Extracto
RGS10 es un importante regulador de la supervivencia celular y la quimio-resistencia en el cáncer de ovario. Recientemente, hemos mostrado que la expresión del transcrito RGS10 se suprime durante la quimio-resistencia adquirida en el cáncer de ovario. La supresión de RGS10 es debido a la hipermetilación del ADN y la desacetilación de histonas, dos mecanismos importantes que contribuyen a silenciamiento de genes supresores de tumor durante la progresión del cáncer. Este sentido, investigar completamente los mecanismos moleculares de silenciamiento epigenético de la expresión RGS10 en las células de cáncer de ovario quimioresistente A2780-AD. Identificamos dos importantes reguladores epigenéticos, HDAC1 y DNMT1, que exhiben aberrantes asociación con promotores RGS10 en células de cáncer de ovario chemoresistant. Desmontables de HDAC1 o expresión DNMT1, y la inhibición farmacológica de DNMT o HDAC actividad enzimática, aumenta significativamente la expresión RGS10 y la muerte celular mediada por cisplatino. Por último, DNMT1 derribar también disminuye HDAC1 vinculante para el promotor RGS10 en las células chemoresistant, lo que sugiere la contratación de HDAC1 promotores RGS10 requiere la actividad DNMT1. Nuestros resultados sugieren que la HDAC1 y DNMT1 contribuyen a la supresión de RGS10 durante la inhibición de la quimio-resistencia y el apoyo adquirida de HDAC1 y DNMT1 como un enfoque terapéutico adyuvante quimio-resistencia para superar el cáncer de ovario
Visto:. Cacan E, Ali MW, Boyd NH , ganchos SB, SF Greer (2014) inhibición de HDAC1 y DNMT1 modulan la expresión RGS10 y disminuir el cáncer de ovario quimiorresistencia. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10.1371 /journal.pone.0087455
Editor: Malú G. Tansey, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Octubre, 2013; Aceptado: December 25, 2013; Publicado: 27 de enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Cacan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue con el apoyo de la subvención#RSG-09-067-01-LB de la Sociedad Americana del cáncer. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es uno de los cánceres ginecológicos más letales, con una tasa de mortalidad del 60% en los pacientes y una tasa de supervivencia a 5 años del 30% más bajo que en la enfermedad avanzada etapa [1]. La alta tasa de mortalidad se debe en gran parte al desarrollo de la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos [2], [3]. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos que impulsan el desarrollo de la quimio-resistencia adquirida nos permitirá mejorar los agentes terapéuticos actuales para el tratamiento del cáncer de ovario. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) inician múltiples vías de señalización oncogénicas en células de cáncer mediante la activación de sus asociados proteínas G [4], [5]. La activación de los GPCR por factores de crecimiento tales como el ácido lisofosfatídico (LPA) desencadena la señalización de supervivencia vías que conducen a la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino y taxano [6]. la activación de GPCR de las proteínas G se opone por la actividad de regulador de las proteínas de señalización de la proteína G (RGS). proteínas RGS inhiben las vías de señalización de la proteína G mediante la unión directamente a la subunidad Gα activado de proteínas G para acelerar la hidrólisis de GTP en GDP, que devuelve las proteínas G a un estado inactivo [7] - [10]. Relevantes para nuestros estudios, informes recientes indican que las proteínas RGS inhiben la mama, pulmón, próstata, y el crecimiento de células de cáncer de ovario a través de la inhibición de GPCRs vías de señalización [2], [11] - [15].
RGS10 es entre la más pequeña de las proteínas RGS y es altamente expresado en una amplia gama de tipos de células [16] - [19]. RGS10 es un regulador importante de la supervivencia celular y la quimiorresistencia [2], y la expresión del transcrito RGS10 se suprime significativamente en varias líneas celulares de cáncer de ovario [15]. Por lo tanto, la supresión de las proteínas RGS10 puede contribuir a la quimiorresistencia mediante la amplificación de crecimiento de las células mediada por GPCR y rutas de señalización de supervivencia. Recientemente hemos demostrado que la supresión de RGS10 es debido en parte a la hipermetilación del ADN y para la desacetilación de histonas, dos importantes mecanismos de silenciación de genes que contribuyen a la progresión de muchos tipos de cáncer. La metilación del ADN es mantenido por ADN metil transferasa (DNMTs) [20] y la desacetilación de histonas es mantenido por las histonas desacetilasas (HDACs) [21]. A menudo, estas dos enzimas coordinadamente suprimen la actividad transcripcional de genes [22], [23]. Fuks
et al.
