Extracto
Antecedentes
Las toxicidades dependientes de la dosis de doxorrubicina (DOX) limitan sus aplicaciones clínicas, particularmente en cánceres resistentes a los medicamentos, como el cáncer de hígado. En este estudio, hemos investigado el papel de la quercetina sobre los efectos antitumorales de DOX en las células de cáncer de hígado y su capacidad para proporcionar protección contra el daño hepático mediado por DOX en ratones.
Metodología y Resultados
El ensayo de tinción con MTT y Anexina V /PI demostrado que la quercetina sensibiliza selectivamente la citotoxicidad inducida por DOX contra las células de cáncer de hígado, mientras que la protección de las células normales del hígado. El aumento en la apoptosis mediada por DOX en células de hepatoma por quercetina fue dependiente de p53 y la regulación negativa de la expresión producido por Bcl-XL. Z-VAD-fmk (inhibidor de caspasa), pifithrin-α (inhibidor de la p53), o sobreexpresa Bcl-xl disminuyeron los efectos de la quercetina en la apoptosis mediada por DOX. El tratamiento combinado de la quercetina y la DOX redujo significativamente el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de hígado en ratones. Por otra parte, la quercetina redujo los niveles séricos de alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa que se incrementaron en los ratones tratados con DOX. La quercetina también revirtió los cambios patológicos inducidos por DOX en ratones hígados.
Conclusión y significado
Estos resultados indican que la quercetina potenció los efectos antitumorales de DOX en las células de cáncer de hígado al tiempo que protege las células normales del hígado. Por lo tanto, el desarrollo de la quercetina puede ser beneficioso en un tratamiento combinado con DOX para aumentar la eficacia terapéutica contra el cáncer de hígado
Visto:. Wang G, Zhang J, Liu L, Sharma S, Dong Q (2012) Quercetina potencia la doxorrubicina efectos antitumorales mediadas contra el cáncer de hígado a través de p53 /Bcl-XL. PLoS ONE 7 (12): e51764. doi: 10.1371 /journal.pone.0051764
Editor: B. Ashraf Abdel-Naim, Universidad de Ain Shams, Egipto
Recibido: 25 Julio, 2012; Aceptado: 7 de noviembre de 2012; Publicado: Diciembre 11, 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No .: 30400521), el Departamento de Tecnología de la Ciencia de la provincia de Zhejiang (No .: 2012R10047 de QD y No .: 2012C33116 a GW) y el Departamento de Educación de la provincia de Zhejiang (No .: Y201224108). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los tipos más comunes de cáncer de hígado y la cuarta causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. La falta de biomarcadores que detectan etapa temprana quirúrgicamente resecable de una enfermedad ha causado la manifestación de etapas avanzadas en la mayoría de los pacientes cuando la resección quirúrgica ya no es factible [2]. Por lo tanto, la quimioterapia sigue siendo la opción viable para el tratamiento de pacientes con HCC inoperable.
A través de los años, la doxorrubicina (DOX) se ha convertido en un agente utilizado de forma rutinaria y ampliamente en el tratamiento de HCC. Sin embargo, los estudios han demostrado que algunas células de cáncer, incluyendo el hepatoma, son resistentes a los efectos apoptóticos de DOX [3]. Además, la quimioterapia basada en DOX se asocia con efectos secundarios graves a los tejidos no tumorales, tales como el corazón, el hígado y el riñón, lo que limita en gran medida sus aplicaciones clínicas [4], [5]. Benjamin describe ocho pacientes con insuficiencia hepática que desarrollaron pancitopenia grave y mucositis mientras recibe DOX, lo que llevó a expertos para reducir la dosis a causa de la función hepática alterada [6]. Por lo tanto, se necesitan mejores regímenes terapéuticos que potencian los efectos de DOX, que permiten la reducción de la dosis y la protección de los tejidos no tumorales, para mejorar el tratamiento de pacientes con cáncer de hígado.
