Extracto
midkina (MDK) es un factor de crecimiento de unión a heparina que se expresa altamente en muchos tumores malignos, incluidos los cánceres de pulmón. MDK activa la vía PI3K e induce la actividad anti-apoptótica, a su vez mejora la supervivencia de los tumores. Por lo tanto, la inhibición de la MDK se considera una estrategia potencial para la terapia del cáncer. En el presente estudio, hemos demostrado una pequeña molécula nueva compuesto (iMDK) que se dirige a MDK. iMDK inhibió el crecimiento celular de células de adenocarcinoma de pulmón H441 MDK-positivos que albergan un oncogénico
KRAS
mutación y las células de cáncer de pulmón de células escamosas H520, ambos de los cuales son los tipos de cáncer de pulmón intratable. Sin embargo, iMDK no redujo la viabilidad celular de células de adenocarcinoma de pulmón A549 MDK-negativo o células normales de fibroblastos de pulmón humano (NHLF) que indica su especificidad. iMDK suprimió la expresión endógena de MDK pero no la de otros factores de crecimiento tales como PTN o VEGF. iMDK suprimió el crecimiento de células H441 mediante la inhibición de la vía PI3K y la inducción de apoptosis. La administración sistémica de iMDK inhibió significativamente el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón
in vivo
. La inhibición de MDK con iMDK proporciona un enfoque terapéutico potencial para el tratamiento de los cánceres de pulmón que son impulsados por MDK
Visto:. Hao H, Maeda Y, Fukazawa T, T Yamatsuji, Takaoka H, XH Bao, y col . (2013) La inhibición del Factor de Crecimiento MDK /midkina por un nuevo compuesto de moléculas pequeñas para tratar de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (8): e71093. doi: 10.1371 /journal.pone.0071093
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 23 Marzo, 2013; Aceptado: 25 Junio 2013; Publicado: 16 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Hao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH subvenciones) a la mandíbula (http://report.nih.gov/index.aspx, número de concesión: HL095580, HL108907, HL110964), el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura, Japón, YN (http://www.jsps.go.jp/english/index.html, el número de concesión: 23591950) y la Universidad de Programa de Investigación Postdoctoral Fellow Cincinnati a YM. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dr. MN es un empleado de una empresa comercial "OSI Pharmaceuticals Co., Ltd '. Sin embargo, el OSI Pharmaceuticals Co., Ltd. no financió este estudio y no hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. El empleo por el OSE Pharmaceuticals Co., Ltd. no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1,2]. regímenes quimioterapéuticos convencionales dirigen a las células de cáncer de pulmón, sino también las células normales en proliferación. En la actualidad, la supervivencia después de la quimioterapia convencional del adenocarcinoma de pulmón (el tipo más frecuente de cáncer de pulmón) proporciona menos de la mediana de supervivencia de un año desde el momento del diagnóstico [3]. -terapias moleculares vía específica para el adenocarcinoma de pulmón, por ejemplo, de orientación mutante
EGFR
o
ALK
fusiones, limitar la toxicidad no tumoral y se extienden el tiempo de supervivencia en comparación con las quimioterapias convencionales [4] - [6 ]. Sin embargo, no hay ninguna terapia dirigida molecularmente para mutante
KRAS
adenocarcinoma de pulmón impulsada, el tipo más frecuente de adenocarcinoma de pulmón en la población caucásica. Por otra parte, eficaces terapias molecularmente dirigidos, han sido desarrollados para adenocarcinomas pero no carcinomas de células escamosas. Por lo tanto, las terapias específicas que se dirigen a diversos tipos de tumores de pulmón se necesitan desesperadamente [7] - [9].
