Extracto
E-cadherina se pierden frecuentemente durante la transición epitelio-mesenquimal y la progresión de la tumorigénesis epitelial. Encontramos un marcador de la transición epitelio-mesenquimal, CD44, aumentada en respuesta a la pérdida funcional de E-cadherina en líneas celulares de cáncer de esófago y. La pérdida de expresión de E-cadherina se correlaciona con un aumento de la expresión de CD44 isoforma estándar. Utilizando un modelo de reconstrucción organotípicos, que muestran un aumento de la expresión de CD44 en las áreas de invasión celular se asocia con la MMP-9 en el borde delantero. Por otra parte, la activina A aumenta la invasión celular a través de la regulación positiva de CD44 después de la pérdida de E-cadherina. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia funcional de CD44 regulación al alza de la invasión del cáncer de esófago
Visto:. Le Bras GF, Allison GL, Richards NF, Ansari SS, Washington MK, Andl CD (2011) CD44 Regulación al alza en E- cadherina-negativos cánceres de esófago resultados de invasión celular. PLoS ONE 6 (11): e27063. doi: 10.1371 /journal.pone.0027063
Editor: Adam I. Marcus, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Julio, 2011; Aceptado: 10 Octubre 2011; Publicado: 1 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Le Bras y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. CDA es el destinatario de un Premio Académico de Investigación de la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA) /Fundación para la Salud Digestiva y Nutrición (FDHN) y apoyada por los Institutos nacionales de Salud (DK075379). Queremos agradecer a la inmunohistología Core y la translación Núcleo de la Universidad de Vanderbilt para seccionar y tinciones IHC, y otras instalaciones básicas apoyados a través de la Enfermedad Centro Digestivo Investigación (P30-DK058404) y la concesión de Vanderbilt Ingram Cancer Center de Apoyo (P30-CA068485). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CD44, o grupo sanguíneo indio, es una glicoproteína transmembrana y un receptor para el ácido hialurónico (HA), un componente principal de la matriz extracelular [1]. CD44 juega un papel importante en la integridad del tejido y está implicado en múltiples funciones asociadas con la progresión del cáncer, tales como la migración celular [2], la resistencia a la apoptosis [3] y la presentación de los factores de crecimiento y proteasas [4], [5]. Además, CD44 se ha identificado como un marcador específico de las células madre de cáncer [6], [7] y de las células tumorales se someten a una transición epitelial-mesenquimal (EMT) -como proceso [8]. Diferentes isoformas se traducen debido a corte y empalme alternativo de los exones 6-15 [9]. La forma estándar de CD44 (CD44s) se cree que está expresado de forma ubicua, mientras que algunas formas variantes, CD44v, se han asociado con la metástasis [10].
Un paso importante de la EMT es la pérdida de E-cadherina. E-cadherina es un componente clave de las uniones adherentes y media la adhesión celular mediante la interacción con las proteínas citoplasmáticas ß-catenina [11] y p120 [12]. uniones adherentes están conectados al citoesqueleto de actina a través de enlazadores citoplasmáticos tales como α-catenina [13]. E-cadherina puede ser reprimida transcripcionalmente a través snail1, Snail2, Twist, ZEB1 y Zeb2, que puede ser regulado por TGF [14]. La estimulación de las células de cáncer de mama con resultados TGF en co-localización de la metaloproteinasa de matriz MT1-MMP y CD44 en la membrana celular e induce la escisión de CD44 resulta en altos niveles de CD44 soluble [15]. Por el contrario, la interacción entre el hialuronano y CD44 modula el tráfico del receptor TGF, que se puede regular la señalización TGF [16].
