Extracto
Proteína arginina deiminases (PAD) catalizar la conversión posterior a la traducción de peptidil arginina a peptidil-citrulina en una reacción irreversible dependiente de calcio. Están surgiendo pruebas de que las almohadillas juegan un papel en la carcinogénesis. Para determinar las consecuencias funcionales asociados con el cáncer de PAD, hemos diseñado un inhibidor de molécula pequeña PAD (llamado Chor-amidina o Cl-amidina), y probamos el efecto de este fármaco sobre el ciclo celular. Los datos derivados de experimentos en células de cáncer de colon indican que Cl-amidina causa una detención en G1, y que esto era dependiente de p53. En un conjunto separado de experimentos, se encontró que Cl-amidina causó un aumento significativo en microRNA-16 (miRNA-16), y que este aumento era también dependiente de p53. Debido a que los genes miARN-16 es un supresor tumoral putativo miARN, y otros han encontrado que los genes miARN-16 suprime la proliferación, la hipótesis de que la detención G1 dependiente de p53 asociada con la inhibición de EAP fue, a su vez, depende de los genes miARN-16 expresión. Los resultados son consistentes con esta hipótesis. Así, encontramos la detención G1 es al menos en parte debido a la capacidad de expresión mediada por Cl-amidina de miARN-16 para suprimir sus "objetivos asociados G1-: ciclinas D1, D2, D3, E1, y CDK6. Nuestros cobertizos estudiar la luz sobre los mecanismos por los cuales la inhibición PAD puede proteger contra o tratar el cáncer de colon
Visto:. Cui X, Witalison EE, Chumanevich AP, Chumanevich AA, Poudyal D, Subramanian V, et al. (2013) La inducción de microARN-16 en células de cáncer de colon en proteína arginina deiminasa inhibición provoca una detención del ciclo celular dependiente de p53. PLoS ONE 8 (1): e53791. doi: 10.1371 /journal.pone.0053791
Editor: Michel Simon, CNRS-Universidad de Toulouse, Francia |
Recibido: 25 Octubre, 2012; Aceptado: 5 de diciembre de 2012; Publicado: 7 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Cui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo recibió el apoyo de las siguientes subvenciones: Institutos nacionales de Salud de subvención 5R01CA151304 a LJH y PRT (http://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción se ha propuesto
proteína desregulada arginina deiminasa (PAD) la actividad de jugar un papel en el inicio y la progresión de numerosas enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [1]. Las almohadillas son una familia de enzimas que convierten la peptidil-arginina a citrulina peptidil-(Arg → Cit) [2], un proceso llamado 'citrullination'. Mamíferos codifican 5 isoenzimas dentro de un mismo grupo de genes conservadas evolutivamente, que en los humanos está localizado en el cromosoma 1 (1p35-36) [3]. Los miembros de la familia de mamíferos PAD, que han sido designados como los pads 1-4 y PAD6, son altamente enzimas relacionadas tanto dentro como entre las distintas especies. Los niveles elevados de enzimas y /o PAD citrullinated proteínas se encuentran en múltiples enfermedades crónicas, incluyendo la colitis y el cáncer de colon [1], [4], [5], [6], [7]. En este sentido, hemos desarrollado inhibidores de la PAD, y un inhibidor particular, llamado de cloro-amidina (Cl-amidina), se ha demostrado que tiene citotoxicidad contra las líneas celulares de cáncer [8], y se puede utilizar para prevenir y tratar el alto enfermedad del riesgo de cáncer de colon, colitis ulcerosa en ratones [4].