midkina (MDK) es un factor de crecimiento de unión a heparina que es altamente expresado en muchos tumores malignos, incluyendo de pulmón, esófago, estómago, colon, hepatocelular, de mama, carcinoma renal y pancreático [10] - [15]. MDK se une a varios receptores de membrana, ALK, syndecans, PTP y PRL, y posteriormente activa la PI3 quinasa (PI3K) y las vías de MAP quinasa. Estas dos vías de inducir la proliferación celular y mejorar las actividades angiogénicas y anti-apoptóticos [16], [17]. La inhibición de la
MDK
por siRNA suprime el crecimiento celular de las células cancerosas que expresan MDK [18], lo que indica que MDK podría ser un objetivo potencial para la terapia del cáncer de pulmón. Dado que los ratones que carecen de la
Mdk
gen son viables [19], la orientación MDK es un enfoque terapéutico atractivo ya es poco probable que tenga efectos nocivos sistémicos su inhibición. El reconocimiento del papel potencial de la vía MDK en el tratamiento del cáncer ha aumentado los esfuerzos para identificar inhibidores de MDK. Matsui et al. péptidos sintéticos identificados y los compuestos que inhiben la migración celular mediada por MDK
in vitro
; sin embargo, éstos no resultó ser potente y carecen de utilidad clínica [20].
En el presente estudio, hemos identificado un compuesto de bajo peso molecular (iMDK) que suprime la expresión endógena MDK. iMDK inhibió el crecimiento de MDK-H441 expresando células de adenocarcinoma de pulmón que albergan una oncogénico
KRAS
mutación y las células de cáncer de pulmón de células escamosas H520
in vitro
. Por otra parte, iMDK suprimió el crecimiento de tumores de pulmón y de la muerte celular inducida por la inhibición de la vía de la PI3 quinasa y la inducción de apoptosis en un modelo de xenoinjerto de ratón derivadas de células de adenocarcinoma de pulmón H441. Orientación de la expresión de MDK ofrece un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de MDK-expresión no pequeñas de cáncer de pulmón de células.
Materiales y Métodos
Reactivos
3- [2 - (4-fluorobencil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] 2H-cromen-2-ona (en adelante iMDK) comprado de ChemDiv (San Diego, CA) se disolvió en DMSO. PD0325901 (un inhibidor de MEK) se obtuvo de signalinginhibitors.com (Wedel, Schleswig Holstein, Alemania).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
Las células de adenocarcinoma pulmonar humano H322, H358, H441 y A549 y las células de carcinoma de células escamosas de pulmón humano H520 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en RPMI 1640 (H322, H358, H520) o alto nivel de glucosa medio de Dulbecco modificado de Eagle (H441, células A549) suplementado con 10 % inactivado por calor suero fetal bovino. Las células de mesotelioma maligno humanos ACC-meso-1 (meso-1) obtenida a partir de JCRB Banco de Células (Osaka, Japón) y las células de carcinoma de células escamosas de pulmón humano SQ5 amablemente proporcionados por el doctor del Kiura Katsuyuki (Departamento de Hematología, Oncología, y Respiratory Medicine, Universidad de Okayama Facultad de Medicina, Odontología y Ciencias farmacéuticas, Okayama, Japón) [21] fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Los fibroblastos de pulmón humano NHLF células normales obtenidos de Clonetics (San Diego, CA) se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco glucosa alta. Todas las líneas celulares se cultivaron en 5% de CO
2 a 37 ° C.
inmunotransferencia análisis
Las células fueron lisadas en helado M-PER tampón de lisis comprado de Thermo Fisher Scientific ( Rockford, IL). Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación (20 min a 15.000 × g a 4 ° C) y la concentración de proteína determinaron utilizando el ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Cantidades iguales de proteína fueron separadas en un gel de SDS-PAGE. El gel se transfirió electroforéticamente a una membrana de transferencia PVDF Hybond (GE Healthcare Ltd., Piscataway, NJ) y se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios según la Supersignal
® protocolo de quimioluminiscencia West Pico (Pierce, Rockford, IL). Se obtuvo anticuerpo específico para el anticuerpo β-actina de Sigma (St. Louis, MO) y el anticuerpo específico para MDK humana y PTN (pleiotrophin) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, UK). Anticuerpo específico para la caspasa-3, PI3 quinasa p85, p85 fosforilada-PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199), AKT, fosforilada-AKT (Ser473), ERK1 /2, fosforilados ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38MAPK, MAPK fosforilada p38 (Thr180 /yr182), Bad, XIAP, survivin se obtuvieron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). específica de anticuerpos para VEGF se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano secundaria se obtuvieron de Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).
