Extracto
Fundamento y objetivo
factor de transcripción E2A es crucial para el desarrollo normal y la diferenciación de los linfocitos B y T. La desregulación de E2A conduce a la leucemia y la tumorigénesis de algunos tumores sólidos. La expresión y la importancia clínica de E2A, así como su papel en el cáncer colorrectal (CCR) son todavía desconocidos. Este estudio tiene como objetivo evaluar la expresión de E2A en los tejidos de CRC, evaluar su valor pronóstico, e investigar su papel en el crecimiento de células de cáncer de colon.
Métodos
E2A expresión en los tejidos de CRC y mucosa normal fue detectado por tinción inmunohistoquímica; curva de supervivencia de Kaplan-Meier y el modelo de regresión de Cox se utilizaron para evaluar el valor pronóstico de E2A. Lentivirus se utilizó para construir células abatidos de forma estable E2A. MTT ensayo se empleó para detectar el cambio proliferación celular; ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo; y la cromatina immunoprecipitation (CHIP) ensayo se utilizó para validar el objetivo vinculante previsto de E2A
Resultados
La expresión de E2A fue menor en los tejidos de CRC que la mucosa normal.; baja expresión de E2A correlaciona con el estadio TNM avanzada y mayor tamaño del tumor, y predijo mal pronóstico de los pacientes con CCR. E2A caída resultó en un aumento de la tasa de proliferación celular y la aceleración del ciclo celular. chip de ensayo mostró miR-320a era un objetivo directo de E2A y la regulación positiva de miR-320a en las células E2A downregulated podrían revertir los cambios de proliferación celular y el ciclo celular causada por la deficiencia de E2A.
Conclusiones
E2A es un factor pronóstico independiente de los pacientes con CCR y se dirige a miR-320a para regular la proliferación celular de las células de cáncer de colon
Visto:. un Huang, Zhao H, Quan y, Jin R, Feng B, Zheng M (2014) E2A predice el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal y regula el crecimiento celular del cáncer de Orientación de miR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10.1371 /journal.pone.0085201
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de septiembre de 2013; Aceptado: 25 Noviembre 2013; Publicado: 13 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF, 30873000). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El gen E2A de mamífero se encuentra en el cromosoma 19 y es ubicua y se expresa en una amplia gama de tipos de células específicamente no tejido. A través de splicing alternativo, el gen E2A codifica dos isoformas, E12 y E47 (denominados colectivamente como proteínas E2A), que ambos tienen el dominio hélice-bucle-hélice (bHLH) y podría regular la transcripción de genes mediante la unión al ADN E-box secuencias, CAGGTG. Aunque expresado ampliamente, E2A no es esencial en algunos organogeneses como miogénesis esquelético o cardíaco, la eritropoyesis, la condrogénesis, y la neurogénesis [1], pero juega un papel importante en el desarrollo y la diferenciación de [2], [3] y linfocitos T B [4 ]. E2A ratones deficientes mostró una detención en la fase de células pro-B durante el desarrollo de células B [3] y la expresión transgénica de cualquiera de E12 o E47 podría rescatar parcialmente la iniciación B lymphopoiesis; Del mismo modo, la deficiencia de E2A llevó a un bloque en la etapa más temprana del desarrollo de las células T [4] y perturbado timocitos selección positiva [5]. Por otra parte, E2A se ha encontrado a participar en algunas actividades celulares incluyendo la diferenciación celular [6], la proliferación [7], la apoptosis [8], el ciclo celular [9] y epitelio-mesenquimal transición (EMT) [10].
