Extracto
El tratamiento sistémico de los pacientes con cáncer en estadio temprano intenta erradicar la enfermedad metastásica oculta para evitar la recurrencia y aumento de la morbilidad. Sin embargo, la predicción de la recurrencia de un análisis del tumor primario está limitada porque las células cancerosas diseminadas representan sólo un pequeño subconjunto de la lesión primaria. Aquí se analiza la expresión de microRNAs (MIR) en el suero obtenidas pre-quirúrgicamente de pacientes con cáncer colorrectal en etapa temprana de circulación. Se utilizaron grupos de cinco pacientes con y sin recidiva de la enfermedad para identificar un panel informativo de hacer circular miRs mediante PCR cuantitativa de la expresión de miR en todo el genoma, así como un conjunto de candidatos miRs publicados. Un panel de seis miRs informativos (miR-15a, miR-103, miR-148a, miR-320a, miR-451, miR-596) se deriva de este análisis y evaluado en un conjunto de validación independiente de los treinta pacientes. La agrupación jerárquica de los niveles de expresión de estos seis miRs circulantes y análisis de Kaplan-Meier mostró que el riesgo de recurrencia de la enfermedad del cáncer en estadio temprano de colon se puede predecir por este panel de MIR que se pueden medir en la circulación en el momento del diagnóstico (p = . 0,0026; Índice de riesgo de 5,4; IC del 95%: 1,9 a 15)
Visto: Shivapurkar N, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays A, Juhl H, et al. (2014) La recurrencia de cáncer de colon en estadio temprano predicho por patrón de expresión de microRNAs circulante. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10.1371 /journal.pone.0084686
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2013; Aceptado: 18 Noviembre 2013; Publicado: 6 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shivapurkar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por subvenciones NIH CA108440 (AW), P30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), el Centro de cáncer Lombardi (NS) y el Centro de Ruesch (NS, JLM, SM, y AW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Uno de los autores (Dr. Juhl) se affiliatiated Indivumed, GmbH. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales y no proporciona un conflicto de intereses.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer líder causa de mortalidad por cáncer que afecta a hombres y mujeres por igual. En todo el mundo se da cuenta de aproximadamente un millón de nuevos casos de cáncer y de medio millón de muertes que representan el 10 por ciento de las muertes por cáncer [1]. Los resultados para los pacientes con estadio temprano CRC son heterogéneos, con tasas de supervivencia a 5 años específicos de la enfermedad para los pacientes en estadio II del 72-88% y 40-71% para la fase III [2]. La mayoría de los pacientes con enfermedad en estadio II se curan mediante cirugía sola, mientras que la quimioterapia adicional puede proporcionar beneficios de supervivencia para los pacientes con enfermedad en estadio posterior. Aún así, aproximadamente 1 de cada 4 pacientes con enfermedad en estadio temprano sufrirán de recurrencia y biomarcadores que identifican a los pacientes con alto riesgo en el momento del diagnóstico y la cirugía inicial permitiría seleccionar aquellos pacientes para un seguimiento más estrecho y tratamientos posiblemente sistémicos ([3], [ ,,,0],4], [5];. revisado recientemente en [6])
microRNAs (miRNAs o MIR) son pequeños ARN no codificantes, que juegan un papel importante en el control de las actividades de las vías celulares tanto en la fisiología y patología (ver por ejemplo [7]). La función distinta de miRs en diferentes tipos de cáncer se ha vuelto más evidente en los últimos años [8], [9], y muchos estudios muestran que las firmas de miR se pueden utilizar para distinguir diferentes tipos de cáncer [10], [11], [12], [13], el pronóstico [14], [15], revelan posibles objetivos [16], alterado vías de señalización [17], o la progresión maligna del carcinoma in situ de la enfermedad invasiva [18]. Lo más sorprendente, una comparación de perfiles de MIR y de mRNA de lesiones de cáncer primarios y metastásicos mostró que miRs proporcionan una firma más fiable y distintivo de mRNAs y se encontró que las firmas de miR eran superiores a los ARNm en la identificación de la fuente de órgano de metástasis de origen desconocido [19] , [20]. Un estudio anterior [21] el uso de perfiles de expresión de 315 MIR en los tejidos de la etapa II de cáncer de colon mostró diferencias en las pautas de la enfermedad recurrente. Los niveles de expresión de miRs específicos en los tejidos correlacionados con la probabilidad de supervivencia libre de recurrencia en el análisis multivariante. Estos resultados sugieren que perturbaban expresión de miRs en el cáncer de colon puede tener un potencial pronóstico.