siRNA mediada por la inhibición de MDK
A. H441 células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 por pocillo y se cultivaron durante la noche a 37 ° C. El siguiente día 100 pmol de dos diferentes siRNAs orientación MDK (D-003677-02-0050 y D-003677-03-0050) o nontargeting siRNA (Thermo Scientific) se transfectaron usando Lipofectamine 2 l 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo de incubación para los reactivos de transfección fue de 24 horas, en cuyo tiempo medio se reemplazó con medio normal fresco. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección para los ensayos de inmunotransferencia y el crecimiento celular.
viabilidad de las células de ensayo
células H441, células A549, H520, células HEK293 y células NHLF se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células y se cultivaron a 37 ° C durante 24 horas. El medio se retiró por aspiración y se reemplazó con medio de cultivo fresco que contiene iMDK disuelto en DMSO (10, 50, 100, 500 nmol /L). DMSO solo se utilizó como control. Las células fueron tratadas durante 48 horas y se recogieron por tripsinización. Las células viables se evaluaron mediante exclusión con azul y WST-1 ensayos de tripano (Roche Molecular Bioquímicos, Laval, Quebec, Canadá) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Recombinante MDK se adquirió de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN) y se reconstituyó en agua para experimentos de bloque. Para los experimentos de bloques MDK, H441 células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 1% de bovino fetal inactivado por calor durante la noche y MDK recombinante (25 nM) y /o se añadió iMDK (25 nM) durante 48 horas adicionales.
Hoechst tinción
características morfológicas de la apoptosis se evaluaron utilizando colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR), que tiñe el ADN. Las células se incubaron con 1 g de colorante Hoechst /ml y después se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia (IX81, Olympus Medical Systems Corp., Tokio, Japón) [22].
TUNEL tinción
deoxynucleotidyltransferase Terminal etiquetado final nick dUTP-biotina mediada (TUNEL) tinción se realizó para detectar la apoptosis utilizando el sistema de DeadEnd colorimétrico TUNEL (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
análisis de citometría de flujo para la apoptosis
las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 0,5 × 10
5 células por pocillo 1 día antes de los tratamientos. Después de 72 horas, se recogieron las células y se lavaron una vez con PBS. Las células se resuspendieron en PBS que contenía 0,2% de Triton X-100 y 1 mg /ml de ARNasa durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se tiñeron con yoduro de propidio a 50 mg /ml para determinar sub-G
0 /G
1 contenido de ADN usando un FACScan. Dobletes, restos celulares y artefactos de fijación fueron cerrada a cabo, y se determinó
0 /G contenido sub-G
1 usando ADN de la célula de Quest Ver. 3.3 Descargas de Software
Ratón experimentos
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Okayama Facultad de Medicina y Odontología. (Número de referencia del Comité de Ética: Oku-2011472). xenoinjertos de cáncer de pulmón humano se establecieron en 6 semanas de edad BALB /c desnudos ratones hembra (Charles River Laboratories Japón, Kanagawa, Japón) por vía subcutánea (sc) la inoculación de células H441 (1 × 10
6/50 l) mezclado con Matrigel
® (BD Pharmingen, San Diego, CA; 50 l) en el flanco dorsal [23]. Los ratones fueron asignados al azar en tres grupos (n = 8 por grupo) 14 días después de la inoculación del tumor. Un grupo de ratones se trató por vía intraperitoneal con 100 solución l que contiene iMDK (9 mg /kg) tres días a la semana (en los días 1, 3, 5, 8, 10) y otro grupo de ratones se trató cinco días a la semana (en días 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10). DMSO se administró en el grupo control. Los tumores se midieron dos a tres veces a la semana, y el volumen del tumor se calculó como un × b
2 × 0,5, donde a y b eran diámetros grandes y pequeñas, respectivamente. En el día 10, se midió el peso corporal y todos los ratones se sacrificaron y los tumores retira y se preparó para la histología. Para el análisis de AST y ALT en suero, se extrajo sangre del corazón 48 horas después del tratamiento con iMDK (9 mg /kg).