Durante EMT, las células epiteliales marcadores expresa tal como CD44, que se sabe que se expresa en las células madre de cáncer [ ,,,0],8]. La activina A se ha demostrado que es un regulador clave de la stemness [17]. Activina A, un miembro de la superfamilia TGF, también se ha descrito que afecta el desarrollo, hematopoyesis y la tumorigénesis [18] - [24]. Por lo tanto, queríamos determinar si la activina A induce EMT en las células esofágicas y de este modo enlaces de la inducción de la invasión de células de activina A y la expresión de CD44.
Hemos demostrado previamente la pérdida coordinada de E-cadherina y TGF-receptor II (TGFβRII) en el carcinoma de esófago [25]. Otros informes han indicado la importancia de CD44 en carcinoma escamoso de esófago demuestra una mayor expresión de CD44v6 [26], [27], pero su impacto en la invasión tumoral sigue siendo controvertido. Por lo tanto, el objetivo fue estudiar la expresión de CD44 en epitelio escamoso esofágico
in vivo
y
in vitro
. En el presente estudio muestran que la regulación positiva de CD44 se asocia con la pérdida de E-cadherina en los tejidos tumorales esofágicos primarios y líneas celulares de cáncer. Funcionalmente, se demuestra que la activina A en ausencia de señalización de E-cadherina puede regular positivamente CD44. Por otra parte, CD44 anclas de MMP-9 en la parte delantera invasivo se traduce en aumento de la invasión celular. Estos resultados tienen implicaciones importantes para un nuevo papel de activina A en la inducción de la EMT a través de la regulación positiva de CD44.
Métodos
Cultivo de células
células epiteliales esofágico primario (queratinocitos) de esófago humano normal se establecieron como se ha descrito anteriormente [25]. En resumen, se utilizaron los sobrenadantes que contienen pFB-neo retrovirus que codifica ya sea de longitud completa de E-cadherina o un mutante dominante negativo de E-cadherina que carece de la cola citoplasmática (designado como CE) para la transfección de hTERT-inmortalizado, pero no transformadas, las células epiteliales del esófago [28]. Empty pFBneo se utilizó como control. Además, un mutante dominante negativo de TGFβRII (un regalo del Dr. H. Moisés, Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN), subclonado en pBABE puro, se utilizó para generar células ECdnT y puro pBABE vacío como control. De longitud completa de E-cadherina en pFBneo también se utiliza para restaurar la expresión de E-cadherina en las células FLO-1 TE-8 y. fibroblastos fetales esofágicas se cultivaron en DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las líneas de esófago carcinoma de células escamosas, células TE, fueron una especie de regalo de los Dres. Rustgi y Nakagawa (Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA). líneas celulares de adenocarcinoma esofágico OE33, FLO-1 y SK-GT-4 [29] - [31] y las líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello JHU-012 y JHU-013 se desarrolló a partir de la cabeza primaria y el carcinoma de células escamosas del cuello en la División del cáncer de cabeza y cuello de Investigación de la Universidad Johns Hopkins
.
Para la inhibición de la e-cadherina, las células se sembraron a una densidad de 2 x 10
5 células por pocillo en una placa 6- así. Después de 24 horas, el medio se cambió a DMEM libre de suero y las células fueron transfectadas con una concentración final de 10 nM siRNA usando transfección con fosfato de calcio (400 l de agua de RNasa libre se mezcló con 50 l 2.5 M CaCl
2, 50 l de 2 M siRNA con 500 l de HBSP2x (NaCl 280 mM, NA 1,5 mM
2 PO
42H
2O, glucosa 12 mM, KCl 10, 50 mM HEPES pH7.05 en 500 ml RNasa agua libre)). siRNA se obtuvieron de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA), Hs-CDH1_12 (SI1) y Hs_CDH1_13 (SI2) se utilizaron contra E-cadherina y de AllStars negativos, se utilizaron silenciamiento no sondas siRNA para el control (ctrl). Para la estimulación, 20 ng /ml de activina A (amperios I +; D, Minneapolis, MN) se añadió a la cultura
microarrays de tejidos
esofágicas tejidos de carcinoma escamoso se adquirieron a través de la cirugía en el Okayama. hospital universitario, hospital Kitano y el hospital de la Universidad de Pennsylvania a través de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN). Todos fueron diagnosticados patológicamente como carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) [32]. Además, una matriz de tejido comercial para la CECA, AccuMax Array (ISU ABXIS, Co., distribuido por Accurate Chemical & amp; Scientific Corp., Westbury, NY) que contiene parafina fijo 80 esofágico formalina cáncer escamoso incorporado (FFPE) los tejidos de 40 pacientes y 4 controles normales se utilizó para la tinción immunhistochemical. En conjunto, los datos podrían ser recogidos para 166 muestras de tumores epidermoides, 2 casos con la progresión de la normalidad, el carcinoma
In situ
de la CECA, y los controles de tejido normal adicionales.