además de su papel crucial en la B y el desarrollo normal de las células T, E2A también participa en la tumorigénesis. Los estudios han reportado el papel bien establecido de E2A de la leucemia: dos proteínas de fusión, E2A-HLF [11] y E2A-PBX1 [12], tanto que contiene el dominio de transactivación de E2A y el dominio de unión a ADN de HLF o PBX1, podía dar lugar a células pro-B de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) en adolescentes y de células pre-B, en los niños, respectivamente [13]. Por otra parte, E2A se ha encontrado para estar implicado en la oncogénesis de los tumores sólidos, ya sea como oncogén o como gen supresor de tumores. La presencia de proteína de fusión E2A-PBX1 en el cáncer de pulmón se informó recientemente y se correlaciona con la supervivencia global de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón in situ [14]. se detectó aumento de expresión de E2A en el cáncer de mama [15], [16] y el cáncer de próstata [17], de la que se encontró para promover la oncogénesis. Sin embargo, los ratones con mutación nula de E2A fueron susceptibles a los linfomas tímicos desarrollados espontáneamente [18] y la pérdida de E2A en el linfoma de efusión primaria llevado a la resistencia a la apoptosis [19], lo que sugiere el papel alternativa de E2A como un gen supresor de tumores. Además, la expresión de E2A se ha propuesto para ser de valor diagnóstico en cierto subtipo de MALT gástrico (tejido linfoide asociado a la mucosa-) linfoma [20]. Tomados en conjunto, E2A puede actuar como un gen supresor de tumores o como un oncogén en diferentes tipos de cáncer.
La expresión de E2A en el cáncer colorrectal (CRC) y su valor pronóstico no se han discutido antes y es aún se desconoce si E2A promueva o reprime el desarrollo de CCR. En este estudio, a nuestro entender, por primera vez, se investigó la importancia clínica de E2A en el CCR y encontramos su utilidad como marcador pronóstico; Además, hemos encontrado E2A suprimió el crecimiento tumoral mediante la orientación de miR-320a en células de cáncer de colon, lo que demuestra su función supresora de tumores en el CCR.
Métodos
Pacientes y muestras clínicas
se incluyeron un total de 98 pacientes con cáncer colorrectal; los pacientes fueron tratados con cirugía entre junio de 2007 y enero de 2008 en el Centro de Cirugía de Mínima Invasión de Shanghai. Los pacientes fueron excluidos si: habían recibido quimioterapia neoadyuvante; tenido cánceres colorrectales resecables; tenían tumores de otros órganos; es poco probable que ser entrevistado durante el seguimiento. Los datos demográficos y clínico-patológicos fueron extraídos por revisión de las historias. Los pacientes fueron entrevistados por teléfono a los tres meses, seis meses, y luego cada año después de la cirugía. Las muestras tumorales fueron cortadas inmediatamente después de la extracción de muestras quirúrgicas 'durante las operaciones y luego se fijaron con formalina y se conservan a 4 ° C durante dos semanas antes del próximo tratamiento; tejidos normales se definieron como mucosa situado al menos 5 cm de distancia desde el margen del tumor y corte, fijo, conservado y se trató como anteriormente. Este estudio se realizó con el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes reclutados antes de la cirugía y bajo el protocolo aprobado por el Comité Ético del Hospital Ruijin de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
La inmunohistoquímica y la puntuación
tinción inmunohistoquímica se realizó como protocolo descrito anteriormente [21]. En pocas palabras, después de la fijación con formalina, tejidos fueron embebidas con parafina, corte, y se montaron en portaobjetos. A continuación, los portaobjetos se lavaron con xileno para Desparafinar, con etanol clasificado para rehidratar, se incubaron con tampón de citrato para recuperar el antígeno, y se bloquearon con 3% de H
2O
2 para inactivar la peroxidasa endógena. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo primario E2A (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EE.UU.; 1:200 dilución) a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado de cabra anti-anticuerpo secundario de conejo (Santa Cruz) para 30 minutos a temperatura ambiente. visualización Complex se hizo con un DAB Kit 2-Solution (Invitrogen). Los controles negativos fueron obtenidos mediante la sustitución del anticuerpo primario E2A con suero de conejo preinmune.
Las láminas fueron examinadas por dos investigadores (Huang y Quan) de forma independiente. criterios de puntuación utilizados fueron descritos como anteriormente, con modificaciones menores. intensidad de la tinción se puntuó como 0 (sin manchas), 1 (tinción débil), 2 (tinción moderada), y 3 (fuerte tinción); células positivas en cada sección se puntuaron como 0 (menos de 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), y 3 (& gt; 50%). El resultado final fue un producto de las puntuaciones de intensidad y de células positivas de cada diapositiva. Diapositivas con puntuación de 0-3 se definieron como una baja expresión y 4-9 como alta expresión.