Han informado de que DNMT1 se asocia con la actividad de la histona desacetilasa y tiene la capacidad de unirse HDAC1 [24]. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales se desconoce la hipermetilación del ADN y la desacetilación de histonas RGS10 reprimir y la contribución de estas enzimas para la quimio-resistencia adquirida.
investigar aquí los mecanismos moleculares de la regulación epigenética de la expresión RGS10 en células de cáncer de ovario y el enfoque sobre las células sensibles a la quimioterapia parentales A2780 y su línea celular derivada, quimioresistente A2780-AD. Identificamos dos importantes reguladores epigenéticos, HDAC1 y DNMT1, que están altamente asociados con el promotor RGS10 en las células de cáncer de ovario chemoresistant. HDAC1 y DNMT1 tumbar aumenta significativamente la expresión RGS10 y la muerte celular estimulada por cisplatino. Nuestros resultados sugieren que HDAC1 y DNMT1 contribuyen a la supresión de RGS10 durante creciente evidencia de quimiorresistencia y apoyo adquirida que la inhibición de HDAC1 /DNMT1 representar nuevos enfoques terapéuticos para la superación de la quimiorresistencia cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
La línea celular sensible a la quimioterapia A2780 padres y sus células A2780-AD chemoresistant derivados (derivados como se describe [25]) fueron generosamente proporcionado por el doctor Bob Brown, el Imperial College de Londres. Estas células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Mediatech Inc.) suplementado con 10% de FBS y 5 mM de L-glutamina. células quimiorresistente se mantuvieron adicionalmente en 3 M de cisplatino. Todas las células fueron cultivadas en 5 mM de penicilina-estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células OV2008 y C13 (derivados como se describe [26], [27]) fueron generosamente proporcionado por el Dr. Patricia Kruk, Universidad del Sur de Florida.
5-Aza-2'- desoxicitidina (5-aza-DC ), tricostatina A (TSA), y cisplatino se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los anticuerpos que reconocen RGS10, HDAC1, de cabra anti-IgG de rata-HRP (peroxidasa de rábano picante) y anticuerpos de conejo HRP conjugado se obtuvieron de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos que reconocen DNMT1 se obtuvieron de Abcam (Cambridge, MA). anticuerpos de ratón conjugado con HRP se adquirieron de Promega (Madison, WI). Anticuerpos que reconocen β-actina se obtuvieron de Cell Signaling (Beverly, MA).
siRNA construcciones y transfección transitoria
ARN corto de interferencia (siRNA) pre-diseñado para HDAC1 (Qiagen), y RGS10 DNMT1 (Santa Cruz) se utilizaron para derribar expresión de HDAC1, RGS10 o DNMT1. Revueltos All Star Control de siRNA (Qiagen) fue utilizado como control. células A2780-AD fueron transfectadas con 10 nM de HDAC1 o siRNA específico DNMT1 o All Star revueltos siRNA de control usando el reactivo de transfección HiPerfect (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el tiempo de incubación indicado, las células se recogieron y se analizaron en transferencia de Western, la expresión de ARN, o experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina.
expresión de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
mRNA se aisló utilizando el reactivo de extracción de ARN Qiazol (Qiagen) como se describe en el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se lisaron en Qiazol y se agitaron en un rotador 3D durante 5 minutos. se añadieron 200 l de cloroformo y se incubó durante tres minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron y la fase acuosa (400 l) se transfirió a un tubo eppendorf. se añadieron 500 l de isopropanol y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, los pellets se lavaron con 1 ml de etanol frío al 75%, se centrifugó y se resuspendió en 50 l de agua libre de ARNasa. RNA se cuantificó y ADNc se genera a partir de 1 g de ARN total extraído usando un kit de transcripción inversa Omniscript (Qiagen). Después de la síntesis de ADNc, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando TaqMan PCR Universal Master Mix (Roche) y cebadores y sondas dirigidas a regiones codificantes RGS10 o GAPDH específicos. la expresión del transcrito se evaluó mediante un 7900HT sistema de PCR en tiempo real ABI PRISM (Applied Biosystems). Las reacciones se normalizaron en contra de la expresión de GAPDH y los cálculos se realizaron utilizando curvas de calibración generadas. Los cebadores utilizados fueron: RGS10 adelante: 5'-GAC CCA AGA AGG CGT GAA AAG A-3 ', RGS10 inversa: 5'-GGA GCT CAG AAA GGT CAT GTA GA-3', la sonda RGS10: 5'-GAC AGA TAA GCA GAT GCA GGA GGC AAA-3 ', GAPDH Forward: 5'-GGA AGC TCA CTG GCA TGG C-3', GAPDH inversa: 5'-TAG ACG ACG GGT CAG GTC CA-3 'y GAPDH sonda: 5' CCC CAC TGC CAA CGT GTC AGT G-3 '.