El cien-y- treinta y tres muestras FFPE esófago adenocarcinoma (EAC) se analizaron después de la tinción inmunohistoquímica. Estas muestras se obtuvieron de los archivos de los departamentos de patología en la Universidad de Vanderbilt (Nashville, TN, EE.UU.), Universidad Otto-von-Guericke (Magdeburg, Alemania) y de la CHTN [33]. de diagnóstico histopatológico de esófago, displasia y adenocarcinoma de esófago de Barrett se verificó a partir de H & amp; E-manchado secciones de acuerdo con la clasificación de Viena de las neoplasias epiteliales gastrointestinales [34]. tinción inmunohistoquímica se realizó usando anticuerpo anti-pan CD44, F10-44-2 clon, y E cadherina anti-anticuerpo, clon 36. Expresión anotó en una escala de 0 a 3 con 0 estar ausente, y 3 siendo la intensidad de señal más alto , se registró la localización y membranosa o citoplásmica de la tinción. Las muestras con puntuaciones de 1 o superior y con localización membranosa se consideraron positivos. Para las señales positivas de análisis estadístico, independientemente de la intensidad se consideraron positivos y puntuaciones inferiores a 1 como negativo y estadísticamente analizados usando 2 × 2 tablas de contingencia y la prueba exacta de Fisher.
fueron cultivadas cultivo organotípicos
Los cultivos organotípicos como se describe anteriormente [25]. En las células humanas, breves esofágicas epiteliales (queratinocitos) se sembraron sobre una capa de 03:01 colágeno I /matrigel con 7,5 × 10
4 fibroblastos fetales humanos esofágicas embebidos. Colágeno I fue adquirido de organogénesis (Canton, MA) y Matrigel matriz de BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ). En el día 11, los cultivos se elevan a una interfaz de aire-líquido para inducir la diferenciación del epitelio. Los cultivos se recogieron en el día 15 y, o bien se fijaron en formaldehído al 10% (Fisher, Pittsburg, PA) para la inclusión en parafina o directamente integrados en Tissue-Tek O.C.T. compuesto (VWR, Batavia, IL) para las secciones congeladas.
invasión celular Ensayos
Invasión ensayos se realizaron como se describe anteriormente [25] utilizando 8 micras de tamaño de poro cámaras de invasión Matrigel Biocoat FluoroBlok (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ). Las células epiteliales (5 × 10
4 por cámara) fueron sembradas en los insertos transwell y las células invasoras teñidas con calceína AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) después de la incubación durante la noche. La activina A se añadió con una concentración de 20 ng /ml como un quimioatrayente. La invasión se cuantificó usando el lector de placas con varios modos de Synergy HT (Bio-Tek, Winooski, VT). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron dos veces. Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Hombre y Whitney se llevó a cabo para el análisis estadístico.