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de colon Lovo HCT116, Caco-2, HT29, SW480, y SW1116 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se subcultivan y conservado por el Instituto de Shanghai de Cirugía Digestiva; humana normal de células de la mucosa del colon epitelio NCM460 fue amablemente donado por Jingqing Zeng (Hospital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, el donante compró línea celular NCM460 de incell Corporation, LLC, San Antonio, TX, EE.UU.). LOVO se cultivó en F-12K Mezcla medio nutritivo (Corning Cellgro®, MA, EE.UU.), HCT116 y HT29 en 5A de McCoy (Corning Cellgro®), SW480 y SW1116 en Leibovitz 'L-15 (Corning Cellgro®), y en NCM460 DMEM (Corning Cellgro®). Todo medio de cultivo anterior se complementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Caco-2 se cultivó en medio esencial mínimo (Corning Cellgro®) con 20% de FBS. Las células se colocaron en la incubadora (Heracelles, Alemania) a 37 ° C, en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2.
La extracción de proteínas y Western blot
Las células fueron cosechadas en una confluencia de 80% con RIPA (Solarbio, Pekín, china) y la concentración de proteína se determinó con el kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, EE.UU.) mediante la medición de OD
562 utilizando un lector de microplacas (Epoch, BioTek, Winooski, EE.UU.) . Western blot se realizó según el protocolo se informó anteriormente [22] y los anticuerpos primarios utilizados fueron E2A (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, EE.UU.). GAPDH (Kangchen, Shanghai, China) se utilizó como control de carga.
ARN y el aislamiento de microARN, QRT-PCR
ARN celulares totales se extrajeron usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y microRNAs celulares totales ( miRNAs) se extrajeron con mirVana ™ miARN Aislamiento Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). ARN de transcripción inversa se realizó usando PrimeScript RT Master Mix Perfect Tiempo real (Takara, Shiga, Japón). El nivel de ARNm de E2A (adelante: 5'-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 '; inversa: 5'-GTCTC TCCCG AAGGA GGCATA-3') se evaluó mediante QRT-PCR, utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems); el nivel de ARN de GAPDH (adelante: 5'-GGAGC Gagat CCCTC CAAAAT-3 '; inversa: 5'-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA TGG-3') se utilizó para la normalización. La expresión de miR-320a se evaluó mediante qRT-PCR utilizando el kit TaqMan microARN RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), TaqMan MicroARN ensayos (Applied Biosystems), y la mezcla maestra de PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante; el nivel U6 miARN se utilizó para la normalización.
Lentiviral transfección de clones de expresión estables
partículas
E2A /shRNA eGFP-lentivirus y SH-control negativo E2A /() SHNC partículas EGFP-lentivirus , a saber, E2A /shRNA-LV y E2A /SHNC-LV, se adquirieron de Novobio (Shanghai, china). SHNC se sintetizó con las mismas bases de shRNA pero con la secuencia codificada. transfección Lentiviral y la detección de células se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para establecer el E2A de forma estable downregulated y la forma estable NC transefected SW480 clones, es decir, SW480 /shE2A y SW480 /SHNC. La eficacia de transfección se evaluó mediante el examen visual del porcentaje de células eGFP-expresan bajo el microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón), Western blot, y QRT-PCR.
Transfección transitoria
plásmidos, Pez-M29-E12 (plásmido que codifica la isoforma E12), Pez-M29-E47 (plásmido que codifica la isoforma E47), Pez-M29-NC (plásmido con la secuencia de control negativo) y el vector de controles fueron adquiridos de Genecopoeia (Rockville, MD, EE.UU.) y validado por secuenciación; imita los miRNA-320a (moléculas de ARN de doble cadena que imitan el miR-320a) e imita los CN (secuencias de control negativo basado en C. elegans microARN tienen una identidad de secuencia mínima en humanos) fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai, China). Las células de la fase de registro se cosecharon y se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 4 * 10
5 células /pocillo, 24 horas antes de la transfección. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) se utilizó para la transfección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la transfección transitoria fue examinado por Western blot o QRT-PCR. Las células transfectadas con vectores fueron utilizados como control.