Para determinar el efecto de 5-aza-dC y la exposición TSA en la expresión del transcrito RGS10, 1 × 10
se sembraron células A2780 6-AD por cada 10 cm
placa de cultivo de tejido 2 y se incubaron durante la noche. Las células fueron tratadas con 20 mM 5-Aza-dC o con 500 ng TSA disuelto en DMSO. Se incubaron las células tratadas TSA durante 48 horas y 5-aza-DC tratadas se incubaron las células durante tres, cinco, o siete días, con los medios aspiró y se reemplazó diariamente. el aislamiento de ARN y la síntesis de ADN se realizaron como se ha descrito anteriormente.
se realizaron inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayo
ensayos de chip tal como se describe anteriormente [15]. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
6 en 10 cm
2 placas. Tres millones de células se reticularon con 1% de formaldehído durante ocho minutos a temperatura ambiente. reacciones de reticulación se detuvieron mediante la adición de 0,125 M de glicina. Los núcleos celulares se aislaron y se concentraron por lisis en SDS tampón de lisis (1% de SDS, EDTA 10 mM, 50 mM Tris pH 8,0), más inhibidores de proteasa durante 30 minutos sobre hielo seguido de congelación de flash en nitrógeno líquido. Los núcleos se sometió a ultrasonidos utilizando un baño de agua sonicador Bioruptor (Diagenode) para generar un promedio de 500 pb de ADN cizallado que se confirmó por electroforesis en gel de agarosa. lisados sometidos a ultrasonidos se precleared con cuentas de esperma de salmón /agarosa (Millipore), el 5% del total de lisado se almacena como entrada para la normalización. La mitad de la lisado restante se inmunoprecipitó con 5 g de anticuerpo indicado durante la noche a 4 ° C y la otra mitad del lisado se inmunoprecipitó con un anticuerpo control. Tras una inmunoprecipitación adicional de dos horas con perlas de agarosa recubierta de esperma de salmón, todas las muestras se lavaron con cada uno de los siguientes tampones: tampón de baja sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl), tampón de alto contenido de sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris pH 8,0, NaCl 500 mM), LiCl (0,25 M LiCl, 1% de NP40, 1% DOC, 1 EDTA mM, 10 mM Tris pH 8,0), y 1 x TE (Tris-EDTA); El ADN se eluyó con tampón SDS de elución (1% SDS, 0,1 M NaHCO3). Después de la elución, los enlaces cruzados se invirtieron durante la noche con 5 M de NaCl a 65 ° C y se aisló el ADN inmunoprecipitado usando fenol: cloroformo: mezcla isopropanol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ADN aislado se cuantificó mediante PCR en tiempo real en un ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando cebadores y sondas específicas dirigidas a RGS10 y GAPDH región promotores. Los valores generados a partir de las reacciones de PCR en tiempo real se calculan en función de las curvas de calibración generadas, se corrieron en las reacciones por triplicado, y se analizaron mediante el programa SDS 2.0 (Applied Biosystems).
células ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina en siRNA tratados
chemoresistant células A2780-AD se sembraron a una densidad de 1,2 × 10
6 células por 10 cm
2 placas de cultivo de tejidos. Las células fueron tratadas con siRNA construcciones como se describe anteriormente y se incubaron durante 72 horas. Las células se recogieron y 1/10 del volumen celular se retiró para el análisis de la eficiencia de la precipitación mediante análisis de transferencia western. Chip ensayos se realizaron como se ha descrito anteriormente en las células recolectadas restantes.
células de expresión de ARN en siRNA tratados
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
6 células por 10 cm placa de cultivo
2 de tejidos y se incubaron durante la noche. Las células fueron luego transfectadas con el ARNsi indicado construir como se describe anteriormente y se incubaron durante 72 horas, y una extracción de ARN se realizó como se ha descrito anteriormente.