Los anticuerpos
CD44 Hermes-III (una especie de regalo del Dr. Ellen puro, Wistar Institute, Filadelfia, PA) se utilizó para inmunofluorescencia sobre congelada secciones; clon anti-CD44 2C5 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) para Western Blot; CD44 F10-44-2 y α-tubulina (Abcam, Cambridge, MA) fueron utilizados para inmunohistoquímica en FFPE y Western Blot, respectivamente; E-cadherina adquirido de BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ), β-actina y αSMA clon 1A4 fueron ambos adquiridos de Sigma (Saint Louis, MO), anti-MMP-9 de Calbiochem (EMD Chemicals, Rockland, MA); S100A4 es de Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA) y vimentina V9 clon de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
La inmunohistoquímica se realizó con el Vecta Elite kit (vector Laboratories, Burlingame, CA) siguiendo el protocolo del fabricante usando sus reactivos. El anticuerpo primario se incubó durante la noche a 4 ° C y el anticuerpo secundario durante 30 minutos a 37 ° C. A continuación, la señal se ha desarrollado utilizando el kit de sustrato para la peroxidasa DAB. Para la tinción de inmunofluorescencia, se detectó un anticuerpo secundario biotinilado usando de Texas-Red-estreptavidina o FITC-etiqueta anticuerpo secundario. Las secciones teñidas se montaron con DAPI que contiene medio de montaje.
Zymography e in situ zimografía
El medio condicionado de cultivo organotípico crecido bajo condiciones libres de suero durante 48 horas se separaron en un gel de acrilamida al 10% que contiene la gelatina a 4 ° C. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R250 para 2 horas y el exceso de coloración se eliminó con tampón destain (ácido acético 10% 20% de metanol). Las imágenes fueron tomadas con el Gel Doc ™ XR (Bio Rad, Hercules, CA).
Porque en zimografía in situ, DQ-gelatina conjugado con fluoresceína (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA) se resuspendió en 1 ml de agua desionizada a una concentración de 1 mg /ml. 100 ug /ml DQ-gelatina se utiliza para superponer 5 micras secciones congeladas de grosor de cultivos organotípicos durante 18 horas a 37 ° C. La señal de fluoresceína en las secciones Se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Thornwood, NY).
Western blotting
transferencias Western se realizaron como se describe antes [35]. Los experimentos se repitieron al menos dos veces.
Resultados
tumores esofágicos primarios humanos muestran una expresión inversa de E-cadherina y CD44
Para determinar el papel de CD44 en la invasión de células del esófago y EMT, se realizó la tinción inmunohistoquímica de e-cadherina y CD44 en microarrays de tejidos de 166 carcinoma de células escamosas (SCC) y 131 adenocarcinomas. Durante dos pacientes con esófago de RCS, muestras que representan la progresión de normal a carcinoma de
In situ gratis (CIS) y, posteriormente, la CECA (fig. 1A a 1C), se observó un aumento gradual de la expresión de CD44. En general, E-cadherina se limita en gran medida a las zonas con la expresión de CD44 baja o ausente en el epitelio normal (Fig. 1D, E) y 20 de los 166 tumores. Para SCC de esófago, se observó la regulación positiva de CD44 en ausencia de E-cadherina en el 54% de los tumores (90 de los 166 tumores). Juntos, 110 de 166 (66%, p & lt; 0,02) de nuestras muestras clínicas muestran esta relación inversa de E-cadherina y CD44. muestras de adenocarcinoma de esófago mostraron una correlación inversa de E-cadherina y la expresión de CD44 en 63 de 131 muestras (48%), con 41 muestras que tienen sustancial E-cadherina, pero ninguna expresión de CD44. Veintidós muestras habían incremento en la expresión de CD44 y son negativas para la E-cadherina. Tomados en conjunto, muestran una disminución significativa (p & lt; 0,05) estadística correlación inversa para la expresión de E-cadherina y CD44. Imágenes de coloraciones de inmunohistoquímica representativas de los tejidos tumorales que demuestran la asociación de E-cadherina y CD44 se muestran en la Fig. 1 F-I.