Los mecanismos de la citotoxicidad mediada por DOX en las células cancerosas y tejidos normales son diferentes [7]. toxicidad DOX en células de cáncer se produce principalmente a través de la intercalación de ADN y el daño [8], mientras que DOX inducida por cardiotoxicidad o hepatotoxicidad se produce principalmente por la generación de radicales libres de oxígeno, que es inhibida por eliminadores de radicales libres [9]. Esta diferencia en la toxicidad mediada por DOX en las células cancerosas y normales se puede investigar para mejorar los efectos antitumorales de DOX con enfoques combinatorios que permiten la reducción de la dosis de DOX la vez que protege las células normales.
quercetina (3, 3 ', 4 ', 5, 7-pentahidroxiflavona), un importante flavonoide presente en la dieta en varias frutas y verduras, antioxidante exposiciones, anti-inflamatorias y propiedades contra el cáncer [10]. La quercetina ha recibido una creciente atención como un flavonoide pro-apoptótica con la actividad específica y casi exclusiva en las células tumorales en lugar de las células normales, no transformadas [11], [12]. Sin embargo, los mecanismos por los que la quercetina ejerce sus actividades anti-proliferativos y apoptóticos siguen sin estar claros. Varios
in vitro Opiniones y en
in vivo
estudios han evaluado la quercetina combinada con DOX para el cáncer de mama y los tratamientos de leucemia, revelando efectos sinérgicos [13] - [15]. En modelos murinos de cáncer de mama, una combinación de la quercetina en la dieta y la inyección intratumoral de DOX reduce el volumen del tumor y la diseminación metastásica [13]. A pesar de que la quercetina revierte la resistencia a múltiples inducida por DOX en las células de leucemia mielógena humanos [14], [16], no se han reportado estudios sobre la eficacia de la quercetina con DOX contra el cáncer de hígado todavía
.
Los antioxidantes tienen efectos beneficiosos contra DOX toxicidad inducida en ratones y ratas [17]. La quercetina tiene un efecto protector contra la cardiotoxicidad inducida por DOX en ratones, pero los mecanismos siguen sin estar claros [18]. La quercetina también presenta un efecto protector frente a la AFB1 mediada por daño hepático
in vivo fotos: por la promoción de sistemas de defensa antioxidante y la inhibición de la peroxidación de lípidos [19]. Además, la quercetina reduce el contenido de citocromo P450 hepático y aumenta la actividad hepática de glutatión S-transferasa (GST) que participan en la activación /desintoxicación de químicos mutágenos /carcinógenos [20] - [22]. Estos hallazgos sugieren que la quercetina puede proporcionar protección contra el daño hepático mediado por DOX.
El presente estudio tiene como objetivo evaluar los efectos de la combinación de agente quimioterapéutico DOX con la quercetina compuesto natural sobre el cáncer de hígado humano y las células normales. También se examinó la función potencial de la quercetina como un agente protector del hígado durante el tratamiento DOX en ratones.
Nuestros resultados demuestran que la apoptosis mediada por DOX-quercetina-mejorada en células de hepatoma es dependiente de p53 y se produce mediante la regulación negativa Bcl SG. Por otra parte, la quercetina presenta un efecto protector frente a la hepatotoxicidad inducida por DOX en ratones.
Resultados
La quercetina potencia selectivamente la DOX citotoxicidad en células de cáncer de hígado, pero no en las células normales del hígado
Cultures fueron expuestos a la quercetina a las dosis de 0 M a 150 mM para determinar los efectos de la quercetina en las células de cáncer de hígado y las células normales. Dimetilsulfóxido (DMSO; 0,1%) se utilizó como control negativo. Después de 48 h, una reducción dependiente de la dosis en la viabilidad de las células cancerosas (IC
50 células SMMC7721 valor = 133 micras y QGY7701 células = 142 M) se observó (Fig. 1A). La quercetina no afectó el crecimiento normal de las células del hígado (L02), incluso a altas concentraciones (& gt; 100 mM). Teniendo en cuenta que el 12 M de concentración sérica quercetina no indujo efectos secundarios asociados a los seres humanos y su citotoxicidad en varias líneas celulares de cáncer [23], [24], se seleccionaron 20 M de quercetina para los estudios de combinación de fármacos. La quercetina (20 M) aumentó la muerte celular del cáncer de hígado inducida por DOX y redujo la IC
50 valor de DOX contra las células de hepatoma SMMC7721 (5,1 M a 2,2 M; Fig. 1B) y QGY7701 células (6,2 M a 2,7 M; Fig . 1C). Por el contrario, el pretratamiento con 20 mM de quercetina redujo la citotoxicidad mediada por DOX en hígado normal L02 células (Fig. 1D). En el plasma humano, el pico y la concentración en estado estacionario de DOX son 5 micras y 25 nM a 500 nM, respectivamente [25]; por lo tanto, se seleccionaron 1 M de DOX para los estudios de combinación de fármacos para representar los niveles plasmáticos relevantes en los pacientes tratados con DOX. Anexina V tinción /PI se realizó para investigar si o no DOX-indujo la muerte celular en células de hepatoma se produce a través de apoptosis. tratamiento DOX (1 M) indujo apoptosis en el 13% de las células SMMC7721; la co-tratamiento con quercetina aumentó el porcentaje de células apoptóticas a 42% (Fig. 1E). El porcentaje de apoptosis inducida por DOX solo o co-tratamiento con quercetina en las células L02 fueron aproximadamente 22% y 18%, respectivamente, lo que sugiere que la quercetina no sensibilizar a las células normales del hígado a la apoptosis inducida por DOX. Resultados similares se confirmaron mediante tinción con Hoechst (datos no mostrados). Estos resultados sugieren un efecto de potenciación preferencial de la quercetina en la citotoxicidad mediada por DOX en células de cáncer de hígado, pero no en las células normales del hígado.