los microARN (miARN) son evolutivamente conservada, de 20 a 25 nucleótidos de longitud, los ARN no codificantes que se unen a sus objetivos a través del reconocimiento secuencia complementaria parcial. Tales resultados de unión, ya sea en la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción, y por lo tanto la expresión suprimida de los genes miARN objetivos [9]. genomas de vertebrados se prevé para codificar tanto como 1000 miRNAs únicas [10], que se cree que regulan la expresión de al menos 30% de los genes [11]. Por lo tanto, no es sorprendente que los miRNAs tienen diversas actividades biológicas, incluyendo la regulación de la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. Con este fin, los genes miARN-16 es un putativo supresor de tumor miARN, y es el regulado en una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de colon [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Una función reconocida de miARN-16 es que controla el ciclo celular principalmente a través de un punto de control G1 [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Por lo tanto, en ausencia de los genes miARN-16, las células cancerosas pueden crecer de manera incontrolable. Con esto en mente, recientemente se ha demostrado que la inhibición de PAD por Cl-amidina provoca la inducción de p21
WAF1, lo que lleva a una detención del ciclo celular G1 en células de cáncer de colon [27]. La construcción de estos resultados, para entender mejor los mecanismos por los cuales Cl-amidina causa una detención del ciclo celular G1, se muestra aquí que en presencia de p53, la detención G1 causada por Cl-amidina depende de miRNA-16.
Métodos
Cl-amidina
la síntesis de la Cl-amidina se ha descrito anteriormente [28], [29]. Las concentraciones del stock de Cl-amidina se diluyeron en 1x Tampón fosfato salino (PBS) inmediatamente antes de la adición al cultivo celular.
Cultivo de células
HCT se compraron 116 de tipo salvaje células de cáncer de colon (WT) de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). HCT 116 p53
- /- células de carcinoma de colon se derivaron de HCT 116 células WT, y proporcionados por B. Vogelstein y K. Kinzler. HCT 116 WT y p53
- /- células se cultivaron en medio de McCoy (ATCC, Manassas, VA) suplementado con 10% becerro recién nacido de suero (NBCS; Gibco /Life Technologies, Grand Island, NY), glutamina 2 mM (Biofluids , Rockville, MD), penicilina (10 U /ml, Biofluids) y estreptomicina (10 mg /ml, Biofluids). LS-180 células de cáncer de colon, adquiridos de ATCC, se cultivaron en Modified Eagles Medium de Dulbecco (Hyclone, Logan, Utah), suplementado con 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS); GIBCO /Life Technologies), glutamina 2 mM (Biofluids, Rockville, MD), penicilina (10 U /ml, Biofluids) y estreptomicina (10 mg /ml, Biofluids).
siRNA y miRNA Transfección
Para PAD4 siRNA, 3 × 10
5 células fueron cultivadas en medio en placas de 6 pocillos 1 día antes de la transfección. Usando INTERFERin siRNA transfección Regent (Plyplus, iLllkirch, Francia), las células fueron transfectadas con 20 nmol /L de siRNA scambled como un control negativo o PAD4 Trilencer-27 siRNA humana (Origene, Rockville, MD). Después de 24 h de transfección, las células fueron procesadas para el análisis de transferencia de Western para evaluar la eficacia de derribar. ciclo celular se examinó después de 24 h de la transfección. Por anti-miR-16 y (Ambion, Austin, TX) transfección-mímica de miR-16, 3 × 10
5 células fueron cultivadas en medio en placas de 6 pocillos 1 día antes de la transfección. Usando INTERFERin siRNA reactivo de transfección, las células fueron transfectadas con 45 nmol /L de siRNA revueltos como control negativo y anti-miR-16 o hsa-miR-16. Después de 24 h de la transfección, las células se recogieron en tubos de RNasa libre de EP. ARN total fue extraído por medio de TRIzol regente. La concentración de ARN se determinó por Nanodrop 2000. 10 ng de ARN total fue inverso-transcrito a cDNA utilizando el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa con cebadores específicos para microARN hsa-miR-16 y la pequeña proteína RNU6B nuclear (U6) para la normalización. qPCR medición de miARN-16 y U6 expresión se realizó utilizando TaqMan microARN Los ensayos con el sistema de ensayo de PCR 7300. Se utilizó el factor de cambio relativo en el nivel de los genes miARN-16 para representar la abundancia relativa de los genes miARN-16 en comparación con la expresión U6. Después de 24 h de la transfección con anti-miR-16, se añadió Cl-amidina (50 mg /ml) y se cosecha para el análisis del ciclo celular en 0 h, 2 h, 8 h, y 24 h. ciclo celular también se examinó 24 horas después de la transfección de los genes miARN-16 mímica. Todas las muestras de control experimental se trataron con una concentración igual de una secuencia imitador control no dirigido o el inhibidor de la secuencia de control negativo, para su uso como controles para los efectos no específicos de la secuencia en experimentos de miARN. controles falsamente transfectadas no produjeron ningún efecto significativo en ninguno de los parámetros analizados.
expresión de microARN
Global miARN expresión.
