de las células SKOV3, las eficiencias de galvanoplastia eran 4,8% y 1,6% para SP y las células MP respectivamente (Figura 4A, B).
(B, A) de crecimiento independiente del anclaje de la SP ordenados y MP células de SKOV3 y células A224 líneas. (C, D) ensayo de células individuales en placas de 96 pocillos: las células individuales de células A224 y SKOV3 SP y MP se cultivaron en pocillos individuales. Se dejó que las células individuales para crecer durante 14 días y la eficiencia de formación de colonias se estimó usando tinción con cristal violeta. (E)
En vivo
el crecimiento tumoral de las células SKOV3 SP y MP en ratones desnudos atímicos hembra.
Para determinar la eficiencia de clonación de células individuales de células SP y MP, cultivos de células individuales de A224 y células SKOV3 SP y MP se prepararon utilizando FACS en placas de 96 pocillos. Las placas se dejaron crecer durante 14 días y la eficiencia de formación de colonias se estimó utilizando el método de tinción con cristal violeta. Las células A224 MP tenían un CFE de 3,0 ± 1,5% en comparación con un CFE de 17 ± 1,0% para las células A224 SP (
P = 0,005
), mientras que las células SKOV3 MP tenían un CFE de 2,0% en comparación con una CFE de 6,0 ± 1,0% para las células SKOV3 SP (Figura 3C, D). Además las colonias generadas a partir de células SP se hicieron crecer a más de 80% de cada pocillo mientras que las colonias formadas a partir de las fracciones MP se demostraron crecimiento limitado en los pocillos (Figura S6).
Para evaluar la
in vivo
potencial tumorigénico de las células SP y MP de SKOV3, 5 × 10
4 se inyectaron las células en 100 l de PBS por vía subcutánea en la zona dorsal de los ratones desnudos. El crecimiento del tumor se observó en tres de tres animales a las 8 semanas después de la inyección en células SP, mientras que los animales inyectados con igual número de células MP no tenían tumores detectables en ese momento (Figura 4E).