(A) Efecto de la quercetina en la proliferación de SMMC7721 y QGY7701 células de cáncer de hígado, y células normales del hígado L02. Las células se incubaron con quercetina (0 M a 150 mM) durante 48 h y se sometieron a un ensayo MTT para determinar la tasa de proliferación. (B) La quercetina sensibilizado SMMC7721 células de DOX. (C) La quercetina sensibilizado QGY7701 células para DOX. (D) La quercetina redujo parcialmente la inhibición del crecimiento inducida por DOX en L02 células. Las células se incubaron con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) (B, C, y D) durante 24 h, y después se sometieron a un ensayo MTT. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes. las células (E) SMMC7721 y L02 se incubaron con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 h, y después se analizaron por citometría de flujo utilizando anexina V /PI tinción para discriminar las células vivas (anexina V- /PI -), las células temprana de apoptosis (anexina V + /PI-), necrosis o células apoptóticas tardías (anexina V + /PI +), y las células muertas (anexina V- /PI +). *
P Hotel & lt; 0,05 vs células co-tratados con quercetina
La quercetina aumenta la activación de caspasas inducida por DOX en células de cáncer de hígado
La activación de caspasas tiene una. función importante tanto en las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos. Por lo tanto, también se examinó el efecto de la quercetina sobre los cambios inducidos por DOX en las caspasas. La quercetina no activar directamente las caspasas, pero mejoró fuertemente la inducida por DOX activación de la caspasa-9, caspasa-8 no activación, en SMMC7721 células (Fig. 2A). Activado caspasa-3, el principal efector de las caspasas, y PARP, el sustrato principal de las caspasas, también se evaluaron. La quercetina solo no indujo ninguna escisión de la caspasa-3 en células SMMC7721; DOX indujo una formación de escisión de 20 kDa. Sin embargo, el co-tratamiento de la quercetina y DOX induce la escisión de procaspasa-3 en un p20 intermedia, que posteriormente se escinde a la subunidad p17 activa. Más proteínas PARP se escindieron en 85 formas kDa después del tratamiento de combinación se administra en comparación con el tratamiento con DOX sola. Se observaron patrones de activación similares de caspasas y la escisión de PARP en células QGY7701 (datos no mostrados). El ensayo de actividad de caspasa-3 confirmó que la quercetina aumentó significativamente la actividad inducida por DOX caspasa-3 en SMMC7721 células (Fig. 2B). Los efectos de la de amplio espectro inhibidor de caspasa Z-VAD-fmk sobre la apoptosis de células de cáncer de hígado se determinaron mediante tinción con PI para confirmar que la acción de la quercetina en DOX era caspasa dependiente. La acumulación co-inducida por el tratamiento de poblaciones de células fase sub-G1 en QGY7701 células se redujo significativamente (26% a 7%) por el tratamiento previo con Z-VAD-fmk (Fig. 2C). La población de células fase sub-G1 en SMMC7721 células también se redujo de 39% a 8% (datos no mostrados). Estos resultados indican que la quercetina potenció la apoptosis inducida por DOX en células de cáncer de hígado mediante la activación de caspasas-9 y -3 de la vía intrínseca.