IHC con espectáculos de anticuerpos anti-CD44 aumento de la expresión CD44 durante la progresión de la normal (A) a carcinoma
in situ,
CIS (B), y el tumor (C). Anticuerpo contra cadherina E y CD44 muestran la expresión de E-cadherina (D) y en ausencia de CD44 (E) en el epitelio normal. En los tejidos de la CAO con la expresión de E-cadherina retenido (F, la línea de trazos negro) la señal de CD44 es baja (G). (H) La pérdida de E-cadherina se asocia con una señal intensa para CD44 (I). La barra de escala es de 50 micras.
líneas celulares de cáncer de esófago E-cadherina-negativas mostrar una mayor expresión de CD44
Para investigar la correlación inversa de E-cadherina con CD44 en líneas celulares de cáncer de esófago , se analizaron las líneas de esófago carcinoma de células escamosas, de células escamosas líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello (-12 TE-1, -7, -8, -11 y) (JHU-012, JHU-013), así como el adenocarcinoma líneas celulares (FLO-1, OE33 y SK-GT-4) mediante Western Blot para la e-cadherina y la expresión de CD44, así como TGFβRII y vimentina. Mientras que la forma estándar de CD44 (CD44s) se expresa en las células mesenquimales, algunas formas variantes, CD44v, se expresan en las células epiteliales [36]. Hemos encontrado que las células de retención expresión de E-cadherina tenían niveles más bajos de estándar (85 kDa debido a la falta del exón 6-15) y la forma variante (150 kDa) de CD44. La pérdida de E-cadherina se correlaciona con el aumento de la expresión de CD44s y un aumento en la expresión de la vimentina marcador EMT (Fig. 2A). Para determinar si la restauración de la E-cadherina puede afectar a la expresión de CD44s y CD44v, transfectadas TE-8 y FLO-1 líneas celulares, ambas expresan bajos niveles de E-cadherina, con larga duración de E-cadherina. Tras la restauración de la expresión de E-cadherina, el nivel global de expresión de CD44 se redujo, pero la variante de la forma (epitelial) (125 kDa) se incrementó (Fig. 2B).
(A) análisis de Western Blot de escamosas de esófago líneas celulares de carcinoma (TE-1 -7, -8, -11, y -12), líneas celulares de adenocarcinoma de esófago (FLO-1, OE33, SK-GT-4) líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello (JHU-012 y, JHU-013) muestran que la expresión de e-cadherina y TGFβRII se asocia con bajos niveles de CD44, mientras que la pérdida de e-cadherina y TGFβRII se correlaciona con la regulación de CD44 y vimentina el marcador de la EMT. (B) Restauración de E-cadherina, cadE, la expresión mediante transfección retroviral de TE-8 y FLO-1 en las células en comparación con el control de vectores (neo) demuestra una disminución global de la expresión de CD44 junto con un interruptor para una mayor CD44v sobre CD44s (CD44v: CD44variant, CD44s:. estándar CD44) guía empresas
expresión de CD44 está regulada positivamente en las células epiteliales del esófago sometidos a EMT
previamente establecido un modelo para analizar los efectos de la pérdida de E-cadherina en los queratinocitos de esófago por la expresión retroviral de dominante negativo E-cadherina (CE) o dominante negativo E-cadherina en combinación con TGFβRII dominante negativo (ECdnT) [25]. Se realizó inmunohistoquímica coloraciones con anticuerpos contra cadherina E y CD44 y marcadores de EMT para dilucidar el papel de CD44 en la EMT de esófago y la invasión celular. células CE y ECdnT han upregulated expresión CD44, y la señal de CD44 positivo se localiza en gran medida a las áreas de invasión de células epiteliales en la matriz subyacente (Fig. 3). Tanto las células CE y ECdnT han aumentado los niveles de S100A4, vimentina y αSMA lo que indica que estas células son sometidos a EMT en cultivos organotípicos (Fig. 3D-F).