proliferación de las células de ensayo
ensayo de proliferación celular se realizó con el Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japón). Brevemente, las células se sometieron a digestión con tripsina (Beyotime, Shanghai, China), se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces, se filtra con un colador (BD Falcon), se resuspendieron en RIPA 1640, se cuentan y se diluyen a una concentración final de 5 células /mL. Luego, las células se sembraron en placas de 96 pocillos, 200 l (1000 células) por pocillo, en sixplicate, y se colocan en la incubadora durante 6 días. Las células viables se cuantificaron en cada intervalo de 24 h con CCK8, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (Epoch, BioTek).
análisis del ciclo celular
Antes del análisis, las células (2 × 10
6) se cosecharon 48 horas después de la transfección transitoria, así como los controles correspondientes. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, se fijaron con 75% de etanol y se almacenó a 4 ° C durante la noche. Tras el análisis, las células se lavaron con PBS dos veces y se trataron con RNasa a 37 ° C durante una hora, seguido de tinción con yoduro de propidio durante 30 minutos en la oscuridad. Seguidamente se realizó un análisis del ciclo celular con citometría de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, EE.UU.).
cromatina ensayo de inmunoprecipitación
EZ-Chip ™ Inmunoprecipitación de cromatina Kit (Millipore, Billerica, MA, EE.UU. ) fue adquirido para realizar el ensayo chIP, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, una placa de cultivo celular de 15 cm de células SW480 (alrededor de 80% de confluencia) se fijó con 1% PFA (Sigma). A continuación, las células se lisaron, se sonicaron a cizallamiento DNA y se inmunoprecipitaron con anti-E2A (Santa Cruz) y anticuerpo de control (IgG). Después de eso, la reticulación de proteínas /ADN se invierte y se purificó el ADN para la PCR siguiente, utilizando Takara Ex Taq Hot Start Versión (Takara).
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso de el software SPSS 15.0. La correlación de los factores clínicos con expresión E2A se examinó por análisis de correlación de Pearson. El efecto de E2A en la supervivencia se estimó mediante la curva de Kaplan-Meier y log-rank test. Univariante y multivariante modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para evaluar los efectos de la expresión de E2A y los parámetros clínico-patológicos en el sistema operativo de 5 años y DFS, respectivamente. Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar las diferencias entre los dos grupos y un modelo lineal se emplea en el caso de los datos consistió en más de dos grupos. Un valor de dos colas de
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La expresión de E2A correlacionado con CRC estadios patológicos
En primer lugar, se evaluó la expresión de la proteína E2A en los tejidos de CRC y mucosa normal por inmunohistoquímica (Figura 1). Se examinaron muestras de tumores colorrectales obtenidos de 98 pacientes con CRC y mucosa normal disponible en 43/98 pacientes. Los parámetros demográficos y clínico-patológicos de todos los pacientes incluidos se muestran en la Tabla 1. De los 98 pacientes, se detectó una alta expresión de E2A en los tejidos normales de la mucosa 35/43 y 39/98 de tumores (
P Hotel & lt; 0,01) . La tinción de E2A en mucosa normal presenta en núcleo y el citoplasma ambos, pero en tejidos de cáncer, E2A tinción fue predominantemente nuclear (Figura 1). Más importante aún, la expresión de E2A disminuyó a medida que avanzaban los CRC (Figura 1E-H). a continuación, se realizó un análisis de correlación de estudiar la asociación entre la expresión de E2A y los factores clínico-patológicos. Como se muestra en la Tabla 2, la baja expresión de E2A se asoció significativamente con la etapa superior TNM (
P Hotel & lt; 0,01) y mayor tamaño del tumor (
P = 0,035
), pero no estaba relacionada con pacientes de edad (
P = 0,761
), género (
P = 0,655
), la histología del tumor (
P = 0,985
), o en el sitio del tumor (
P
= 0,120). Así fue E2A probabilidades de estar involucrados en el desarrollo y progresión del CRC
Imágenes representativas de IHC se muestran como:. (A) tinción HE de la mucosa normal; (B) tinción HE de tejido CRC; (C) la expresión de alto E2A (color marrón) se presenta como la tinción nuclear y citoplasmática en la mucosa normal; (D) la baja expresión de E2A en la mucosa normal; (E-H) Etapa I (E) a la etapa II (F), III (G), y IV (H) CRC tejidos con diferentes intensidades de tinción E2A; E2A apareció predominantemente en el núcleo. Las imágenes fueron tomadas por debajo de 200 × magnificación.