(A) caspasas-3 troceados, -8, -9 y expresión y PARP se evaluaron por transferencia de Western en SMMC7721 células tratadas con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 horas. β-actina se utilizó como control interno. (B) de la caspasa-3 ensayo de actividad de DOX- (1 M) y /o quercetin- (20 M) tratada SMMC7721 células durante 24 h. Los lisados celulares se incubaron con sustrato fluorogénico de caspasa-3 por 1 h a 37 ° C. Actividad de la caspasa-3 se normalizó a la proteína de lisado de células y se expresa como la activación de veces en comparación con el control. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células tratadas con DOX. (C) inhibidor de caspasa Z-VAD-fmk redujo el efecto de la quercetina en la apoptosis inducida por DOX en QGY7701 células examinadas mediante tinción con PI. Control: 0,5% de sulfóxido de dimetilo; quercetina: 20 M; DOX: 1 M; DOX + quercetina: DOX 1 M, más quercetina 20 M; DOX + quercetina Z-VAD-fmk +: células se trataron previamente con 25 mM de z-VAD-fmk durante 1,5 h y se trataron adicionalmente con DOX más quercetina para 24 h. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células tratadas con DOX. **
P
. & Lt; 0,01 frente a células tratadas quercetina + DOX-
La quercetina potencia la apoptosis inducida por DOX en células de cáncer de hígado a través de Bcl-XL vía mitocondrial /mediada por Bax
los experimentos se llevaron a cabo utilizando JC-1 para investigar la posible participación de alteración de la membrana mitocondrial. Las medidas cuantitativas muestran que SMMC7721 células tratadas con quercetina solo no mostraron ningún cambio en comparación con el control. tratamiento DOX indujo una reducción moderada de la fluorescencia roja, lo que indica una disminución en el potencial de membrana mitocondrial, mientras que el co-tratamiento de la quercetina y DOX indujo un marcado, reducción significativa (Figs. 3A y B). De acuerdo con la pérdida de la membrana mitocondrial, el co-tratamiento de las células con SMMC7721 quercetina y DOX liberó más citocromo
c
de la mitocondria al citosol en comparación con el de tratamiento DOX sola (Fig. 3C).
(a, B) Efecto de DOX y /o quercetina sobre el potencial de membrana mitocondrial en desglose SMMC7721 células tratadas con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 h. JC-1 se observa como monómeros fluorescentes verdes en el citosol o como agregados fluorescentes rojas en mitocondrias intactas. La reducción de la intensidad de fluorescencia roja indica desglose mitocondrial con el potencial de la membrana intacta. *
P Hotel & lt; 0,01 frente a células tratadas con DOX. (C) Análisis de transferencia Western de la expresión total de la subasta, Bcl-2, Bcl-XL y, así como la distribución mitocondrial de Bax y la distribución citosol de citocromo
c
en SMMC7721 células tratadas con DOX ( 1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 h. β-actina se utilizó como control interno para la proteína total y proteínas citosol. Hsp60 se utilizó como un control interno para la proteína mitocondrial. (D) Análisis de transferencia Western de la distribución mitocondrial de Bax y la expresión total de Bcl-XL en SMMC7721 células transfectadas con vector de expresión de Bcl-XL y tratados con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 h. (E) Efecto de DOX y /o quercetina sobre la apoptosis de las células SMMC7721 /Bcl-XL y SMMC7721 /neo ensayadas mediante tinción con PI después de DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) se administró durante 24 h. *
P Hotel & lt; 0,01, SMMC7721 /Neo vs células /Bcl-XL SMMC7721. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes.
Hemos examinado familia Bcl-2 nivel de expresión de proteínas para investigar las posibles dianas moleculares aguas arriba de la caspasa-9 vías. Bcl-2 nivel de expresión no cambió después se llevaron a cabo diversos tratamientos. El co-tratamiento de DOX y la quercetina no afectó a la disminución inducida por DOX en el nivel de expresión de la subasta. Sorprendentemente, el co-tratamiento provocó una fuerte reducción en la expresión de Bcl-XL, mientras que DOX o tratamiento quercetina solo no afectó la expresión de Bcl-XL (Fig. 3C). Por consiguiente, el co-tratamiento de las células con SMMC7721 quercetina y DOX aumentó en gran medida Bax translocación desde el citosol a la mitocondria en comparación con el tratamiento con DOX sola, que sólo causó un aumento moderado de Bax translocación.