Más allá de estos análisis de tejidos normales y enfermos, los informes más recientes han demostrado que las especies de miR pueden ser detectados en la circulación [22] y incluso sugiere que el análisis de muestras de suero para miRs definidos podría ser utilizado para identificar a los pacientes con cáncer [23], [24], [25], [26]. Los estudios de la miRome transmitida por la sangre también mostraron aplicabilidad a las enfermedades distintas del cáncer ([27]; revisado en [28], [29]). miRs en la circulación parecen ser notablemente estable [30], [31] y se sugirió que la estabilidad es atribuible a miRs ser incluido en vesículas de lipoproteínas, conocidas como exosomas [32]. Aquí, hemos realizado un estudio MIR en muestras de sangre obtenidas de pre-quirúrgicamente de pacientes con cáncer de colon en estadio temprano que quedaba libre de recurrencia o tuvieron recurrencia de la enfermedad. La hipótesis de que los patrones alterados de MIR que circulan podrían indicar un mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad debido a las semillas metastásica oculta en el momento del diagnóstico inicial. Nos informan de que un conjunto de seis miRs puede ser útil para predecir la recurrencia de la enfermedad de riesgo para el cáncer de colon etapa temprana.
Resultados
circulante microARN expresión de comparación Utilizando un enfoque de genes candidatos
para medir miRs en la circulación, establecimos RT-PCR cuantitativa [33] como un método de detección con un rango dinámico de hasta 10
6 veces para miRs en muestras de suero [18]. Como una primera aproximación, elegimos un grupo de dieciséis MIR que se había demostrado que se expresa diferencialmente entre el cáncer de colon y los tejidos normales del colon [21], [34], [35]. Inicialmente se realizó un estudio piloto y analizado un conjunto de muestras de suero de pacientes con cáncer de etapa temprano de colon que se mantuvo libre de enfermedad (n = 5) o tuvieron recurrencia de la enfermedad (n = 5) en un plazo medio de 26 meses (& lt; 0,05 vs. sin recurrencia; 1A figura, B).. Higo. 2A muestra el intervalo de concentración de aproximadamente 100.000 veces de los dieciséis miRs analizados en el estudio piloto circulantes. Hemos observado las tendencias esperadas de la respectiva regulación de abajo-arriba o en algunos de los MIR seleccionados (es decir, miR-20, miR-135b, miR-195, miR-320, miR-615). Sin embargo, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 2B). Es de destacar que miR-320 fue uno de dos miRs que mostró una regulación a la baja en los tejidos que se correlaciona con mal libre de recurrencia supervivencia [21]. Aquí, el miR-320 en la circulación era aproximadamente dos veces menor en los pacientes con recurrencia de la enfermedad, sin embargo, que la regulación por disminución no fue estadísticamente significativa (Fig. 2B). La expresión de miR-498, el otro MIR del estudio en la Ref. [21], se detectó sólo en niveles muy bajos en la circulación y por lo tanto no es adecuado para el análisis.
A, A partir de un estudio piloto con 10 pacientes candidato MIR predictivo de recurrencia de la enfermedad fueron identificados y probados por su predicción de recurrencia de la enfermedad en un estudio de validación. B, gráfico de Kaplan-Meier de recurrencia de la enfermedad en los pacientes en el estudio piloto. Los pacientes con recurrencia de la enfermedad (n = 5) frente a sin recurrencia (n = 5): Chi cuadrado 5,47; p = 0,0193; mediana del tiempo hasta la recidiva = 26 meses. Se utilizaron los algoritmos Gehan-Breslow-Wilcoxon.
Candidato enfoque MIR. Se analizaron los niveles circulantes de 16 miRs indicados en el eje x que se habían publicado como diferencialmente expresados entre el cáncer de colon y tejidos de colon no malignas [21], [34], [35]. muestras de suero antes de la cirugía eran de pacientes en el estudio piloto. Los pacientes fueron seguidos por recurrencia de la enfermedad y los datos respectivos se encuentran en la Fig. 1B. A, Concentración de miRs circulantes (en relación con U6). Tenga en cuenta el registro de escala que cubre un rango de 100.000 veces. B, la relación de expresión entre los grupos de pacientes. Alhough miR-20, miR-195 y miR-320 mostró una regulación a la baja ≥2 veces, y miR-135b y miR-615 una regulación al alza ≥2 veces en el suero de pacientes con recurrencia de la enfermedad, ninguna de las comparaciones alcanzó significación estadística por ANOVA (p & gt; 0,05).