La inmunohistoquímica de secciones de parafina con anticuerpos anti-E-cadherina ( a), anti-TGFβRII (B) y anti-CD44 (C) muestra las células CD44-positivas en células CE y ECdnT invasoras en la matriz de colágeno /matrigel subyacente (flechas) que son negativas para la e-cadherina y TGFβRII. La tinción inmunohistoquímica para los marcadores de EMT S100A4 (D), vimentina (E) y αSMA (F) muestra un aumento de señal positiva en las células invasoras. La barra de escala es de 50 micras.
CD44 co-localiza con MMP-9 en el borde delantero de las zonas invasivas y es upregulated de activina A
Para analizar el mecanismo por el que media CD44 la invasión de células nos centramos en la activación de metaloproteinasas de la matriz, proteasas prominentes para digerir la matriz extracelular. Para visualizar la actividad de MMP en áreas de invasión que se utilizó en la zimografía in situ. áreas con fluoresceína positiva que detectan la actividad de MMP se limita a la vanguardia en las células CE y ECdnT y la invasión de células en la matriz subyacente (Fig. 4A). Los medios condicionados de cultivos organotípicos mostraron un aumento gradual de la MMP-9 y la secreción de MMP-2 y la actividad de MMP-9 en las células invasoras (Fig. 4B). MMP-9 se ha descrito como una pareja de unión de CD44 [37], [38]. El uso de doble tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra CD44 y MMP-9 se ilustra la co-localización en la superficie celular en el borde de ataque de las zonas invasivas (Fig. 4C). Para demostrar un potencial invasivo aumentado en respuesta a la activina A, un miembro de la familia TGF, la secreción de las cuales se incrementa en los cultivos organotípicos invasivas (datos no mostrados), se estimularon las células ECdnT y la línea celular de cáncer de esófago TE-11 y muestran una mayor celular invasión
in vitro gratis (Fig. 4D).
(a) Para
In situ
zimografía, áreas de actividad de MMP se destacan por una señal de fluoresceína positiva en secciones congeladas de Ecad, CE y ECdnT cultivos organotípicos. (B) La zimografía usando medio condicionado de cultivo organotípico recogido de células Ecad, CE y ECdnT ilustra aumento de la secreción de MMP-2 y MMP-9. (C) La tinción de inmunofluorescencia doble de cadE, CE y ECdnT muestra colocalización MMP-9 (rojo) con CD44 (verde) en las células invasoras. La barra de escala es de 50 micras. (D) La estimulación con activina A induce mejorada invasión de células ECdnT y TE-11 en ensayos de invasión. La comparación entre grupos se realizó mediante la prueba paramétrica hombre y Whitney no, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001. (E) Western Blot de lisados de células de TE-11 transfectadas con de AllStars células negativas no silenciar siRNA (CTRL), y células TE-11 transfectadas con siRNA contra E-cadherina (SI1, SI2) demuestra la regulación positiva de CD44 tras la estimulación con Activina A.
activina a también ha sido descrito para regular stemness [17] y la hipótesis de que CD44 como marcador de células madre podría estar bajo la regulación de la activina A. para identificar una potencial vía de señalización responsables de la regulación positiva de CD44, se analizó la línea celular de cáncer de esófago, TE-11, después de la caída de la E-cadherina utilizando siRNA. Hemos estimulado células TE-11 transfectadas con siRNA contra las células E-cadherina con activina A y analizamos la expresión de CD44. Activina A variante expresión de CD44 aumento del tratamiento en TE-11 en ausencia de cadherina E (Fig. 4E).
En su conjunto, estos datos demuestran la regulación de la expresión de CD44 por E-cadherina través de activina A y proporcionan pruebas funcionales para un papel causal en la inducción de la invasión de células.