SMMC7721 células fueron transducidas de forma estable usando el vector de expresión de Bcl-XL para confirmar la función importante de la proteína Bcl-XL en los efectos de la quercetina en la apoptosis inducida por DOX. La sobreexpresión de Bcl-XL en SMMC7721 células inhibió significativamente Bax translocación a la mitocondria que fue inducida por el co-tratamiento de DOX y la quercetina (Fig. 3D), y redujo el efecto de potenciación de la quercetina en la apoptosis inducida por DOX (Fig. 3E ). Estos resultados sugieren que la quercetina potencia la apoptosis en células de hepatoma DOX-inducida a través de la vía mitocondrial por la regulación negativa de la proteína Bcl-XL y, posteriormente, el aumento de Bax translocación a la mitocondria.
mejora quercetina de la apoptosis inducida por DOX en células de cáncer de hígado es dependiente de p53
Activado promoción mediada por p53 de la apoptosis en las células tumorales es un mecanismo importante de fármacos antitumorales, tales como DOX [26]. Por lo tanto, se investigó si la proteína p53 está implicado en el efecto de potenciación de la quercetina en la apoptosis inducida por DOX en células de cáncer de hígado. No se observó expresión de la proteína p53 detectable en las células tratadas con quercetina control o, mientras que el co-tratamiento de la quercetina y DOX aumentó significativamente el nivel de expresión de la proteína p53 inducida por DOX en SMMC7721 células (Fig. 4A). p53 upregulated modulador de la apoptosis (PUMA), un BH3-only pro-apoptótica de proteínas, es un objetivo directo transcripcional de p53. La quercetina aumentó posteriormente los inducidos por DOX niveles de expresión de PUMA. células SMMC7721 fueron transfectadas transitoriamente con el plásmido p53-luciferasa y expuestas a diferentes tratamientos para aclarar la función de p53 en el efecto de potenciación de la quercetina en la apoptosis inducida por DOX. La quercetina sola no mejoró la actividad de p53. Por el contrario, el tratamiento combinado con DOX y el tratamiento DOX sola aumentó significativamente la actividad de p53 por 15 y 6 veces, respectivamente, en comparación con el grupo control. Por otra parte, pifithrin-α, un inhibidor de p53 específico, no afectó a la supervivencia celular, pero la actividad inhibió significativamente p53 (2,4 veces), que se ve reforzada por la quercetina combinada y tratamiento DOX (Fig. 4B), y redujo el efecto de potenciación de quercetina sobre la apoptosis inducida por DOX (Fig. 4C). Estos resultados sugieren que la actividad de p53 mejorada es necesaria para estimular el efecto de potenciación de la quercetina sobre la apoptosis inducida por DOX.
p53 y PUMA expresiones (A) se evaluaron por Western blot en SMMC7721 células tratadas con DOX (1 M ) y /o quercetina (20 M) durante 24 h. β-actina se utilizó como control interno. (B) El ensayo de luciferasa de DOX- y la activación de p53 inducida por la quercetina. SMMC7721 células se pretrataron durante 1 hora con 2 mM de pifithrin-α, y luego tratados con DOX (1 M) o la quercetina (20 M) durante 12 h. la actividad de p53 se determinó mediante el ensayo de actividad de luciferasa. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,01 frente a células tratadas con DOX. **
P Hotel & lt; 0,001 frente a células tratadas con quercetina + DOX. SMMC7721 células (C) se trataron previamente con 2 M de pfithrin-α durante 1 h, y luego tratados con DOX (1 M) y /o quercetina (20 M) durante 24 h. las tasas de apoptosis se analizaron por tinción con Anexina V /PI. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,001 frente a células tratadas con DOX. **
P Hotel & lt; 0,01 frente a células tratadas con DOX. ***
P
. & Lt; 0,001 frente a células tratadas quercetina + DOX-
La quercetina aumenta inducida por la inhibición del crecimiento de DOX de SMMC7721 xenoinjertos en ratones
La efectos de la quercetina sobre DOX en nuestro modelo de cultivo celular
in vitro
fueron validados en este estudio. Por lo tanto, se evaluó si la quercetina puede potenciar el efecto antitumoral de DOX en xenoinjertos de tumores en ratones desnudos SMMC7721. SMMC7721 suspensiones de células individuales se inyectaron s.c. en los flancos de seis semanas de edad, los ratones inmunodeficientes, los ratones se dividieron en cuatro grupos de 10 días después de la inoculación del tumor cuando los tumores eran palpables: 1) grupo control de solución salina normal (i.p., 3 × /semana); 2) la quercetina (100 mg /kg, i.p., 3 × /semana); 3) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 × /semana); y 4) DOX (4 mg /kg, i.p., 1 × /sem) más quercetina (100 mg /kg, i.p., 3 × /semana). Para el grupo de DOX, se administraron tratamientos hasta /se alcanzó una dosis acumulativa de 12 mg kg. La quercetina solo no inhibió el crecimiento del tumor; en cambio, la quercetina promovido el crecimiento del tumor durante los primeros 14 días, y luego se ralentizó el crecimiento del tumor durante los siguientes 7 días en comparación con el grupo control. Al final del experimento, el volumen medio del tumor del tratamiento quercetina fue 531,3 mm
3, similar a la del grupo de control. tratamiento DOX redujo significativamente los volúmenes de los tumores (334,7 mm
3) en comparación con el grupo control. Una disminución significativa en el volumen tumoral de los xenoinjertos de co-tratado se observa desde el cuarto día de post-tratamiento hasta el final del experimento (Fig. 5A). Después se administró co-tratamiento, los tumores crecieron a una tasa reducida con el inicio y los volúmenes tumorales promedio final de 76.5 y 118.1 mm
3, respectivamente.