circulante microARN expresión de comparación utilizando un imparcial, Genoma en todo el análisis
A partir del estudio piloto anterior se seleccionaron dos muestras de pacientes de la libre de recurrencia ( grupo NREC) y recurrencia (Rec) para un análisis de todo el genoma de miR imparcial. Escogimos pacientes del estudio piloto anterior que se había demostrado la expresión más diferencial de miRs candidatos. Pensamos que una comparación dentro de un par de muestras tales podría ofrecer una mayor posibilidad de recoger MIR-recurrencia específica. Analizamos este par de muestras de pacientes utilizando SYBR Green qPCR basado en todo el genoma arrays de expresión de miR para 760 MIR establecidos en nuestro laboratorio, utilizando reactivos disponibles comercialmente (SBI vista, Montaña CA). El resultado respectivo para las 70 mejores miRs se muestra en la Fig. 3 como un mapa de calor. Para un estudio de validación independiente se seleccionaron a partir de este panel de seis MIR que se reunió dos criterios: (1) un nivel suficiente de expresión en muestras de suero, es decir, RT-PCR Los valores de Ct ≤32 y (2) la expresión diferencial (& gt; 3 veces arriba o baja regulación) de a dado muestras de miR comparando Rec y NREC.
mapa de calor del análisis de la expresión de microARN en todo el genoma utilizando RT-PCR cuantitativa. Dos pacientes fueron seleccionados de la estudio piloto (véanse las Fig. 1 y 2). El análisis de la expresión de los genes miARN se llevó a cabo durante 760 miRNAs utilizando el análisis de expresión basada en qPCR. filtración y el análisis de datos se llevaron a cabo y los 70 MIR que muestran la expresión diferencial mayor están representados en el mapa de calor.
Validación de circulación patrones de expresión de microARN como predictor de recurrencia de la enfermedad
para evaluar si los MIR circulantes identificados en el estudio experimental anterior se puede predecir la recurrencia de la enfermedad en pacientes de bajo riesgo, se utilizó un grupo separado, independiente de treinta pacientes con cáncer de colon en estadio temprano con resultados conocidos. Quince de estos pacientes tuvieron recurrencia de la enfermedad en un plazo medio de 25 meses, mientras que los otros quince permanecieron sin recurrencia. Las características clínicas de los pacientes de este conjunto de validación en el momento de su diagnóstico inicial se proporciona en la Tabla 1. En el momento del diagnóstico los dos grupos de pacientes con y sin recidiva de la enfermedad no mostraron diferencias significativas con respecto a la edad, el sexo, el tamaño del tumor , el estadio del tumor, la ubicación de su lesión primaria o histopatología (Tabla 1). Todos los pacientes tenían enfermedad con ganglios negativos y más de doce ganglios linfáticos examinados. Sólo un paciente (en el grupo de no repetición) fue un T4, todos los demás fueron T1 para tumores T3 y por lo tanto la mínima conocido riesgo de recurrencia.
La expresión de los seis miRs derivados identificado en el estudio piloto se midió mediante qRT-PCR y los datos resultantes se muestran como valores en bruto Ct, así como un intervalo de concentración en la Fig. 4A (ejes izquierdo y derecho, respectivamente). La concentración de los seis miRs seleccionados en la circulación cubre un rango de aproximadamente 1.000 veces, y por lo tanto un 100 veces gama más estrecha que las miRs monitorizados en el estudio piloto (comparar las Figs. 4A y 2A). Un análisis de correlación de los datos mostró una fuerte correlación entre los niveles de expresión de miR-15a, miR-148a, miR-320a y miR-451 (r = 0,746 a 0,897; p & lt; 0,0001) mientras que los niveles de miR-103 y miR 596 no se correlacionaron con los niveles de los otros MIR. Un Análisis de Componentes Principales (PCA) del conjunto de datos mostró una agrupación distinta de los pacientes con y sin recidiva (Fig. 4B) lo que sugiere que el panel de miRs puede distinguir los diferentes riesgos de recurrencia de los pacientes.