Discusión
se demuestra la pérdida gradual de la E-cadherina se asocia con un aumento progresivo de CD44
in vitro
y
in vivo
. En ausencia de la E-cadherina, activina A puede inducir la expresión de CD44. La activina A se muestra como un regulador clave para stemness [17] y, como otros miembros de la superfamilia TGF, también se ha informado que afectan al desarrollo y la tumorigénesis [20], [22] - [24]. La sobreexpresión de activina A se ha descrito en el carcinoma de células escamosas de esófago y se asocia con un mal pronóstico. Activina A promueve la agresividad de las células tumorales por aumento de la expresión de MMP-7 y N-cadherina [22] - [24]. Aquí nos muestran que la activina A se puede regular positivamente CD44, que a su vez anclas de MMP-9 a la vanguardia e induce la invasión celular. La asociación de E-cadherina, CD44 y MMP con EMT sugiere un papel importante para la activina A en la EMT.
Hemos encontrado que la pérdida de E-cadherina se acompaña de un cambio de la expresión de la isoforma de CD44. Aunque estudios previos han demostrado que splicing alternativo de CD44 podría ser controlado a través de señalización ras para promover la expresión de formas variantes [39], Warzecha et al. Recientemente se han identificado factores de empalme epiteliales (ESRP1 y ESRP2) que promueven la expresión de CD44v para mantener el fenotipo epitelial [40]. Esos factores se pierden durante la EMT [41] - [43]. Posiblemente, la expresión de CD44 estándar es dependiente de la pérdida de ESRP1 y 2 en el carcinoma de esófago. ESRP1 y 2 expresión ha sido reconocida además estar implicados en programas de corte y empalme asociados-EMT en cáncer de mama [44]. Curiosamente, el silenciamiento de ESPR1 /2 en las células epiteliales inducidas expresión de la cadherina mesenquimales, N-cadherina, sin cambios en la expresión de E-cadherina. Por el contrario, la expresión de ESPR1 puede revertir EMT Twist-inducida en células epiteliales mamarias. Además, el factor de transcripción Twist2 contribuye a la expansión de las poblaciones de células madre similares a través de regulación a la baja de E-cadherina y aumento de la expresión de marcadores de células madre tales como CD44 [45].
En conjunto, hay múltiples mecanismos por el que las isoformas de CD44, todos comparten el mismo dominio citoplásmico, puede inducir EMT, muchos de los cuales implican la interacción del dominio extracelular con el microambiente. CD44 puede actuar como un co-receptor para c-Met, y es el receptor de buena fe para el ácido hialurónico, que puede promover EMT [9]. E-cadherina regula negativamente la interacción de CD44 con ácido hialurónico que resulta en una supresión de la invasión tumoral y la célula de la morfogénesis [46] de ramificación. Mostramos aquí que la pérdida de expresión de E-cadherina se correlaciona con la forma CD44s y la inducción de un fenotipo invasivo.
Hemos demostrado anteriormente que la invasión de los queratinocitos esofágicas que carecen funcional E-cadherina y TGFβRII estaba mediada por la catepsina B [35]. Catepsina B puede ser activado en un ambiente ácido iniciada por la interacción de CD44 con un Na + -H + intercambiador de [37]. Si bien el aumento de los resultados de actividad de la catepsina B en la activación de TGF [35], MMP-9 también pueden activar TGF [47] que une los datos presentados aquí con nuestro estudio anterior. señalización paracrina TGF activa los fibroblastos, y también induce la formación de capilares [48]. Estas observaciones ponen de relieve la importancia de la diafonía epitelio-mesenquimal en la tumorigénesis
.
En conclusión, se muestra que la regulación positiva de CD44 se asocia con la pérdida de E-cadherina en el carcinoma de esófago y que CD44 promueve la MMP-9 invasión tumoral mediada .
Reconocimientos
también nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Beauchamp, los Dres. Deane y Beauchamp, y el Dr. Anil K. Rustgi y el Departamento de Bioestadística de Vanderbilt útil para los debates.