Baja expresión de E2A predijeron mal pronóstico de los pacientes de CRC
Para investigar el valor pronóstico de E2A, se utilizó Kaplan -Meier curva de supervivencia a 5 años para mostrar las diferencias en los resultados entre la expresión de E2A CRC pacientes de bajo y alto. Como se muestra en la Figura 2, los pacientes con alta expresión de E2A tuvieron una mayor supervivencia global a 5 años (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS) que los pacientes con baja expresión. La SG a 5 años y DFS para los pacientes de expresión alta E2A fueron 84,6% y 82,1%, y para los pacientes con baja expresión de E2A fueron 47,5% y 42,4% (
P = 0,000
, para OS y DFS ambos). A continuación, se empleó el modelo de regresión de Cox para examinar el valor pronóstico de E2A. En el análisis, se encontró que la expresión escenario y E2A TNM para ser predictivo para el sistema operativo y DFS; mientras que en el análisis multivariado, los dos factores también predicen peores resultados clínicos (Tabla 3). De ahí la expresión de E2A parecía ser un factor predictivo útil para el pronóstico de los pacientes con CCR
(A) OS para los pacientes de alto y bajo de expresión de E2A.; (B) DFS para los pacientes de alto y bajo de expresión de E2A. Los pacientes con alta expresión de E2A tienen más favorable OS y DFS (
P = 0,000,
para OS y DFS ambos).
inhibición de la proliferación celular en las células por E2A CRC
Teniendo en cuenta la importancia clínica de E2A, que quería preguntar si E2A jugó un papel en el desarrollo de CCR. líneas celulares de cáncer de colon Six, LOVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, SW1116 y y normal humana de células de la mucosa de colon epitelio NCM460 se cribaron para la expresión de E2A mediante el uso de transferencia Western (Figura 3A). De las siete líneas de células, NCM460 mostró mucho más alto nivel de expresión de E2A que todas las otras células cancerosas. Tomados en conjunto con su expresión en pacientes con CRC, E2A se downregulated significativamente en los tejidos y células CRC.
(A) Expresión de E2A en humano normal de células de la mucosa del colon NCM460 epitelio y CRC líneas celulares se demostró por Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga; (B) y (D) Las células con expresión E2A downregulated (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) mostraron una mayor tasa de proliferación de las células que la del control negativo (SW480 /SHNC, Caco-2 /SHNC) y de tipo salvaje (SW480 /WT, Caco-2) células /peso; (C) y (E) las células de los padres (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) fueron co-transfectadas con E12 o plásmido E47 (SW480 /shE2A_E12 y SW480 /shE2A_E47; Caco-2 /shE2A_E12 y Caco-2 /shE2A_E47) para restaurar la expresión de E2A. Las células co-transfectadas mostraron una disminución de la tasa de proliferación celular que el del control de los padres o vector (SW480 /shE2A_VC, Caco-2 /shE2A_VC) células transfectadas. Todos los datos representados como valor medio ± SD de 3 experimentos independientes. (*,
P Hotel & lt; 0,05).