Estudio de validación de miRs seis identificadas en el estudio piloto. Características de los pacientes se proporcionan en la Tabla 1. Seis miRs se derivaron del estudio piloto. A, los niveles de expresión basado en el ciclo umbral (Ct) valores de la qRT-PCR (eje de la izquierda) y la concentración de miR calculado (eje derecho). B, Análisis de Componentes Principales de los datos con los dos grupos se muestran en los símbolos en negro y rojo, respectivamente.
Un ciego análisis de agrupación jerárquica [18] (Fig. 5A) mostró una significativa creación de subconjuntos en dos grupos distintos . Trece de los quince pacientes con recurrencia de la enfermedad y once de los quince pacientes que estaban fueron clasificados correctamente por los MIR en las muestras de sangre tomadas antes de su cirugía inicial libre de recurrencia (p = 0,0025; odds ratio = 17,9;. Rel riesgo = 5,5, 95% CI = 1,5-20,7). Un análisis de Kaplan-Meier de los tiempos de recurrencia de la enfermedad en los pacientes asignados a alto o bajo riesgo por la agrupación hierarchival mostró un resultado significativamente diferente entre los dos grupos (p = 0,0026, Fig. 5B). Por lo tanto, los seis miRs seleccionados aquí se pueden usar para predecir el riesgo de recurrencia de la enfermedad de etapa temprana, el cáncer de colon de bajo riesgo por el análisis de una muestra de sangre recogida en el momento del diagnóstico inicial.
A, la agrupación jerárquica de los pacientes del estudio de validación en grupos de bajo y alto riesgo sobre la base de los niveles séricos de miR. El análisis dio como resultado una separación en dos grupos. B, de Kaplan-Meier parcela de pacientes predice que tienen alto y bajo riesgo de recurrencia de la enfermedad. La comparación resultó en P = 0,0026, (IC 1,9-15,0 95%) Cociente de riesgos 5.4. En el panel A los pacientes con recurrencia de la enfermedad son#1 a#15 y sin recurrencia:.#16 a#30
Discusión
El estudio pretende evaluar el posible uso de microARN de circulación ( MIR) para identificar a los pacientes con cáncer de colon con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad a pesar de un diagnóstico de la etapa temprana, enfermedad de bajo riesgo indicado por la estadificación del tumor establecido. Esto podría ayudar a identificar a aquellos individuos que se beneficiarían de una vigilancia más estrecha y /o terapia sistémica adicional y evitaría sobre el tratamiento de los pacientes que no se beneficiarán debido a su bajo riesgo (revisado recientemente en [6]). El análisis se puede hacer con una pequeña cantidad (& lt; 1 ml).
De suero
El origen del MIR circulantes ha sido un tema de debate. miRs asociados a tumores detectados en la circulación obviamente podrían resultar de la muerte de células tumorales así como de liberación activa de las células tumorales. Por otra parte, miRs envasados en los portadores de protección, como los exosomas se pueden entregar a las células receptoras donde ejercen el silenciamiento de genes a través del mismo mecanismo que miRs celulares [36] o pueden ser derramada en la circulación. Además, miRs secretadas han sido la hipótesis de estar involucrados en la mediación de la comunicación célula-célula. También conjuntos de selección de MIR son liberadas por las células cancerosas y la composición de estos conjuntos de MIR se ha relacionado con tumores malignos [37]. Aunque miRs circulantes asociados con el cáncer se pueden derivar de células de cáncer de los propios, las células del estroma inmunes o de otro tipo en el microambiente tumoral, así como otros órganos que responden a las señales del tumor son posibles fuentes [38]. Por lo tanto, las células inmunes pueden secretar miRs asociados al cáncer, promover o inhibir la proliferación, la invasión y la apoptosis [38] por lo tanto, [39] y la desregulación de estos miRs puede ser un enlace importante entre la inmunidad y el cáncer. Aunque, algunos estudios encontraron tendencias paralelas entre las que circulan MIR MIR y tejidos (por ejemplo [18], [24]) que otros sugieren que no todos los MIR liberados reflejan la abundancia de miR en las células tumorales (por ejemplo [37], [40]). En general, miRs detectados en la circulación son proporcionados por diferentes órganos y regulación fisiológica o cambios patológicos va a alterar los patrones de expresión de miRs circulantes (por ejemplos recientes y comentarios Ver Refs. [29], [41], [42], [43 ]).