SMMC7721 tumores derivados de células se desarrollaron en ratones desnudos y se trató con solución salina, la quercetina, DOX, y DOX + quercetina. (A) El crecimiento del tumor se monitorizó midiendo el volumen del tumor durante tres semanas. (
n
= 5 ratones por grupo). *
P Hotel & lt; 0,01 frente a la quercetina grupos tratados y de control. **
P
& lt; 0,01 vs. grupo tratado con DOX. (B) Al final de tres semanas, se recogieron y se pesaron los tumores. DOX reduce el tamaño del tumor en comparación con los grupos tratados con quercetina control y (*
P & lt; 0,05
). Co-tratamiento redujo significativamente el tamaño del tumor en comparación con otros grupos de tratamiento (**
P & lt; 0,001)
. (C) Las muestras tumorales fueron sometidas a tinción con hematoxilina y eosina y el análisis inmunohistoquímico usando Ki67, Bcl-XL, y los anticuerpos de p53. tumores co-tratados mostraron una reducción significativa de Ki67 y Bcl-xl expresión, así como un aumento en la expresión de p53 en comparación con otros tumores tratados (
P
& lt; 0,05).
el peso medio de los tumores en el grupo control alcanzó 163 mg, mientras que el grupo tratado quercetina-provocó ningún efecto sobre el crecimiento tumoral SMMC7721. DOX tratamiento resultó en la inhibición del crecimiento del tumor de aproximadamente 50% en comparación con el grupo control; el peso medio de los tumores se redujo a 87 mg. El co-tratamiento de DOX y la quercetina provocó la inhibición del crecimiento tumoral más eficaz y resultó en un peso medio del tumor de 20 mg (Fig. 5B). Los datos indicaron que la quercetina aumenta la actividad antitumoral de DOX
in vivo
.
Histológicamente, los tumores eran considerablemente menos celular y compuestos principalmente de material acelular en los xenoinjertos co-tratado. Por el contrario, las células tumorales de los ratones que recibieron el tratamiento de control del vehículo y la quercetina fueron dispuestos como nidos separadas por haces de matriz extracelular (Fig. 5C). Se encontró un bajo número de tumores en los ratones tratados con DOX. secciones de tumores de ratones desnudos se evaluaron para la expresión de Ki67 para investigar el efecto del tratamiento combinado sobre la proliferación de células tumorales (Fig. 5C). Después de tres semanas de tratamiento, 24%, 62%, 91% y 92% de las células tumorales Ki67 + se encontraron en el co-, DOX-, y el control del vehículo o los ratones tratados con quercetina, respectivamente. Los análisis inmunohistoquímicos adicionales se realizaron para confirmar el
in vitro
descubrimientos sobre los mecanismos por los que la quercetina exhibe efecto de potenciación con DOX
in vivo
. Quercetina y co-DOX tratado tumores p53 exhibitd aumentaron los niveles y disminuyeron los niveles de Bcl-XL en comparación con el grupo control (Fig. 5C), consistente con nuestros
in vitro
hallazgos.