HCT 116 células WT fueron sembradas a 1 × 10
6 células /placa en placas de 6 pocillos por triplicado. Después de cultivo durante 24 h, se añadió 25 g /ml Cl-amidina en cada pocillo. Las células se recogieron a los 0, 12, y 24 h por separado en tubos de RNasa libre de EP. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Ambion, Austin, TX). La concentración de ARN se determinó por el Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng de ARN de las células HCT 116 WT se utilizó para la versión 1.2 Ensayo de Expresión nCounter miARN (Nanostring Technologies, Seattle, WA) que contiene 800 miARN está siguiendo las instrucciones del fabricante.
miARN-16 expresión.
las células fueron sembradas, expuestos a Cl-amidina, y cosechada en los mismos puntos de tiempo como se describe para la expresión de los genes miARN mundial. Por miARN-16 de detección, se utilizó 10 ng de ARN total para revertir-transcribir en ADNc utilizando el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa (Bisystems Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante y los cebadores miARN específicos para HSA-miARN-16 para la detección y la pequeña proteína RNU6B nuclear (U6) para la normalización (Applied Biosystems). qPCR medición de miARN-16 y U6 expresión se realizó utilizando TaqMan miARN ensayos (Bisystems Biosystems) con el sistema de ensayo de PCR 7300 (Bioystems Biosystems). El método de ciclo umbral comparativo (Ct) se utilizó para evaluar la abundancia relativa de miR-16 en comparación con la expresión U6 (sofá cambios relativos a U6). Todos los tratamientos experimentales se llevaron a cabo en tres ocasiones separadas; cada vez con tres repeticiones.
Western blot
Las transferencias Western se llevaron a cabo como se describe anteriormente [30]. Los anticuerpos utilizados incluyen anti-p53 (EMD Millipore, Rockland MA; monoclonal de ratón, cat#op43, 1:500), anti-p21
WAF1 /Cip1 (Sigma; policlonal de conejo, cat#P1486, 1:1000), anti -GAPDH (Señalización celular, conejo monoclonal, cat#2118, 1:1000), y anti-PAD4 (Origene; monoclonal de ratón, gato#TA504813, 1:2000). anti-ratón y anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron de Amersham. Ambos anticuerpos secundarios se diluyeron en 1:2000. señal de Western blot fue detectado por SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se desarrolló a Hyperfilm (GE Ciencias de la Vida, Piscataway, NJ).
Análisis del ciclo celular
1 × 10
6 células se cultivan en placas de 6 pocillos en medio 5A de McCoy de 1 día antes del tratamiento y luego tratados con 50 mg /ml Cl-amidina para los tiempos correspondientes. Las células se recogieron y se fijaron con etanol enfriado con hielo. Después de lavar con 1x Tampón fosfato salino (PBS) que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina dos veces, las células se incubaron con solución de tinción de ADN que consiste en yoduro de propidio (PI; 10 mg /ml) y RNasa (0,1 mg /ml) durante 30 min a la temperatura ambiente en la oscuridad. La proporción de células en cada fase del ciclo celular se determinó mediante el contenido de ADN teñido con PI utilizando un BD-LSR-II citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA). Los datos obtenidos se analizaron con BD FACSDiva Software (BD Biosciences). Cada tratamiento se repitió en tres ocasiones distintas.