Apoptosis ensayo
La apoptosis de las células A2780-AD era evaluó a través de la anexina V: PE apoptosis Detección Kit I (BD Pharmingen). 1 × 10
6 células A2780-AD se sembraron en 10 cm
2 placa de cultivo de tejidos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Las células fueron tratadas con HDAC1 siRNA o con el control de siRNA usando el reactivo de transfección HiPerfect. Después de 48 horas de incubación, se añadieron 50 M de cisplatino tanto a HDAC1 siRNA y las células de control tratadas siRNA y se incubaron las células durante 48 horas adicionales. Las células A2780-AD se tripsinizaron brevemente y se cosecharon. Una fracción del volumen celular se retiró para el análisis de transferencia de western y la fracción restante de células se lavó con PBS frío dos veces y se resuspendió en tampón de unión de Anexina V a una concentración de 1 x 10
6 células /ml. Las células se transfirieron a tubos de cultivo de 5 ml que contenían 5 l de anexina V-PE y /o 5 l de 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Las muestras se mezclaron suavemente y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de 400 l de anexina V de tampón de unión a cada tubo, se analizaron muestras y se cuantificaron por citometría de flujo y se analizaron los datos resultantes usando el software FlowJo.
Resultados
acetilación de histonas se suprime en RGS10 promotores en células de cáncer de ovario
recientemente hemos demostrado que los niveles de histona acetilado histonas H3 se redujeron significativamente en el promotor RGS10-1 en el modelo celular A2780-AD de la quimio-resistencia cáncer de ovario [15]. Para confirmar estos hallazgos en las líneas celulares adicionales, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos se llevaron a cabo en la línea celular de cáncer de ovario sensible a la quimioterapia OV2008 y en células hijas C13 quimiorresistentes. Mientras que los niveles totales de la histona H3 son similares en ambos promotores RGS10 y GAPDH en células sensibles a la quimioterapia y quimiorresistentes (Fig. 1A), los niveles de la histona H3 acetilada son significativamente inferiores a los promotores RGS10 en las células de cáncer de ovario C13 quimiorresistentes en comparación con células OV2008 quimiosensibles ( la Fig. 1B).
ensayos de chip se llevaron a cabo en células parentales y células OV2008 C13 resistentes a los fármacos. Los lisados se inmunoprecipitaron con el control, anti-histona H3, anti-acetil histona H3, o anticuerpos anti-H3K18 acetilo. ADN asociado se aisló y se analizó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores que abarcan los promotores RGS10 y GAPDH. Los valores de PCR en tiempo real se normalizaron a la cantidad total de ADN promotor añadido (entrada). Los valores de entrada representan 5% del lisado celular total. ** P & lt; 0,005. A) los niveles de la histona H3 Global asociados con RGS10 y GAPDH promotores. B) los niveles globales de acetilación de la histona H3 asociado con RGS10 y GAPDH promotores. C) Los niveles de histona H3 acetilada en la lisina 18 asociado con RGS10 y GAPDH promotores.
Las reducciones en H3 lisina 18 de acetilación (H3K18Ac) se han asociado con fenotipos agresivos contra el cáncer y con mal pronóstico de los pacientes [28] , [29]. A continuación realizó ensayos de chip para determinar si la pérdida de H3K18 contribuye a la pérdida de acetilación de histonas global de promotores RGS10 en células C13 quimiorresistentes. Una disminución significativa en H3K18 acetilación en promotores RGS10 se observó en células C13 quimiorresistentes, mientras H3K18 acetilación en los promotores GAPDH en células OV2008 y C13 se mantuvo sin cambios (Fig. 1C). En conjunto, estos datos sugieren la pérdida de acetilación en promotores RGS10 contribuye a la pérdida de la expresión RGS10 en dos modelos de células de cáncer de ovario independientes quimiorresistente.