Para investigar directamente la función de E2A, se construyó de forma estable E2A clon derribado, células SW480 /shE2A, y el control negativo clon, células SW480 /SHNC, con E2A /shRNA-LV y E2A /SHNC-LV, respectivamente. eficiencia caída fue validado por Western blot y QRT-PCR (Figura S1 A). A continuación, hemos detectado los cambios de proliferación celular SW480 /shE2A y las células SW480 /SHNC con el ensayo MTT, utilizando células SW480 tipo salvaje (SW480 /WT) como control. Como se muestra en la Figura 3B, SW480 /shE2A mostró una mayor tasa de proliferación de SW480 /SHNC y células SW480 /WT, lo que indica un papel de supresión de E2A en la proliferación. Para demostrar aún más la función anti-proliferación de E2A, se realizó la co-transfección en células SW480 /shE2A estables con dos plásmidos, Pez-M29-E12 (que codifica la isoforma E12) y el pez-M29-E47 (que codifica la isoforma E47) para compensar el regulación a la baja por efecto shE2A. La co-transfección rescató la expresión de E2A de las células SW480 /shE2A al nivel normal (Figura S1 A) y también restauró la tasa de proliferación (Figura 3C). Por otra parte, la transfección de E12 o E47 en células SW480 tipo salvaje podría inhibir significativamente la proliferación celular y la inhibición de los efectos causados por el E12 y E47 no mostró diferencias (Figura S1 B). Para excluir la posibilidad dependiente de la línea celular, se construyó Caco-2 /shE2A y Caco-2 clones /SHNC repetir los experimentos anteriores y los resultados mostraron E2A tenía el mismo papel anti-proliferación en 2-Caco células (Figura 3D & amp; E) . Además, hemos manipulado la expresión de E2A en las células NCM460. E2A silenciamiento y la restauración también afectaron el crecimiento celular NCM460 de manera supresora (Figura S1 C). En conclusión, E2A podría ser un regulador negativo de la proliferación de células de cáncer de colon.
E2A regulada la progresión del ciclo celular de las células SW480
A continuación hemos querido conocer los mecanismos mediante los cuales E2A regula la proliferación de células SW480. En publicaciones anteriores, se informó E2A estar implicado en la regulación del ciclo celular [9], [23], [24]. Por lo tanto, realizamos análisis del ciclo celular por citometría de flujo para detectar cambios posibles después de E2A regulación a la baja y la restauración. En consonancia, el cambio de ciclo celular explicó alteración en la proliferación celular: tal como se muestra en la Figura 4A, el ciclo celular de las células SW480 /shE2A diferían de SW480 /SHNC y células SW480 /WT, con más células progresado en la fase S, lo que indica aumento de la proliferación celular. Cuando las células SW480 /shE2A fueron co-transfectadas con cualquiera de E12 o E47 plásmido, el ciclo celular se normalizó, que estaba de acuerdo con la restauración de la proliferación celular (Figura 4B). Por otra parte, la transfección de E12 o E47 de tipo silvestre en SW480 resultó en una disminución de células en fase S (Figura S1 D). efectos de regulación similares también fueron vistos en NCM460 células (Figura S1 E). Por lo tanto, E2A podría regular el ciclo celular para controlar la proliferación de células
(A) regulación a la baja de E2A en las células SW480 conducido a un aumento de las células en la fase S y concomitantemente una disminución de células en fase G1 /G0.; (B) La expresión ectópica de E12 o E47 células aumentó en fase G1 /G0 de las células SW480 /shE2A y la reducción de células en fase S. Los datos representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. (*,
P Hotel & lt; 0,05).
E2A ciclo celular controlada por la orientación de miR-320a
Las conclusiones anteriores nos llevaron aún más para investigar la forma regulada E2A el cambio del ciclo celular. En las últimas décadas, microRNAs (miRNAs) se han encontrado para ser involucrado en la patogénesis de las enfermedades humanas incluyendo cáncer [25]. Inesperadamente, encontramos uno de los genes miARN, MIR-320a, que era un supresor de la metástasis [26], fue regulada por E2A. En las células SW480 /shE2A, la expresión de miR-320a se downregulated (Figura 5A) y transfección de cualquiera E12 o E47 en este grupo de células (Figura 5B) o en células de tipo SW480 silvestres (Figura S1 F) podía aumentar la miR-320a . Para investigar si el miR-320a era un objetivo directamente regulada por E2A, se realizó el ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). Los resultados mostraron que E2A podría obligar a la caja E (GCAGGTG, en -138bp, aguas arriba de miR-320a de horquilla) de miR-320a, lo que sugiere E2A puede regular la expresión de miR-320a por la orientación de su secuencia promotora directamente (Figura 5C) .