Análisis de ARNm
El ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA). Una g de RNA total sirvió como molde para la síntesis de ADNc de cadena sencilla en una reacción utilizando oligo (dT) cebadores y transcriptasa inversa de AMV (Promega Corp, WI) en las condiciones indicadas por el fabricante. PCR de muestras de ADNc se realizó con muestras amplificadas durante 30 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 50 ° C durante 30 s y extensión a 72 ° C durante 30 s con extensión final a 72 ° C durante 10 min . Las secuencias de cebadores para PCR en tiempo real utilizados fueron: CCND1 adelante 5'-CCC TCG GTG TCC TAC TTC AA-3 ', 5'-CCND1 inversa AGG AGG AAG CGG TCC TAG TT-3'; CCND2 adelante 5'-GGA TGG AGT AGT AGT GGA AC-3 ', 5'-CCND2 inversa ATC CAC GTC TGT GTT GGT GA-3'; CCND3 adelante 5'-TGA TTT CCT CTT GGC CAT TC-3 ', 5'-CCND3 inversa AGC TTC GAT CTG CTC CTG AG-3'; CCNE1 adelante 5'-ATC CTC CAA AGT TGC ACC AG-3 ', 5'-CCNE1 inversa AGG GGA CTT AAA CGC CAC TT-3'; CDK6 adelante 5'-CCG TGG ATC TCT GGA GTG TT-3 ', 5'-CDK6 inversa TCT CCT GGG AGT CCA ATC AC-3'; GAPDH adelante 5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 ', 5'-GAPDH inversas TTG TTG GAG ATT GGA TCT CG-3' (ADN Integrated Technologies, Inc). PCR en tiempo real (qPCR) se realizó utilizando el sistema 7300 PCR en tiempo real de ensayo (Applied Biosystems, CA) con Power SYBR verde mezcla maestra de PCR (Applied Biosystems, CA) y cebadores para CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 y GAPDH de acuerdo con el protocolo del proveedor. El CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 expresión génica se normalizó por la expresión del gen GAPDH. El factor de cambio en la expresión génica es con respecto al vector células tratadas (1x PBS) cosecharon a las 24 h.
Estadísticas
Cuando se compararon más de dos grupos, a fin de determinar las diferencias estadísticas utilizando una análisis unidireccional de la varianza, seguido de la prueba de comparación múltiple de Scheffe una. Si se compararon dos grupos, se utilizó la prueba t de Student. Para el análisis global de los genes miARN, todos los datos se importaron en v1.0 Análisis NSolver Software (Nanostring Technologies) y se normalizaron a la media geométrica de los 100 microARN con los más altos valores de expresión. Los datos normalizados se ha importado a BRB-ArrayTools v4.1.0 para su análisis. Antes del análisis, se filtraron datos donde cualquier valor de menos de 10 se omitió y cualquier microRNA falta en & gt; 50% de las muestras fueron excluidos dejando 169 microRNAs para el análisis. prueba de comparación de clases utilizada t de Student pruebas para comparar los microARN de las células no tratadas tratados vs. las pruebas de tendencia utilizaron modelos de regresión lineal en las variables categóricas de 0 h, 12 hy 24 h. El procedimiento Benjamini-Hochberg se utilizó para calcular las tasas de falso descubrimiento. El valor de p para la significación elegido en este estudio fue de 0,05.
Resultados
Cl-amidina provoca una detención en G1 dependiente de p53
Para explorar las implicaciones funcionales de la inhibición PAD, nos preguntamos primero si el inhibidor de la PAD, Cl-amidina, los impactos del ciclo celular. El uso de dos líneas celulares de cáncer de colon p53 WT independientes, se encontró que Cl-amidina causó una detención del ciclo celular en la fase G1 (Tablas 1A y B; Figuras S1A y S1B). Debido a que el impacto en la fase G1 se asoció con un aumento de la p53 y p21 (Figura S2), se probó la hipótesis de que Cl-amidina causó la detención en G1 a través de un mecanismo mediado por p53. Los resultados son consistentes con esta hipótesis. A diferencia de HCT 116 células WT, Cl-amidina no causó una detención en G1 en HCT 116 isogénica p53
- /- células (Tabla 1C; Figura S1C). Para confirmar que esta detención no se debió a los mecanismos de fuera de objetivo, derribaron PAD4 de siRNA (Figura S3 A), luego se examinan los cambios del ciclo celular. De acuerdo con el entendimiento de que la detención del ciclo celular G1 por Cl-amidina es debido al menos en parte a su capacidad para suprimir la actividad de PAD, PAD4 desmontables también causó una detención del ciclo celular G1 (Tabla 1D; Figura S3B) en células HCT 116. del ciclo celular se examinó 24 horas después de la transfección.