HDAC1 y expresión DNMT1 reprimir RGS10 en células de cáncer de ovario quimiorresistentes
Hemos demostrado previamente que las proteínas HDAC1 se unen con frecuencia significativamente mayor al promotor RGS10 en las células A2780-AD quimiorresistentes comparación con las células A2780 chemosensitive parentales [15]. Para investigar las funciones moleculares para HDAC1 en la regulación de la expresión RGS10, un dúplex de siRNA se utilizó para golpear hacia abajo específicamente la expresión HDAC1 endógeno en las células A2780-AD. knockdown siRNA mediada de HDAC1 resultó en un aumento de más de 3 veces en la expresión RGS10 transcripción endógeno en comparación con el control de siRNA (Fig. 2A), lo que sugiere que HDAC1 juega un papel crítico en la regulación de la transcripción RGS10. Western blot confirmó HDAC1 derribar una mayor expresión de la proteína RGS10 (Figura 2B). En un experimento similar, las células A2780-AD fueron transfectadas con HDAC1 para determinar los efectos de la expresión ectópica de HDAC1. La sobreexpresión de HDAC1 reduce drásticamente la expresión en células A2780 RGS10-AD chemoresistant (Fig. 2C-E). En conjunto, estos datos indican que la acumulación de HDAC1 en promotores RGS10 probablemente contribuye a la supresión de RGS10 en células de cáncer de ovario quimiorresistentes.
A) Desmontables de HDAC1 aumenta RGS10 mRNA transcripción. células A2780-AD fueron transfectadas con HDAC1 siRNA o control de siRNA y se incubaron durante 72 horas. Se extrajo el ARN y el ADNc fue generado usando un cebador inverso de orientación para RGS10 o GAPDH región de codificación. Los datos se cuantificó mediante PCR cuantitativa con cebadores y sondas específicas para las regiones codificantes RGS10 y GAPDH. datos del gráfico muestra la media de tres experimentos independientes, con barras de error que indican el error estándar de la media (SEM). La significación se calculó mediante la prueba t de Student ** p & lt; 0,005. B) Análisis de transferencia Western que demuestra la eficiencia de la caída HDAC1 y la expresión de la proteína RGS10 siguiente HDAC1 derribar con controles Beta-actina. C-D) sobreexpresión HDAC1 disminuye la expresión en células de RGS10 chemoresistant. Las células A2780 /AD se sembraron en placas de 24 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Las células fueron transfectadas con HDAC1 500 ng o vector vacío utilizando Fugene 6 reactivo (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 48 horas de incubación, las células fueron cosechadas en TRIzol (Invitrogen) y la expresión de genes RGS10 y HDAC1 se evaluó mediante RT-PCR como se describe, y se normalizó para la expresión del gen de actina. Los valores representan la media ± SEM de cuatro experimentos independientes *** p & lt; 0,0005. E) Análisis de transferencia Western que demuestra la expresión de la proteína RGS10 siguiente sobreexpresión HDAC1 con controles Beta-actina.
El promotor RGS10-1 contiene una alta concentración de dinucleótidos CpG por lo que es un objetivo potencial para la metilación de mantenimiento durante DNMT de ovario la progresión del cáncer. En primer lugar, se determinó por Western blot que los niveles de expresión DNMT1 son similares en ambas líneas celulares A2780 y A2780-AD (Fig. 3B). Para explorar más a fondo la pertinencia de DNMT1 en la supresión específica de la expresión RGS10, ensayos de chip se llevaron a cabo en el A2780 de los padres y sus células A2780-AD resistentes derivados. Los lisados se inmunoprecipitaron con el control o anticuerpo anti-DNMT1 y se analizó ADN asociado a través cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) usando cebadores y sondas que abarcan los promotores RGS10 y GAPDH específicos. En contraste con la abundancia de proteína total, ensayos de chip revelan que la unión de DNMT1 se incrementa significativamente en el promotor RGS10 en células quimiorresistentes comparación con las células sensibles a la quimioterapia del cáncer ovárico (Fig. 3A). En conjunto, estos datos indican que la acumulación de DNMT1 en el promotor RGS10 probablemente contribuye a la supresión de RGS10 durante quimiorresistencia cáncer de ovario.