al analizar los MIR en el actual estudio, uno por uno en lugar de en un análisis multivariado, se encontraron dos miRs diferencialmente expresado en la circulación, es decir, el miR-103 (downregulated) y miR-596 (upregulated). miR-103 fue significativamente las reguladas (p = 0,038) en muestras de sangre de pacientes con recurrencia de la enfermedad en comparación con los pacientes sin recidiva (Fig. 4A). En células de las criptas intestinales miR-103 es parte del /S red de regulación de la transición G1 durante IGF-1 estimula la proliferación y esto apunta a un papel significativo en el crecimiento celular y la supervivencia [44]. Por el contrario, el miR-596 fue significativamente hasta reguladas (p = 0,0012) en muestras de sangre de pacientes con recurrencia de la enfermedad. La expresión de miR-596 se correlaciona con una baja supervivencia de los pacientes con ependimoma [45], pero se inactiva en el CHC [46] y downregulated en adenocarcinoma de páncreas [47]. Por lo tanto, no hay una clara evidencia que liga expresión tisular de este MIR a una funcionalidad distinta que conectaría a progresión de la enfermedad. miRs con sólo pequeños cambios globales entre los grupos de pacientes fueron miR-148a que forma parte de un grupo de reguladores negativos de genes pro-inflamatorios en las células mieloides [48], sin embargo, se redujo en tejidos de cáncer de páncreas [18], expresada en niveles altos en el hígado de los tejidos [49] y asociado con daño hepático [50]. miR-320a se informó anteriormente como un indicador prometedor de la progresión maligna en el cáncer de colon [25], aunque no nos vemos una indicación clara del impacto de miR-320 cambios por su cuenta en este estudio. miR-15a puede causar apoptosis [51] y se ha informado para participar en el control de la diafonía-tumor del estroma en el cáncer de próstata [52], así como mediar vías proangiogénicos en la isquemia asociada a patología [53]. Curiosamente, miR-451 se caracterizó como indicador de la circulación de la presencia de cáncer de mama [54] y se demostró que ser liberado de forma selectiva de los epitelios de mama transformado y contribuir a la alteración de la sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos o endocrinas específicas en el cáncer de mama (revisado en [ ,,,0],55]). Es tentador especular que los MIR que circulan aquí identificados como indicadores del riesgo de recurrencia de la enfermedad pueden contribuir al proceso por el impacto de la supervivencia de células tumorales, las interacciones del estroma tumoral, la angiogénesis o respuestas de las células inflamatorias a las metástasis ocultas.
en Conclusión
el riesgo de recurrencia de cáncer de colon en estadio temprano puede predecirse mediante el control de MIR en muestras de sangre de pacientes recogidos en el momento del diagnóstico inicial.
Materiales y Métodos
Detección y cuantificación de miR en muestras de sangre
la recopilación y uso de muestras biológicas fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Georgetown en virtud del protocolo#2007-345 por última vez el 10/24/2012. Todos los pacientes firmen un formulario de consentimiento que permite el uso de muestras de fluidos corporales y tejidos donados. Los formularios de consentimiento y su contenido fue revisado y aprobado por el IRB. Las muestras de suero (& lt; 1 ml) se procesaron después de la eliminación de identificadores personales. el aislamiento de miR se describió anteriormente [18]. En resumen, las muestras de suero se mezclaron en una proporción de 1:10 con el reactivo de lisis Qiazol y se agitó. El lisado se extrajo con CHCl3 y la fase acuosa se procesa adicionalmente para el ARN total utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) y se enriquece para MIR usando el kit de aislamiento de RT2 qPCR-Grade Mir, MA-01 (SABiosciences).
Análisis de datos
PCA y la agrupación jerárquica se realiza en base a la media centrada, y se ajustan los niveles de expresión de miR. Los métodos de agrupamiento utilizados XLSTAT (Addinsoft Inc.) dentro de Excel (Microsoft Inc.) en OSX 10.7.5. Estos métodos permiten el cálculo de significancia entre los grupos jerárquicos y los valores de p Derivar utilizando la prueba exacta de Fisher. el software Prism 5.0 (GraphPad) fue utilizado para otras pruebas y visualización de los datos.
Reconocimientos
Deseamos reconocer Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet y Ryan Navarro (todos a la Universidad de Georgetown) para la técnica asistencia. Drs. Daniel F. Hayes (U de Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers y Beppe Giaccone (todo en la Universidad de Georgetown) leyeron los borradores del manuscrito, hicieron observaciones y sugerencias para el análisis de datos e interpretación.