Cl-amidina produce una inducción dependiente de p53 de miARN-16
Hemos demostrado previamente que el inhibidor de la PAD, Cl-amidina, estimula la apoptosis de células inflamatorias y modestamente estimula la apoptosis en células HT-29 de cáncer de colon [4]. Además, se confirmó resultados anteriores de Li et al. [27] en que PAD4 knock-down y Cl-amidina tratamiento provocó una detención del ciclo celular G1 de una manera dependiente de p53 (Tabla 1; figuras S1 y S2). Puesto de miARN han surgido como moderadores clave de la proliferación de las células del colon y la apoptosis [31], se examinaron los cambios de expresión de miRNA globales en células HCT 116 de cáncer de colon expuestos a Cl-amidina. La Tabla 2 muestra que había una correlación significativa positiva en 11 miRNAs, y la correlación negativa significativa en 7 miRNAs después de la exposición de las células HCT 116 a la CL-amidina de 0 h, 12 h, y 24 h. Con base en el entendimiento de que los genes miARN-16 es el regulado en el cáncer de colon [18], y los genes miARN-16 ha demostrado ser el miARN que era más hasta reguladas (significativamente) con Cl-amidina (1,5 veces a las 12 h; 2 plegar a las 24 h; Tabla 2), decidimos explorar más a fondo las consecuencias y los mecanismos de mediación-Cl-amidina miARN-16 sobre regulación. Para confirmar los genes miARN-16 sobre regulación de Cl-amidina, se repitió el experimento y examinamos la activación de los genes miARN-16 de QRT-PCR. En consonancia con los resultados globales de análisis de miARN, Figura 1A muestra que no hubo aumento de miARN-16 expresión al aumentar el tiempo cuando las células HCT 116 fueron expuestos a Cl-amidina, y la significación se alcanzó a los 12 h y 24 h (p & lt; 0,05). También hubo un aumento en los genes miARN-16 al aumentar el tiempo expuesto a la Cl-amidina en la línea celular 180-LS cáncer de colon WT p53; significación se alcanzó a las 24 h (Figura 1B). El menor incremento de los miARN-16 de inducción es consistente con la detención del ciclo celular G1 relativamente modesto en las células LS-180 (Tabla 1B; Figura S1 B): perfil
células HCT 116 (A) WT.; (C) LS-180 células .; (C) HCT 116 p53
- /- las células. Las células se expusieron a 25 g /ml Cl-amidina para los tiempos indicados (n = 9 planchas por punto de tiempo). endógenas miR-16 niveles relativos de expresión se detectaron mediante qRT-PCR usando los cebadores Taqman y las sondas para detectar madura miR-16 y la pequeña RNU6B nuclear RNA (U6), un control interno. Relativos miR-16 los niveles de expresión se normalizaron al valor medio de las muestras no tratadas (0 h). *, Indica una diferencia significativa del control de las 0 horas.