A) Los niveles de DNMT1 asociado con promotores RGS10 en células de cáncer de ovario A2780 y A2780-AD. Chip ensayos se llevaron a cabo en el A2780 de los padres y sus células A2780-AD resistentes derivados. Los lisados se inmunoprecipitaron con el control o anticuerpo anti-DNMT1. ADN asociado se aisló y se analizó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores y sondas que abarcan los promotores RGS10 y GAPDH específicos. Los valores de PCR en tiempo real se normalizaron a la cantidad total de ADN promotor añadido (entrada). Los valores se normalizaron a GAPDH y representan la media ± SEM de tres experimentos independientes ** P & lt; 0,005. B) Análisis de transferencia Western de los niveles globales DNMT1 en células A2780 y A2780-AD. Las células se recogieron y los lisados se utilizaron para la inmunoprecipitación. perlas de agarosa conjugada con anticuerpo (IP) para DNMT1 se incubaron con rotación durante la noche. Las perlas se lavaron, se eluyeron y se sometieron a transferencia de Western con anticuerpos respectivos. C) células A2780-AD fueron transfectadas con siRNA DNMT1 o con el control de siRNA y se incubaron durante 72 horas. Se extrajo el ARN y el ADNc fue generado mediante el uso de cebadores inversos dirigidos regiones codificantes RGS10 y GAPDH. Los datos generados se cuantificó mediante QRT-PCR con cebadores y sondas específicas para la región codificante RGS10. Los valores representan la media ± SEM de cuatro experimentos independientes ** P & lt; 0,005. D) Western blot para la eficiencia de derribar DNMT1 y de expresión de la proteína RGS10 siguiente DNMT1 derribar.
La acumulación de DNMT1 en el promotor RGS10 nos llevó a determinar si la acumulación que afecta RGS10 nivel de expresión del transcrito en chemoresistant células. Para este propósito, las células A2780-AD fueron transfectadas con siRNA DNMT1 o control siRNA. Se extrajo el ARN y ADNc generado se cuantificó mediante qRT-PCR con cebadores y sondas específicas para la región de codificación de RGS10 y normalizados a la expresión limpieza gen GAPDH. Los datos revelan que la anulación de DNMT1 aumenta significativamente la expresión endógena RGS10 transcripción (Fig. 3C) y la expresión de la proteína (Fig. 3D) en las células A2780-AD. Este aumento sugiere que las funciones DNMT1 con HDAC1 para regular la supresión de RGS10 transcripción en células A2780-AD chemoresistant.
La inhibición de la actividad de la HDAC DNMT y mejora la expresión RGS10 y disminuye el cáncer de ovario viabilidad celular
a continuación trató de determinar si los inhibidores farmacológicos de la desacetilación de histonas y la metilación del ADN pueden alterar la expresión de RGS10 en células de cáncer de ovario quimiorresistentes. El inhibidor de HDAC TSA y DNMT inhibidor de la 5-Aza-dC se utilizaron para inhibir HDAC y DNMTs, respectivamente. células A2780-AD fueron tratadas con 500 nM TSA y se incubaron durante 2 días o se trataron con 20 mM 5-Aza-dC y se incubaron durante 3, 5 y 7 días. ARN total fue aislado de las células no tratadas de control, la TSA, y 5-aza-DC células tratadas. La expresión relativa de la expresión del transcrito RGS10 se cuantificó mediante qRT-PCR y se normalizó a la expresión de GAPDH transcripción. En consonancia con las observaciones de HDAC1 y DNMT1 tumbar experimentos, TSA y 5-aza-DC tratamientos tanto mejora de forma significativa la expresión del transcrito RGS10 en las células A2780-AD chemoresistant (Fig. 4A y 4B). Para explorar las posibles funciones sinérgicas para HDAC1 y DNMT1 en la regulación de la expresión RGS10, se realizaron estudios de combinación usando TSA y 5-aza-DC en las células de cáncer de ovario chemoresistant. Una vez más, TSA o 5-Aza-dC solo mayor expresión RGS10 en las células A2780-AD, y la combinación de estos dos fármacos da como resultado un aumento de veces en la expresión RGS10 mayor que la suma del efecto individual, lo que sugiere un efecto cooperativo potencial (Fig . 4C). Para investigar los papeles de cooperación para HDAC1 y DNMT1 en el crecimiento celular y la quimiorresistencia, las células A2780-AD fueron tratados con TSA y /o 5-Aza-dC en presencia de ensayos de cisplatino y la viabilidad celular se realizaron. 5-Aza-dC sola redujo el crecimiento celular en aproximadamente un 40%, mientras que TSA solo tuvo un efecto modesto, pero significativo sobre la viabilidad celular; Sin embargo, la combinación de TSA y 5-Aza-dC inhibió la viabilidad celular en 90%. Como era de esperar, las células A2780-AD fueron resistentes a la toxicidad del cisplatino, pero de cualquier TSA o 5-Aza-dC parcialmente re-sensibilizaron las células a la citotoxicidad mediada por cisplatino (Fig. 4D). Para determinar si RGS10 regulación al alza por la TSA /5-aza-DC tratamiento combinado completo podría ser responsable de la pérdida de la viabilidad celular, se intentó rescatar la viabilidad celular en presencia de 5-Aza-dC y TSA con RGS10 siRNA. No es de extrañar, knock-down de RGS10 solos no rescató la viabilidad celular, en consonancia con la amplia gama de HDAC y Dnmt genes diana en las células cancerosas (Fig. 4E). Por lo tanto, RGS10 regula coordinadamente la viabilidad celular y la quimiosensibilidad con HDAC adicionales y genes diana DNMT.