(a) la expresión de miR-320a se redujo en las células SW480 /shE2A como se muestra por QRT-PCR; (B) La co-transfección de E12 o E47 en células SW480 /shE2A podría normalizar la expresión de miR-320a; (C) Panel superior: secuencia del gen miR-320a muestra la caja E, el sitio de unión predicha de E2A; Panel inferior: chip de ensayo mostró E2A obligado a miR-320a en su caja E, GCAGGTG; La co-transfección de imita miR-320a invirtió los cambios del ciclo celular (D) y el crecimiento celular (E) de las células SW480 /shE2A; (F) La co-transfección de imita el miR-320a se redujo la tasa de proliferación celular de las células Caco-2 /shE2A. Los datos se expresan con la media ± SD de 3 experimentos independientes. (*,
P Hotel & lt; 0,05).
Entonces, nos preguntamos si el miR-320a era el objetivo por el que la proliferación celular regulada E2A. Mediante la transfección imita el miR-320a en las células SW480 /shE2A, encontramos la progresión del ciclo celular causada por la caída de E2A fue detenido y la tasa de proliferación celular se redujo (Figura 5D & amp; E). Además, co-transfección de imita miR-320a en las células Caco-2 /shE2A inhibe la tasa de proliferación celular (Figura 5F). Por lo tanto, E2A regula la proliferación celular atacando directamente a miR-320a
Discusión
A pesar de los grandes esfuerzos de haber sido realizados para mejorar la prevención y el tratamiento del CCR, su morbilidad y mortalidad siguen siendo elevadas:. Tanto se estima que es la tercera entre todos los tipos de cáncer en EE.UU., 2013 [27]. La tumorigénesis de CRC es un proceso múltiple mediada por la acumulación de alteraciones en la capacidad de proliferación celular y una amplia gama de trastornos genéticos [28]. Sobre la base de estos, los estudios recientes se han centrado en la búsqueda de nuevos biomarcadores y características genéticas aberrantes en el CCR [29]. Aquí mostramos E2A era una novela marcador pronóstico de CRC y miR-320a era un objetivo directo a través del cual E2A regula el ciclo celular de cáncer de colon para controlar la proliferación celular.
El papel de E2A en B y el desarrollo normal de las células T y la leucemia ha sido bien estudiado [13], [30], [31] y también se demostró estar implicado en el cáncer de mama, cáncer de próstata, MALT gástrico y linfoma de timo [15], [17], [18], [20 ]. Especialmente, la expresión de E2A está asociada con la diferenciación de células tumorales y los resultados del paciente en el cáncer de mama [15] y las etapas de tumores en el cáncer de próstata [17]. Por lo tanto, E2A es probable que sea un factor relacionado con el desarrollo de tumores y tienen valor pronóstico. En apoyo de esto, hemos encontrado que la expresión de E2A se redujo significativamente en los tejidos de CRC en comparación con la mucosa normal e inmunohistoquímica mostró una disminución gradual de puntuación de tinción positiva como E2A etapas clínicas avanzadas, lo que indica una asociación negativa de E2A con la Convención de desarrollo y, probablemente, a tumores efecto supresor de E2A. En el análisis de regresión de Cox, encontramos una baja expresión de E2A predice mal pronóstico de SG y SLE en pacientes con CRC independientes de la edad, sexo, localización tumoral, la histología del tumor, y el tamaño del tumor. Estos resultados, lo que sugiere un papel supresor de E2A en el CCR, estaban en consonancia con las conclusiones de linfoma [18], [32] y la leucemia [4], pero en contradicción con las que se encuentran en la mama y el cáncer de próstata [15], [17 ]. Teniendo en cuenta el proceso de múltiples etapas de carcinogénesis y CRC diferentes comportamientos biológicos de tumores, la discrepancia podría entenderse al menos parcialmente