Para la inmunohistoquímica, las secciones se desparafinaron secuencialmente a través de una serie de xileno, etanol graduado, y los pasos de inmersión en agua. Después de ser tratado en autoclave en tampón de citrato 0,2% durante 15 minutos, las secciones se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 minutos para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Se obtuvo un anticuerpo primario específico para p85 fosforilada-PI3K (Tyr458) /p55 (Tyr199) de Señalización Celular Tecnología. Los anticuerpos para MDK y CD31 /PECAM-1 eran de Abcam. El anticuerpo para VEGF era de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las muestras se incubaron durante la noche a 4 ° C con una dilución de anticuerpo 1:200 seguido de tres lavados con TBS. Las diapositivas fueron tratados con el complejo estreptavidina-biotina (polímero marcado sistema Envision, peroxidasa de rábano picante [HRP], Dako, Carpinteria, CA) durante 60 minutos a una dilución de 1:100. Inmunoreacciones se visualizaron usando un 3,3 'diaminobencidina (DAB) solución de sustrato-cromógeno (sustrato cromógeno sistema Dako Cytomation Liquid DAB, Dako) y de contraste con hematoxilina. Las secciones se sumergieron en un baño de etanol y xileno y se montaron para su examen.
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas entre las medias y medianas de los grupos de estudio se evaluaron utilizando la prueba t de Student. La significación estadística se definió como p & lt; 0,05 (#) o p & lt; 0,01 (*)
Resultados
La inhibición de MDK reduce la viabilidad de las células de adenocarcinoma de pulmón H441
Con el fin. para encontrar una línea celular de NSCLC que depende de MDK para el crecimiento celular, se evaluó la expresión endógena de proteínas MDK en cuatro células de NSCLC l ines diferentes y células NHLF (normal pulmón humano fibroblastos). células de riñón embrionario HEK293 se utilizaron como control positivo para la expresión MDK. Como se muestra en la Figura 1A, MDK se detectó en células HEK293, H441 células de adenocarcinoma de pulmón y células de carcinoma de células escamosas de pulmón humano H520 pero no en A549, H322 y H358 células de adenocarcinoma de pulmón, células de carcinoma de células escamosas SQ5 pulmonares o 1 meso-células de mesotelioma maligno . MDK no se expresó en células NHLF normales. La línea celular H441 se deriva de un tumor de pulmón NSCLC que tiene un
KRAS
mutación. Activado
RAS
es la mutación más común asociado con los adenocarcinomas pulmonares en la población caucásica y tratamientos eficaces para esta enfermedad aún no se han identificado [24]. Con el fin de determinar si las células H441 dependen de MDK para la viabilidad celular, inhibimos MDK usando siRNA y examinamos el crecimiento celular en presencia y ausencia de MDK. Como se muestra en la Figura 1B, 48 horas después de la transfección, dos siRNAs MDK diferentes suprimidos MDK en células H441 comparado con siRNA no la focalización. La inhibición del crecimiento se indujo de manera significativa por la supresión de MDK (p & lt; 0,01; Figura 1C). Estos resultados demuestran que la orientación MDK es una estrategia efectiva para suprimir el crecimiento de células de cáncer que expresa MDK no microcítico de pulmón de células.
MDK se detectó en células HEK293, H441 células de adenocarcinoma de pulmón y células de carcinoma de células escamosas de pulmón humanas H520 pero no en los otros tipos de células, incluyendo las células NHLF (normales de pulmón humano de fibroblastos). Expresión de proteínas de MDK y μ-actina se confirmó mediante inmunotransferencia como se describe en Métodos. A. MDK fue suprimida por dos siRNAs MDK diferentes (MDK MDK siRNA1 y siRNA2) en células H441. expresión de la proteína se confirmó mediante inmunotransferencia como se describe en la inhibición A. B. El crecimiento de células H441 después de silenciamiento de genes MDK se incrementó de manera significativa. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripán como se describe en Métodos. La significación estadística se definió como p. & lt; 0,01 (*) guía empresas
iMDK inhibe la expresión MDK endógena en células de adenocarcinoma de pulmón H441
Con el fin de encontrar un compuesto terapéutico que inhibe la expresión de MDK, nos desarrollado por primera vez un reportero línea celular MDK mediante la transfección de células HEK293 establemente con un constructo de luciferasa fusionado con el promotor MDK. Utilizamos esta línea celular modificada para detectar 44.000 compuestos en el Discovery Center de Drogas de la Universidad de Cincinnati. se utilizó la detección de la actividad luciferasa para identificar inhibidores MDK. En este cribado, se identificaron un compuesto (3- [2- (4-fluorobencil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] 2H-cromen-2-ona; en lo sucesivo iMDK, Figura 2A) que inhibe de forma reproducible proteína endógena MDK expre sión. Se evaluó la eficacia de iMDK por su capacidad para inhibir específicamente la expresión de MDK en células H441. Como se muestra en la Figura 2B, iMDK inhibida MDK endógeno en una manera dependiente de la dosis, pero no inhibió la PTN (pleiotrophin), que tiene considerable homología con MDK [17]. Tampoco iMDK inhibir otro factor de crecimiento, VEGF, en células de adenocarcinoma de pulmón H441 48 horas después del tratamiento.