ARN total fue aislado de las células de control no tratadas y TSA o 5-Aza-dC células tratadas. La expresión relativa de ARNm RGS10 se cuantificó mediante qRT-PCR y se normalizó a la expresión de GAPDH transcripción * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,005. A) la inhibición de HDAC aumenta la expresión en las células A2780 RGS10-AD quimiorresistentes. Las células se sembraron en unos 10 cm
2 placa y se incubaron durante 24 horas. El día siguiente, las células fueron tratadas con 500 nM TSA y se incubaron durante 48 horas adicionales. B) DNMT inhibidor de la 5-aza-DC aumenta la expresión en células de RGS10 chemoresistant. Dos millones de células A2780-AD fueron sembradas en 10 cm
2 placas y se incubaron durante 24 horas. Al día siguiente, las células fueron tratadas con 20 mM 5-aza-DC. Medios de Comunicación y la droga fueron renovados cada 24 horas. Después de tiempo de incubación indicado (3, 5, y 7 días), se recogieron las células, se aisló mRNA y cDNA se generó y se cuantificaron utilizando QRT-PCR con cebadores y sonda específicos. C) Las células A2780-AD se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con 5 M 5-aza-DC durante 5 días, 500 nM TSA durante 36 horas, una combinación de 5 M 5-aza-DC durante 5 días y 500 nm TSA para las últimas 36 horas o DMSO. La expresión génica se evaluó mediante qRT-PCR como se describe, y se normalizó a la expresión génica RPL13A. La flecha indica el nivel de expresión predicho por un efecto aditivo de TSA y 5-Aza-dC. D) En un experimento paralelo, las células A2780-AD fueron tratados en las mismas condiciones que 4C con o sin cisplatino 30 M durante los últimos 12 horas. La supervivencia celular se evaluó mediante ensayos de viabilidad fluorimétricos CellTiter-Blue. ***: P & lt; 0,001 comparar fármaco epigenético al control de DMSO en ausencia de cisplatino. ###: P & lt; 0,001 vehículo comparando frente a tratamiento con cisplatino dentro de los grupos de tratamiento de drogas epigenéticos. El cuadro de puntos indica la viabilidad celular predicha por un efecto aditivo de la TSA y 5-aza-DC. E) Las células A2780 /AD (5000 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con el control negativo o dúplex RGS10 siRNA (Ambion Grand Island, NY) según el protocolo del fabricante utilizando el reactivo de transfección Dharmafect1 (Dharmacon). Las células se dosificaron con una combinación de 5 M 5-Aza-dC durante 3 días y 500 nM TSA para el último 36 h o DMSO. Se añadió cisplatino 30 M o vehículo para el último 12 h. La supervivencia celular se evaluó mediante ensayos de viabilidad fluorométricos CellTiter-azul.