Debido a p53 aumenta la maduración post-transcripcional de los genes miARN-16 [32], y Cl-amidina provoca una inducción de p53 (Figura S2), se examinó si la inducción de los genes miARN-16 con Cl-amidina era dependiente de p53. La Figura 1C muestra Cl-amidina fue incapaz de causar un aumento en los genes miARN-16 en HCT 116 p53
- /-. Las células, lo que indica miRNA-16 de inducción fue de hecho dependiente de p53
El G1 dependiente de p53 arresto por Cl-amidina está regulado por los genes miARN-16
Teniendo en cuenta la observación de que tanto la detención en G1 y el aumento de los genes miARN-16 con Cl-amidina eran dependiente de p53; que p53 aumenta la maduración de miR-16 [32]; y que otros han demostrado miARN-16 provoca una detención en G1 [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], la hipótesis de que miARN-16 está en el cruce de la detención G1 dependiente de p53 inducida por la inhibición de la PAD. Para probar esta hipótesis, se derribaron miARN-16 (Figura S3C) en las células HCT 116, luego se expusieron las células a la CL-amidina. Los resultados mostrados en la Tabla 3A y la Figura S3D de hecho indican que la detención G1 causada por Cl-amidina en células HCT 116 WT es dependiente de los genes miARN-16, debido a que en la ausencia de los genes miARN-16, Cl-amidina fue incapaz de hacer que el ciclo celular arrestar. Para confirmar estos resultados, transfectadas las células HCT 116 con miARN-16 siRNA y miRNA-16 mímica. Después de la incubación durante 24 h sin la transfección, la transfección de los genes miARN-16 siRNA o el miR-16 mímico, se recogieron las células y el ciclo celular examinada. Tabla 3B muestra el sinóptico miRNA-16 provocó una detención del ciclo celular G1, apoya la hipótesis de que la inducción de los genes miARN-16 por Cl-amidina es un acontecimiento clave que conduce a una detención en G1 en células de cáncer de colon con un fondo p53 WT. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que la detención en G1 dependiente de p53 es a su vez depende de la capacidad de inhibición de la PAD por Cl-amidina hasta de regular la expresión de los genes miARN-16. ¿Qué causa
CL-amidina una regulación a la baja de los genes miARN-16 dianas implicadas en un G1 detención
Hemos demostrado que los genes miARN-16 es en el cruce de la detención en G1 en células de cáncer de colon en un Cl-amidina. Por lo tanto, sería razonable para examinar los efectos de Cl-amidina en miARN-16 objetivos que están involucrados en un G1 del ciclo celular. Tales objetivos incluyen: la ciclina D1 (CCND1) [13], [19], [33], [34], [35], [36], ciclina D2 (CCND2) [13], ciclina D3 (CCND3) [33] , ciclina E1 (CCNE1) [13], [21], [24], [35], y la quinasa dependiente de ciclina-6 (CDK6) [35]. Al examinar los efectos de Cl-amidina en estos miARN-16 objetivos, encontramos una disminución significativa en todos los puntos finales (Figura 2). Esto es consistente con la hipótesis de que la inhibición PAD por Cl-amidina activa los genes miARN-16, que a su vez, regula a la baja de múltiples genes que se sabe están involucrados en la progresión de G1.
HCT 116 células fueron tratadas con 1x PBS ( -.) o 25 mg /ml Cl-amidina (+) durante 24 h, a continuación, el ARN cosechado para qPCR como se describe en los métodos. El CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, y la expresión génica CDK6 se normalizaron por la expresión del gen GAPDH. *, Indica diferencia significativa con respecto al control (-) (p & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