A. Estructura de iMDK (3- [2- (4-fluorobencil) imidazo [2,1-beta] [1], [3] tiazol-6-il] 2H-cromen-2-ona). B. MDK pero no PTN o VEGF fue suprimida por iMDK dependiente de la dosis en células H441 48 horas después del tratamiento. Se realizó un análisis de inmunotransferencia como se describe en Métodos.
iMDK inhibe la viabilidad celular de MDK-que expresan las células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas
A fin de determinar la eficacia y la especificidad de iMDK en la supresión MDK-expresión de las células tumorales, que trata tanto las células MDK-positivas y negativas con MDK-iMDK y evaluado la viabilidad celular. MDK se expresa en células de riñón embrionario HEK293, células de adenocarcinoma de pulmón H441 y células de carcinoma de células escamosas de pulmón H520 pero no en células de carcinoma de pulmón A549 o células NHLF no transformadas (Figura 1A). Estas cinco líneas de células se trataron con un intervalo de concentraciones iMDK (0 a 500 nM) y la viabilidad celular se evaluó 48 horas después del tratamiento. La inhibición del crecimiento por iMDK era dependiente de la dosis inducida en el MDK-positivo HEK293, H441 y H520 células, pero no las células A549 o células no transformadas NHLF (Figura 3A, S1) MDK-negativo. Morfológicamente, la supresión del crecimiento de las células H441 fue dependiente de la dosis observó 48 horas después del tratamiento con iMDK (Figura 3B). La supresión del crecimiento celular por iMDK fue bloqueado parcialmente por el tratamiento previo con MDK recombinante (25 nM) en las células H441 MDK-positivas; sin embargo, el pretratamiento con MDK recombinante no alteró significativamente el crecimiento celular en las células A549 MDK-negativo (Figura S2). Este hallazgo sugiere que el efecto supresor sobre el crecimiento celular por iMDK está mediada al menos en parte por la inhibición de la expresión MDK.
B. La inhibición del crecimiento por iMDK se incrementó en el MDK-positivo HEK293, H441 y H520 células, pero no las células A549 o células normales NHLF MDK-negativo después de 48 horas de tratamiento. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripán como se describe en Métodos. La significancia estadística se definió como p & lt; 0,01 (*). Se observó una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis por iMDK morfológicamente en H441 células de adenocarcinoma de pulmón. Se muestran las microfotografías de contraste de fase de células H441 48 horas después del tratamiento iMDK (barra de escala muestra de 100 micras).