El derribo de HDAC1 potencia la apoptosis estimulada por cisplatino en las células chemoresistant
Nuestro trabajo anterior sugiere que la supresión de la expresión RGS10 contribuye a la desarrollo de quimiorresistencia durante la progresión del cáncer de ovario a través de la amplificación de la señalización de supervivencia vías endógenas [2], [15], y los resultados presentados aquí sugieren que HDAC1 contribuye a la pérdida de la expresión RGS10 en células de cáncer de ovario quimiorresistentes. Para determinar los cambios HDAC1 mediada en la supervivencia celular de células de cáncer de ovario quimiorresistentes, las células A2780-AD resistentes a cisplatino fueron transfectadas con HDAC1 siRNA. Después de la transfección, las células fueron incubadas con cisplatino 50 M y la apoptosis se analizaron mediante un Anexina V: PE kit de detección de apoptosis (BD Pharmingen). Anexina V se une fosfatidilserina, que se expone sólo en las células apoptóticas, mientras que la etiqueta de ADN impermeant membrana 7-aminoactinomicina D (7-AAD) se une selectivamente a regiones GC del ADN solamente a fines de apoptosis o las células muertas con membranas comprometidas [30] - [32]. Por lo tanto, las células apoptóticas temprana se tiñen con solamente anexina V-PE, mientras que las células apoptóticas tarde y muertas se tiñen con tanto anexina V-PE y 7-AAD. Se utilizó el análisis de citometría de flujo para distinguir entre las poblaciones de células no marcadas y enlaces sencillos o doblemente marcada. HDAC1 tumbar aumentó significativamente la población de células estimuladas con cisplatino del 12,9% al 32,1% que son positivas tanto para anexina V-PE y 7-AAD (finales de células apoptóticas o muertas) (Fig. 5A). Los resultados se confirmaron mediante tres experimentos independientes (Fig. 5B). Derribar eficacia de la expresión de proteínas HDAC1 y RGS10 después de la HDAC1 tumbar fue confirmada en las células A2780-AD por Western blot (Fig. 5C). En conjunto, estos datos sugieren que la reducción mediada por HDAC1 de expresión RGS10 embota la capacidad de cisplatino para inducir la muerte celular en las células de cáncer de ovario A2780 /AD.
células A2780-AD fueron tratados con HDAC1 siRNA o control siRNA y se incubaron durante 48 horas. Después de la incubación, las células se trataron con 50 M de cisplatino y se incubaron durante 48 horas Además en medio RPMI 1640. Un Anexina V: Kit de Detección de Apoptosis PE I (BD Pharmingen) se utilizó para la tinción; Los resultados se cuantificaron por citometría de flujo y se analizaron utilizando el software FlowJo. Las células viables fueron negativos tanto para anexina V-PE y 7-AAD; primeras células apoptóticas fueron positivas para anexina V-PE y negativo para 7-AAD, mientras que las células muertas finales apoptóticas fueron positivos tanto para la anexina V-PE y etiquetado 7-AAD. A) El aumento relativo de células apoptóticas en HDAC1- siRNA transfectadas las células A2780-AD que incorporaron la 7-AAD manchas Anexina V-PE y. B) gráfico representan la media de tres experimentos independientes, con barras de error que indican SEM * p & lt; 0,05. C) Análisis de transferencia Western representa la eficiencia de la caída HDAC1 y la expresión de la proteína RGS10 siguiente HDAC1 derribar.
DNMT1 derribar disminuye HDAC1 vinculante para el promotor RGS10 en las células de cáncer de ovario chemoresistant
HDAC1 y DNMT1 contribuir al silenciamiento génico mediante la contratación de represores de la transcripción al promotor regiones [33] - [35] y trabajar juntos para suprimir la expresión de genes [24], [36]. Nuestros datos sugieren que las actividades de HDAC y DNMT cooperativamente silenciar RGS10 (Fig. 4C). Para investigar la interferencia entre estos dos reguladores epigenéticos, las células A2780-AD fueron transfectadas con siRNA DNMT1 o control siRNA y se incubaron durante 72 horas. vinculante para el promotor RGS10 HDAC1 se examinó mediante ensayos de chip en DNMT1 siRNA o controlar las células A2780-AD tratado siRNA. DNMT1 derribar disminuyó significativamente la unión de HDAC1 al promotor RGS10 (Fig. 6A) y análisis de transferencia Western (Fig. 6B) demostró knockdown éxito y específica de DNMT1. El experimento inverso también se llevó a cabo cuando se transfectaron células A2780-AD con HDAC1 siRNA. El análisis de transferencia Western demostró desmontables de HDAC1 resultó en la supresión de la expresión de la proteína DNMT1 (datos no mostrados); una observación visto por los demás, así [37]. Estos datos sugieren que HDAC1 es reclutado al promotor a través de RGS10 DNMT1 y metil-CpG proteína de unión 2 mecanismos dependientes (MeCP2) (Fig. 6C).