PAD fueron descubiertos por primera vez en los vertebrados en la década de 1980 dentro de la epidermis de ratas recién nacidas [. ,,,0],37]. Desde entonces, se ha hecho cada vez más evidente que la actividad de evaluación inicial, con citrullination proteína resultante, conduce a muchas enfermedades y cánceres inflamatorios, incluyendo la colitis y el cáncer de colon [1], [4], [5], [6]. Por lo tanto, para desarrollar terapias basadas en la señalización para suprimir o prevenir el cáncer de colon PAD, es importante entender los mecanismos. Hemos identificado que la inhibición de los PAD por nuestro novedoso inhibidor de molécula pequeña (Cl-amidina) suprime la enfermedad el riesgo de cáncer de colon alta, la colitis ulcerosa, en ratones [4]. Aquí, hemos extendido estos estudios, y ha demostrado que Cl-amidina causa una detención del ciclo celular G1 en células de cáncer de colon, que es mediada por este efecto hasta la regulación de la expresión del supresor de tumor de cáncer de colon putativo microRNA, miRNA-16; y que esto sólo ocurre en presencia de la proteína supresora de tumores, p53. A pesar de que todavía tenemos que demostrar que Cl-amidina suprime el cáncer de colon en ratones, los resultados aquí diseccionar los mecanismos por los que la inhibición RATÓN por Cl-amidina es probable que suprimir el cáncer de colon. Dada la estrecha relación entre la inflamación del colon y el cáncer de colon [38], [39], [40], [41], [42], nuestro estudio anterior que demuestra que Cl-amidina suprime la colitis [4] también predice que Cl-amidina se puede utilizar para prevenir y /o tratar el cáncer de colon. Además de la supresión de la inflamación, el presente estudio indica que un mecanismo adicional (para suprimir el cáncer de colon por Cl-amidina) es a través de la p53 y la detención del ciclo celular G1 dependiente de los genes miARN-16 en células de cáncer de colon. El razonamiento exacto para la detención del ciclo celular causada por el aumento de la inhibición mediada por la EAP en los genes miARN-16, sin embargo, aún no se ha dilucidado. Aunque hemos visto un aumento de la p21
WAF1 con el tratamiento Cl-amidina (Figura S2), esto no parece ser el único evento que causa la detención G1, debido a nuestra miARN-16 pruebas (miARN-16 de ablación niega la G1 detención por Cl-amidina: Tabla 3; Figuras S3C y S3D). Con este fin, los genes miARN-16 ha surgido como un miARN especialmente clave en el punto de control del ciclo celular G1. miRNA-16 objetivos varios reguladores del ciclo celular, incluyendo la ciclina D1 (CCND1), ciclina D2 (CCND2), ciclina D3 (CCND3), la ciclina E1 (CCNE1), dependiente de ciclina quinasa-1 (CDK1), CDK6, Cdc25A, y ADP -ribosylation proteína similar al factor de 2 (Arl2) [13], [19], [21], [24], [26], [33], [34], [35], [36], [43], [44]. Dadas sus funciones claras en la conducción de la progresión de las células que se dividen a través de la fase G1, especialmente CDK6, ciclina D y ciclina E, la capacidad de los genes miARN-16 para dirigir tales moléculas es la razón más probable de nuestros resultados (Figuras 2 y 3) . Otro conjunto de experimentos fuera del alcance del presente estudio consiste en las implicaciones funcionales de otros de miARN demostrado que tienen expresión diferencial después de la exposición de las células HCT 116 a la CL-amidina (Tabla 2).
La inhibición de la PAD por Cl-amidina activa p53, que a su vez activa los genes miARN-16. La activación de los genes miARN-16 causa un G1 del ciclo celular, presumiblemente por la orientación ciclinas D, E y /o CDK6.
Desde Cl-amidina es un inhibidor de pan-PAD [45], sigue siendo para ser mostrado que PAD es la clave para la inducción de una detención del ciclo celular G1. Nuestro hallazgo de que la baja regulación de PAD4 través de siRNA causa una detención en G1 comparable a la de Cl-amidina (Tablas 1A y 1D), indica PAD4 es al menos una de las enzimas PAD clave responsables de la progresión del ciclo celular independiente de los otros PAD . En consonancia con este hallazgo es el entendimiento de que la actividad PAD4 es elevada en los adenocarcinomas de colon [6]. Sin embargo, debido a la actividad pan-PAD de Cl-amidina, no podemos descartar el impacto de otras almohadillas en la progresión del ciclo celular. Esto es especialmente cierto para los cojines que se sabe que se expresa en células de origen epitelial /carcinoma (los que se utilizan en este estudio), incluyendo PAD1 [46], PAD2 [47] y PAD3 [7].