iMDK induce la apoptosis en células de adenocarcinoma de pulmón H441
Con el fin de entender la mecanismo por el cual iMDK inhibe el crecimiento de células H441, se evaluó la células para la apoptosis 48 horas después del tratamiento con iMDK. Como se muestra en la Figura 4A, altamente condensada y se observaron en parte núcleos fragmentados en células H441 pero no en células normales NHLF después del tratamiento con iMDK, lo que indica que la apoptosis inducida en iMDK MDK-expresión de células H441. células TUNEL positivas también se incrementaron significativamente en células H441 horas después del tratamiento iMDK de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B), además de confirmar la inducción de la apoptosis por iMDK. Como se muestra en la figura 4C, las formas escindidas de la caspasa-3, un marcador de la apoptosis se indujo por iMDK incluso a las concentraciones más bajas (5 nM) en células H441 48 horas después del tratamiento. sub-G
0 /G
1 contenido de ADN de las células H441 fue altamente aumentó de 1,24% (control de DMSO) al 37.00% (10 nM) y 60,91% (25 nM) 72 horas después del tratamiento con iMDK. Sin embargo, sub-G
0G
1 ADN contenido de las células NHLF se incrementó mínimamente de 0,32% (control de DMSO) al 0,52% (10 nM) y 1,51% (25 nM) después del tratamiento con iMDK (Figura 4D) . En conjunto, estos resultados indican que iMDK induce selectivamente la apoptosis en MDK-expresión de células de adenocarcinoma de pulmón H441 pero no en células NHLF normales que no expresan MDK.
iMDK dependiente de la dosis el aumento de la apoptosis en células H441 pero no las células normales NHLF . Las células se trataron con las concentraciones indicadas de iMDK durante 72 horas y luego se tiñeron con colorante Hoechst 33342 y se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia como se describe en Métodos (barra de escala muestra 50 micras). La apoptosis se indujo en células H441 48 horas después del tratamiento iMDK a una concentración de 25 nM (panel superior, la barra de escala muestra 200 micras). células TUNEL positivas se incrementaron en un tratamiento iMDK de una manera dependiente de la dosis (panel inferior). TUNEL tinción se realizó como se describe en Métodos. La significancia estadística se definió como p & lt; 0,05 (#). A. exfoliados caspasa-3, un marcador de la apoptosis, se aumentó en células H441 después del tratamiento iMDK. células H441 se trataron durante 48 horas con iMDK en las concentraciones indicadas y la recolección para el análisis de inmunotransferencia como se describe en Métodos. D. iMDK inducida sub-G
0 /G
1 el contenido de ADN en las células H441. Las células se trataron con iMDK durante 72 horas y el contenido de ADN se midió por propidio tinción de yoduro y el análisis de citometría de flujo como se describe en Métodos.
iMDK suprime la PI3K e induce las vías de apoptosis en células de adenocarcinoma de pulmón H441
PI3K está involucrada en la tumorigénesis mediante la activación de AKT, que a su vez aumenta los factores anti-apoptóticos, tales como XIAP y survivin, y disminuye un factor pro-apoptóticos BAD [25] - [27]. Desde MDK activa la actividad de PI3K [16], [28], hemos tratado de determinar si la vía PI3K fue suprimida por la inhibición mediada por MDK iMDK en células H441. La fosforilación de PI3K y AKT fueron suprimidos por iMDK en una dosis (Figura 5A) y de manera dependiente del tiempo (Figura 5B), lo que indica que la vía PI3K /AKT se inhibe por iMDK. factores anti-apoptóticos, XIAP y survivin, se redujeron mientras que el factor pro-apoptóticos, BAD, se indujo por iMDK de la dosis y dependiente del tiempo de la manera (Figura 5), indicando que la ruta apoptótica es inducida por iMDK. MDK también se conoce para activar ERK (a MAPK) en células no tumorigénicas normales [16], [28]; sin embargo, ERK y p38MAPK no fueron inhibidas por iMDK en H441 células de adenocarcinoma de pulmón (Figura S3). Estos resultados indican que iMDK suprime la vía PI3K /AKT, pero no la vía MAPK y a su vez provoca la apoptosis en células H441.
A. Dependiente de la dosis, la fosforilación de PI3K y AKT y la expresión de survivina y XIAP, factores anti-apoptóticos, se disminuyó, mientras que la expresión de BAD, un factor pro-apoptóticos, se incrementó de 48 horas después del tratamiento con iMDK. Se muestra se lleva a cabo inmunotransferencia como se describe en Métodos. B. Tiempo-dependiente, la fosforilación de PI3K y AKT y la expresión de survivina y XIAP se disminuyó, mientras que la expresión de BAD se aumentó mediante el tratamiento con iMDK a una concentración de 50 nM. Inmunoblot se realizó tal como se describe en Métodos.