La quercetina atenúa DOX hepatotoxicidad inducida por
in vivo
Teniendo en cuenta nuestros
in vitro
observaciones en que la quercetina puede disminuir DOX citotoxicidad en las células hepáticas normales (Fig. 1D), que investigarse más a su efecto sobre la hepatotoxicidad inducida por DOX
in vivo
. Ratones C57BL /6 fueron tratados con DOX a 20 mg /kg (i.p.), una dosis que causa la toxicidad aguda [27]. La hepatotoxicidad aguda de DOX se reveló claramente por el aumento de los marcadores bioquímicos en suero, especialmente la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST). tratamiento DOX resultó en un incremento significativo de 765% y 378% en ALT y AST, respectivamente, en comparación con el grupo control (Tabla 1). la suplementación de quercetina sola no mostró cambios significativos en los marcadores bioquímicos. Por el contrario, el co-tratamiento de DOX y la quercetina como resultado una reversión parcial del aumento de suero inducida por DOX en ALT y AST (
p Hotel & lt; 0,05).
El examen microscópico puesto de manifiesto que los tejidos hepáticos de control y la quercetina tratados tienen grandes células poligonales normales con núcleos prominentes redondas y citoplasma eosinófilo, así como unos pocos sinusoides hepáticos espaciadas dispuestas en-entre las cuerdas hepáticas (Fig. 6A). Por el contrario, los ratones que recibieron 20 mg /kg de DOX mostraron hepatotoxicidad masiva, con la disolución de cables hepáticas implicadas, que apareció vacuolas como vacíos alineados por los filamentos de hepatocitos necróticas y células de Kupffer proliferaron de una manera difusa entre el graso degeneró hepatocitos. evidencia histopatológico reveló que el daño hepático después del tratamiento DOX se redujo significativamente en co-tratamiento con quercetina.
(A) ratones C57BL /6 fueron tratados con quercetina (100 mg /kg /día, po) cuatro días antes de la ip administración de DOX (20 mg /kg). Los hígados se retiraron cinco días después del tratamiento DOX, y las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E; magnificación 200 x). tumores derivados de células (B) SMMC7721 se desarrollaron en ratones desnudos y se trataron con solución salina, la quercetina, DOX, y DOX + quercetina. Al final de tres semanas, se recogieron los hígados y se tiñeron con H & amp; E. (C) Un modelo del efecto de quercetion en DOX en las células hepáticas. En este modelo, la quercetina aumenta la expresión de p53 inducida por DOX en células de cáncer de hígado y reduce la expresión de Bcl-XL, aumentando de este modo la caspasa -3 /-9 actividad y potenciar la muerte celular inducida por DOX en células de cáncer de hígado. La quercetina disminuye el estrés oxidativo inducido por DOX y aumenta la supervivencia celular en las células normales del hígado.
Se investigaron los daños hepáticos inducidos subcrónica-DOX en ratones utilizando SMMC7721 xenoinjertos. El grupo tratado con DOX recibió DOX una vez a la semana (4 mg /kg, i.p.) hasta una dosis acumulada de 12 mg /kg se alcanzó. El tejido hepático del grupo tratado con DOX mostró cambios patológicos similares a los de aguda 6 ratones tratados con DOX C57BL /(Fig. 6B). La quercetina invierte el daño hepático inducido por DOX en ratones desnudos con xenoinjertos de tumores SMMC7721.
Discusión
Aunque DOX es una droga anticáncer potentes, su uso clínico está limitado por su toxicidad para los tejidos normales, tales como el corazón y el hígado. Otra limitación de su eficacia es el desarrollo de resistencia a múltiples fármacos por las células cancerosas. Algunos flavonoides presentan un aumento de los efectos anti-tumorales con agentes quimioterapéuticos, tales como la quercetina [28]. En
modelos vitro
y el cáncer de mama en animales, quercetina mejora el índice terapéutico de DOX en células de cáncer de mama al interferir con el metabolismo celular, la actividad GST, y el citoesqueleto. Por el contrario, la quercetina reduce DOX citotoxicidad en células mamarias no tumorales [13] - [15]. Aunque el co-tratamiento de la quercetina y DOX puede desarrollarse a una nueva combinación de quimioterapia para el tratamiento del cáncer de mama, ya sea o no la quercetina provoca el mismo efecto en DOX en otros tipos de cánceres, en el que se utiliza DOX como tratamiento de primera línea, tales como el cáncer de hígado, sigue siendo desconocido. El presente estudio investigó la eficacia de quercetina con DOX en células de cáncer de hígado y su efecto protector contra la hepatotoxicidad inducida por DOX en ratones.