Nuestro hallazgo de que Cl-amidina provoca una inducción de p53 (Figura S2) e inhibe el crecimiento celular de una manera dependiente de p53 es consistente con otros grupos [27], [48]. Los mecanismos de inducción de p53 por la inhibición PAD, sin embargo, siguen sin estar claros. PAD4 puede regular la expresión génica por catalizar la citrullination postraduccional de una serie de residuos de Arg en sustratos histonas [49], [50]. PAD4 puede ser reclutado a las histonas por su interacción con p53 [27]. Como resultado, PAD4 se reclutó a los promotores de genes p53 orientada donde citrullinates histonas y reprime la transcripción de genes p53 objetivo. PAD4 también puede citrullinate proteínas no histonas que se asocian con p53 y están implicados en la carcinogénesis. En particular, puede PAD4 citrullinate inhibidor de la proteína de crecimiento 4 (ING4), inhibiendo de este modo la activación ING4 mediada por p53 [51]. Tales mecanismos apoyan la conclusión de que la inhibición RATÓN por Cl-amidina provoca la inducción de p53. Por último, estamos explorando la posibilidad de que p53 puede ser citrulinados, lo que lleva a la generación de SDS-insoluble agregados, similar a un número de cáncer asociado mutaciones de p53 [52]. Si este es el caso, la inhibición de p53 citrullination (por Cl-amidina) conduciría a un aumento de los niveles de p53 mediante la prevención de la agregación de este fenotipo.
En conclusión, dada la creciente comprensión de que la actividad PAD (y citrullination resultante) juega un papel clave en enfermedades crónicas tales como enfermedades inflamatorias y el cáncer, es importante para entender mejor los mecanismos. Muy poco se conoce en la actualidad en este sentido. Con respecto al cáncer, aquí hemos demostrado que los genes miARN-16 juega un papel vital en la modulación del punto de control G1 inducida por la inhibición de la EAP en líneas celulares de cáncer de colon p53 WT
in vitro
. Aunque el
in vivo
traducción aún no se ha demostrado, estos experimentos actuales arrojan luz sobre el mecanismo por el que la inhibición PAD por nuestro nuevo inhibidor de la PAD, Cl-amidina, funciona. Nuestros hallazgos mecanicistas abren la posibilidad de que los inhibidores de la PAD, por sí solos o en concierto con p53 y /o miRNA-16 imita, pueden tener eficacia en la quimioprevención y /o el tratamiento de cáncer de colon.
Apoyo a la Información
Figura S1.
representativos histogramas de citometría de flujo en líneas celulares de cáncer de colon se indica. (A) Histogramas en los puntos de tiempo indicados muestran Cl-amidina (50 mg /ml) induce una detención en la fase G1 en las células HCT 116, que son WT p53. (B) Histogramas en los puntos de tiempo indicados muestran Cl-amidina (50 mg /ml) induce una detención en la fase G1 en LS-180 células, que son WT p53. (C) de histogramas en los puntos de tiempo indicados muestran Cl-amidina (50 mg /ml) no induce una detención en la fase G1 en HCT 116 p53
- /- las células, que son deficientes en p53
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Cl-amidina causa una inducción en p53 y p21 en las células HCT 116, pero no en HCT 116 p53
- células - /. Las células fueron expuestas a concentraciones indicadas de Cl-amidina durante 24 h, después se recogieron para el análisis de transferencia Western. Las cifras debajo de las bandas son valores de densitometría GAPDH ajustados en relación con el grupo de control (0 mg /ml Cl-amidina)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s002 gratis (TIF)
Figura S3 . gratis (A, B). El derribo de PAD4 (A) produce una detención del ciclo celular G1 en células HCT 116 (B). (A) análisis de transferencia de Western que muestra la caída PAD4 con siRNA a PAD4. Números menores de las bandas son valores de densitometría GAPDH-ajustado en relación con el grupo de control siRNA revueltos. (B) parcelas representativas del ciclo celular después de 24 h. la transfección con cualquiera revueltos siRNA o siRNA a PAD4. (DISCOS COMPACTOS). Después de eliminar a miR-16 (C), Cl-amidina (50 mg /ml) no causa una detención del ciclo celular G1 en células HCT 116 (D). (C) Cuantificación de los genes miARN-16 expresión por Q-PCR. *, Indica una reducción significativa en la expresión de los genes miARN-16 a las 24 h post-transfección en comparación con el control de siRNA revueltos. Tenga en cuenta que Cl-amidina no afectó a la eficacia de los genes miARN-16 desmontables. (D) Representante de citometría de flujo histogrtams después de 24 h. transfección con anti-miR-16, luego la exposición a Cl-amidina (50 mg /ml) durante los tiempos indicados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s003 gratis (TIF)