iMDK suprime el crecimiento de tumores de pulmón e induce la apoptosis en un modelo de ratón con xenoinjerto
Con el fin de determinar si la administración sistémica de iMDK suprime el crecimiento tumoral
in vivo
, iMDK (9 mg /kg) se inyectó por vía intraperitoneal o bien 3 o 5 veces a la semana en ratones desnudos portadores de xenoinjertos derivados de las células de adenocarcinoma de pulmón H441 14 días después de la inoculación del tumor. xenoinjertos de tumores pulmonares continuaron creciendo en el control (DMSO tratada) grupo, mientras que el crecimiento del tumor de pulmón fue detenido en los grupos tratados con iMDK. El volumen de los tumores en el grupo tratado con iMDK fue significativamente menor que en el grupo control (Figura 6A y 6B). MDK y PI3K fosforilada se observaron en tumores de pulmón de los ratones de control, pero no en los ratones tratados con iMDK (Figura 6C), en consonancia con
in vitro
estudios (Figura 5). la fragmentación del ADN detectado por tinción TUNEL se indujo en los tumores de los ratones tratados con iMDK pero no en los de los ratones de control (Figura 6D), lo que indica que iMDK induce apoptosis
in vivo
también. En particular, el tratamiento de iMDK no influyó en el peso corporal y los niveles séricos de AST y ALT en los ratones (Figura S4), lo que sugiere que iMDK no causa toxicidad sistémica.
A. Volumen de los tumores derivados de células de adenocarcinoma de pulmón H441 se redujo después del tratamiento con iMDK (9 mg /kg) en un modelo de xenoinjerto de ratón. DMSO se utilizó para el grupo de control. iMDK se administró 3 veces /semana o 5 veces /semana, como se muestra. Ocho ratones fueron utilizados en cada grupo. El volumen del tumor se controló cada día después de la inoculación de las células H441. El crecimiento del tumor se expresa como el volumen medio del tumor; barras representan SD. La significancia estadística se definió como p & lt; 0,01 (*). B. Se muestra una imagen de tumores de xenoinjertos derivados de las células H441, que se disecan a partir de los ratones de xenoinjerto 10 días después del tratamiento con iMDK. Expresión de MDK y la fosforilación de PI3K (pPI3K) se reduce por el tratamiento iMDK en los tumores de xenoinjertos. La expresión de un marcador de la angiogénesis CD31 /PECAM-1 fue inhibida por iMDK aunque la expresión de un factor de crecimiento VEGF angiogénesis no se alteró. La inmunohistoquímica se realizó utilizando las secciones de tumor de xenoinjerto, como se describe en Métodos. El control es del grupo DMSO administrada. (Barra de escala muestra de 100 micras). iMDK apoptosis inducida
in vivo
. tinción TUNEL con los tumores de xenoinjertos tratados DMSO (control) o iMDK se realizó tal como se describe en Métodos (barra de escala muestra de 200 micras).
Desde MDK se sabe que inducen la angiogénesis [29], hemos tratado de si la inhibición de la angiogénesis por iMDK podría, en parte, contribuir a la reducción de los tumores de pulmón
in vivo
. Como se muestra en la Figura 6C, la expresión de VEGF, otro factor de crecimiento de la angiogénesis [30], no se altera, consistente con
in vitro
estudio (Figura 2); sin embargo, la expresión de CD31 /PECAM-1, un marcador de la angiogénesis [30], se redujo en tumores de pulmón tratados por iMDK, lo que indica que iMDK inhibe la angiogénesis de forma independiente de VEGF y, a su vez suprime la tumorigénesis de pulmón
in vivo
. Estos
in vivo
resultados indican que iMDK es probable que sea un anti-tumorigénico /fármaco prometedor angiogénico terapéutico dirigido cáncer de pulmón MDK-expresión y sin efectos secundarios.