Estudios anteriores han demostrado las funciones de auto-contradictive de E2A en la proliferación:. Silenciamiento de E2A en mama [15 ] y células de cáncer de próstata [17] inhibió el crecimiento celular, pero en el linfoma, la leucemia, las células madre hematopoyéticas y células de cáncer de CRC, la pérdida de E2A condujeron a una mayor proliferación [7], [30], [32], [33]. Además, la sobreexpresión forzada E47 inhibe el crecimiento celular de células T [34]. Para revelar claramente el papel de E2A en la proliferación de células de cáncer de colon, se construyó un E2A de forma estable downregulated SW480 clon para investigar su efecto. En consonancia con los resultados anteriores se encuentran en la malignidad hematopoyética y CRC, se observó que la regulación por disminución de E2A aumentó significativamente la tasa de proliferación celular y la co-transfección con cualquiera de E12 o E47 plásmido podría compensar este efecto, lo que sugiere el papel directo de E2A en la regulación de la proliferación celular. De acuerdo con ello, el análisis del ciclo celular mostró una progresión de la fase G1 /G0 a la fase S en E2A downregulated células. Aunque algunos estudios mostraron ciclo celular detenidas en la fase G1 en las células cancerosas deficientes E2A [17], [23], nuestros resultados eran favorables para el efecto pro-proliferación y de acuerdo con los resultados de la mayoría de los estudios que mostraron progresión del ciclo celular se aceleró después de E2A La deficiencia [24], [35] - [39]. Tomados en conjunto, desmontables de E2A promueve la progresión del ciclo celular y esto resultó en un aumento de la proliferación celular. Estos resultados proporcionan parcial, si no completa, una visión de la función supresora de tumores de E2A en el CCR.
Como factor de transcripción, E2A ejerce sus funciones mediante la regulación de la expresión génica y los estudios han informado de sus objetivos de abajo incluyendo p21, Id1 , c-Myc, etc [17], [24], [36]. En nuestro estudio, encontramos miR-320a era un objetivo regulado por E2A en la modulación del ciclo celular y la proliferación celular. Human miR-320a se localiza en el cromosoma 8p21.3, un locus de susceptibilidad hígado metastásico [40], y se ha informado de que el regulador de la glucólisis [41] y dysregulated en el cáncer [42]. Los estudios han demostrado que el miR-320a suprime la tumorigénesis y la metástasis en CRC [26], [43], [44]. Inesperadamente, hemos identificado la caja E de miR-320a como un sitio de unión de E2A con TESS (Transcripción de elemento de búsqueda del sistema) y que de hecho demostrado que E2A obligado a miR-320a utilizando chip de ensayo. La expresión de miR-320a fue regulada por E2A directamente y lo más importante, la regulación positiva de miR-320a podría revertir los cambios causados por E2A desmontables, lo que sugiere además que como un efector aguas abajo de E2A. Sin embargo, no queda claro si el efecto de E2A en el miR-320a es un efecto global. Tomados en conjunto, proponemos que el miR-320a es uno de los objetivos a través del cual E2A regula la progresión del ciclo celular y la proliferación celular.
En resumen, presentamos evidencia convincente que demuestra que E2A es un factor pronóstico de los pacientes con CCR y obras de teatro un papel-tumor supresor en las células de CRC. A través de la unión directa de miR-320a, E2A regula el crecimiento celular progresión del ciclo celular de cáncer y controles. Sin embargo, el papel de E2A en los tumores sólidos no ha sido plenamente comprendido y nuestros resultados sólo para representar parcialmente los objetivos y mecanismos de acción de E2A moleculares. Por lo tanto, se requieren estudios futuros para validar nuestros resultados y aclarar a fondo el papel de E2A en el CCR.
Apoyo a la Información
Figura S1. gratis (A) Izquierda: expresión de la proteína E2A de tipo salvaje SW480, SW480 de control, y las células SW480 abatidos. Derecha: cambio de expresión de E2A en las células SW480 después de la transfección de shE2A, E12 o E47: shE2A redujo la expresión de E2A en SW480, mientras que E12 y E47 aumento de la expresión de E2A en las células SW480 /shE2A, en relación con los controles; (B) Transfección de E12 o E47 inhibe el crecimiento de células SW480 /WT; (C) E2A regula el crecimiento celular en las células NCM460; (D) La transfección de E12 o E47 aumentó G
0 /G
1 fase de las células SW480 /WT y la disminución de la fase S; (E) E2A regula la progresión del ciclo celular en las células NCM460;