Varios estudios han demostrado que el IC
50 para la quercetina en diversos tumores varía desde 7 nM a & gt; 100 mM. En contraste con otros tipos de células de cáncer humano, la quercetina presenta anti-proliferativa y efectos pro-apoptóticos a bajas concentraciones [23], tal como 21 mM de MDA-MB-468 células de cáncer de mama humanos [24]. Varios informes y nuestros resultados demostraron que las células de hepatoma humano se consideran resistentes a la quercetina porque el IC
50 valor es & gt; 100 mM. células de hepatoma humano son también resistentes a la DOX (IC
50 valor & gt; 5 M) y el pico de la concentración de DOX en el plasma humano es 5 mM. Nuestros resultados también revelaron que el co-tratamiento de la quercetina (20 M) y DOX (1 M) potencia de forma significativa los efectos antitumorales de DOX en células de cáncer de hígado humano. Las células cancerosas presentan su resistencia a los agentes quimioterapéuticos por la expulsión de los intracelulares fármacos contra el cáncer fuera de las células a través de P-gp y otras bombas de infusión. La quercetina puede inhibir la actividad de la bomba de eflujo de P-gp dependiente de la dosis e inducir la apoptosis en células de leucemia y cáncer de mama mieloides humanos resistentes [29] - [31]; Por lo tanto, la apoptosis inducida por DOX facilitado tal vez el resultado de la inhibición de P-gp quercetina inducida, seguido por un aumento de intracelular DOX, y una apoptosis en consecuencia, mejorada [32]. Sin embargo, las dosis bajas de DOX pueden aumentar ligeramente mRNA MDR1, pero no expresión de la proteína [33]. Para MRP1, no mRNA MRP1 detectable en las células SMMC7721 tratados con DOX se encontró [34]. Con las tecnologías microscópicas confocales, se observó que la distribución intracelular de DOX en estas células de hepatoma no fue afectada por la quercetina (datos no mostrados). Por lo tanto, la quercetina probable potencia la apoptosis inducida por DOX, pero no a través de su acción sobre la retención de fármaco y de flujo de salida. Se necesitan más estudios para determinar si es o no la quercetina sensibiliza a las células de cáncer de hígado DOX resistentes al afectar la expresión de genes relacionados con la MDR-
apoptosis inducida por DOX se asocia con dos vías de la apoptosis distintas:. la vía del receptor de muerte mediante la activación de la caspasa -8 y la vía mitocondrial mediante la activación de la caspasa-9 [35]. La vía mitocondrial es el principal mecanismo de la apoptosis inducida por DOX [36], en el que el proceso central consiste en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa con la liberación subsiguiente de varios factores pro-apoptóticos en el citosol [37]. Citocromo
c
, uno de los factores pro-apoptóticos, TARJETA Apaf-1, y pro-caspasa-9 adaptador de proteínas en el citosol ensamblar para formar el apoptosome. Pro-caspasa-9 es entonces autoproteolytically procesada y desencadena la activación de las caspasas efectoras, lo que conduce a la escisión de varios sustratos. Encontramos que la quercetina aumentó significativamente la pérdida inducida por DOX del potencial de membrana mitocondrial, lo que indica el aumento de la degradación mitocondrial. Sustancialmente mejorada liberación de citocromo
c
y la escisión de pro-caspasa-9, posteriormente, se produjo, lo que lleva al aumento de la actividad de caspasa-3 y la degradación de PARP. Z-VAD-FMK bloqueó la apoptosis inducida por DOX quercetina-mejorada, lo que sugiere que la quercetina sensibiliza a la apoptosis inducida por DOX en células de cáncer de hígado, principalmente a través de la vía mitocondrial.
Numerosos informes indican que la proteína supresor de tumores p53 regula las mitocondrias -dirigida la apoptosis [38]. p53, como un factor de transcripción, puede estimular la expresión de los genes diana pro-apoptóticos, tales como PUMA, Bax, Bid y [39]. Por otra parte, p53 puede ejercer una función pro-apoptótica directo en la mitocondria, activando de este modo la vía apoptótica mitocondrial, que se recientemente conocida como la circuitería de la muerte p53 señalización [40].