Discusión
La éxito de las pequeñas moléculas que inhiben específicamente la función de EGFR en el mutante
EGFR
impulsada por adenocarcinoma de pulmón ha promovido la terapia molecular dirigida para el cáncer de pulmón [4], [5], [31], [32]. Por otra parte, los tratamientos dirigidos para mutante
KRAS
adenocarcinoma impulsada de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón no se han desarrollado distintos de quimioterapia que se dirigen tanto a las células cancerosas y las células normales en proliferación [7] - [9]. En el presente estudio, hemos identificado un pequeño iMDK compuesto molécula que inhibe la expresión de MDK, un factor que promueve el crecimiento del tumor. iMDK inhibe la vía PI3K /AKT y suprimió
KRAS
-mutated adenocarcinoma de pulmón mediante la inducción de la apoptosis
in vitro
y
in vivo
. iMDK no afectó la viabilidad de las células normales en proliferación NHLF. Además, no se observó toxicidad sistémica evidente en los ratones tratados con iMDK, apoyando la utilidad potencial de iMDK para la terapia de adenocarcinoma de pulmón MDK dependiente
.
MDK es conocida por activar no sólo la vía PI3K /AKT, sino también la vía MAPK en cultivo primario neuronal [16] y el miocardio [28]; Sin embargo, en nuestro estudio iMDK inhibió solamente la vía PI3K pero no la vía MAPK, y de hecho activa la vía MAPK en las células de adenocarcinoma de pulmón H441 (Figura S3). El mecanismo por el cual iMDK inhibe solamente la vía PI3K pero no la vía MAPK es desconocida. La regulación positiva de la vía MAPK podría ser la activación compensatoria por la regulación a la baja de la vía PI3K en las células H441. El tratamiento de las células H441 con el inhibidor de MAPK (PD0325901) o el inhibidor de PI3K /AKT (LY294002) no influyó en la expresión de MDK (Figura S5 y datos no presentados), lo que sugiere que la supresión de MDK por iMDK no está mediada a través de la MAPK y las vías PI3K /AKT.
Desde MDK es altamente expresado en hepatocelulares, gástricos, colorrectales y de próstata [17], el inhibidor de iMDK MDK puede ser útil para el tratamiento de tumores no pulmonares también. Además, la expresión MDK se asocia con diversas enfermedades inflamatorias, incluyendo la artritis reumatoide y la aterosclerosis [19], [33].
Mdk
-knockout ratones son resistentes al desarrollo de la artritis reumatoide mediante la prevención de la migración de leucocitos inflamatorios y osteoclastos diferenciación [33]. Los ratones knockout son también resistentes a la formación de neoíntima, una característica común de la aterosclerosis y la restenosis [34]. Estos resultados sugieren que iMDK puede ser útil para el tratamiento de estas enfermedades no tumorigénicas también.
Además de iMDK, hemos identificado otro pequeño compuesto molécula que también suprimió la expresión de MDK. El otro compuesto tiene un Cl en lugar de F en la estructura de la molécula iMDK y ejerce efecto de la dosis similar a iMDK (datos no presentados), lo que indica que iMDK puede ser modificada estructuralmente para ser más eficaz y seguro. Dado que el grado de inhibición de
MDK
ARN fue menor que la de la proteína MDK (datos no mostrados), iMDK puede dirigir la proteína MDK directamente. Biotina-etiquetados iMDK o marcada con radioisótopo se requerirá iMDK para identificar moléculas o factores que se asocian directamente con iMDK, lo que conducirá a la comprensión del mecanismo (s) por el cual iMDK inhibe la expresión de MDK.
en resumen, hemos determinado que el inhibidor iMDK MDK suprime el cáncer de pulmón de células no pequeñas que expresa MDK
in vitro
y
in vivo
sin dañar las células normales. Aunque se necesitan más estudios, incluyendo la identificación de objetivos directos iMDK, modificación estructural adicional y validación de seguridad, iMDK parece ser un tratamiento prometedor para
KRAS
adenocarcinoma pulmonar y mutante carcinoma de células escamosas y, posiblemente, para el tratamiento de otros tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias crónicas.
Apoyo a la Información
Figura S1. la inhibición del crecimiento por
iMDK se incrementó en las células que expresan MDK. iMDK inhibición del crecimiento inducida en células de carcinoma de pulmón H441 MDK-positivas y células de riñón embrionario HEK293 pero no en células de carcinoma de pulmón A549 MDK-negativos.