Extracto
La mayoría de los cánceres de endometrio puede ser clasificado histológicamente como endometrioide, serosa, o de células claras. cánceres endometriales no endometrioide (NEECs; células serosas y claras) son los más clínicamente agresivo de los tres principales histotypes y se caracterizan por la aneuploidía, una característica de la inestabilidad cromosómica. Las alteraciones genéticas que subyacen a la inestabilidad cromosómica en el cáncer de endometrio, son poco conocidos. En el presente estudio, se utilizó la secuenciación de Sanger para buscar variantes de nucleótidos en los exones de codificación y uniones de empalme de 21 genes candidatos de inestabilidad cromosómica, incluyendo 19 genes implicados en la cromátida hermana de cohesión, a partir de las 24 primarias, NEECs microsatélites estables. Las mutaciones somáticas se verificaron por secuenciación de ADN emparejados normales. Estamos posteriormente resequenced genes mutados de 41 NEECs adicionales, así como 42 EC endometrioide (Ingeniería Eléctrica e Informática). Hemos descubierto mutaciones somáticas no sinónimas en
ESCO1
,
CHTF18, España y
Hoteles en MRE11A, respectivamente, 3,7% (4 de 107), 1,9% (2 de 107), y 1,9% (2 de 107) de los tumores endometriales. En general, 7,7% (5 de 65) de NEECs y 2,4% (1 de 42) de EECs habían mutado somáticamente uno o más de los tres genes. Un subconjunto de mutaciones se predice que afectar la función de la proteína. La co-ocurrencia de mutaciones somáticas en
ESCO1
y
CHTF18
fue estadísticamente significativa (
P = 0,0011
, de dos colas prueba exacta de Fisher). Este es el primer informe de mutaciones somáticas dentro de
ESCO1
y
CHTF18 Hoteles en tumores de endometrio y de
MRE11A
mutaciones en los tumores endometriales microsatélites estables. Nuestros resultados justifican los futuros estudios para determinar si estas mutaciones son eventos de controlador que contribuyen a la patogénesis del cáncer de endometrio
Visto:. Precio JC, Pollock LM, Rudd ML, Fogoros SK, Mohamed H, Hanigan CL, et al . (2013) La secuenciación de genes de inestabilidad candidato cromosómicas en los cánceres de endometrio revela mutaciones somáticas en
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A
. PLoS ONE 8 (6): e63313. doi: 10.1371 /journal.pone.0063313
Editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: December 20, 2012; Aceptado: April 1, 2013; Publicado: Junio del 3, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue financiado, en parte, por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano en los NIH (DWB, JCM); NIH subvención CA016519 (PH); Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) subvención RP-38096 (PH); Consejo de Investigación de Salud de Manitoba (MHRC) subvención (KJM); premio CIHR /MHRC RPP Nueva Investigador (KJM); U01 CA113916 y R01 CA140323 (AKG); NIH RO1-1CA112021-01 (DCS); La espora del NCI en el cáncer de mama en el Hospital General de Massachusetts (DCS); y la Fundación Avon (DCS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer uterino es la neoplasia ginecológica más comúnmente diagnosticado en los Estados Unidos y es la octava causa de muerte por cáncer entre las mujeres estadounidenses [1]. Los cánceres de endometrio (EC) representan la gran mayoría de los cánceres uterinos. Endometrioide, serosa, y carcinomas de células claras representan los tres principales subtipos histológicos de EC. Cada subtipo surge de lesiones precursoras distintas, tiene conductas clínicas distintas etiologías y moleculares distintas [2], [3].
endometrioideo EC (EEC) son tumores dependientes de estrógenos asociados con un pronóstico favorable en general demuestra un 5 -Año tasa de supervivencia relativa de ~ 90% [4]. En contraste, las células serosas y claras EC (EC no endometrioide (NEECs)) son clínicamente, tumores estrógeno-independiente agresivos con 5 años las tasas de supervivencia relativa de sólo el 44% y 65%, respectivamente [4]. NEECs contribuyen de manera desproporcionada a la mortalidad por EC. En un estudio basado en la población de endometrioide, serosa, y EC de células claras dentro de los Estados Unidos de Vigilancia de Epidemiología y Resultados Finales (SEER) del programa (1988-2001), NEECs representó el 47% de las muertes a pesar de que constituyen sólo el 13% de los diagnósticos [5].
EECs y NEECs muestran distintos modos de inestabilidad genómica. EECs tienden a ser diploides o casi diploide pero con frecuencia exhibir inestabilidad de microsatélites (MSI) [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Por el contrario, NEECs son frecuentemente aneuploides, o cromosómicamente inestable, pero muestran MSI sólo en raras ocasiones [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
MSI refleja un fenotipo mutador resultante de reparación de genes defectuosos (revisado en [18]). En los cánceres endometriales esporádicos, la mayoría de los casos de MSI se explican por la hipermetilación del promotor de MLH1, MSH2 pérdida de la expresión, o mutaciones somáticas en
MSH6
(revisado en [19]). La aneuploidía se ha sugerido recientemente que el resultado de un proceso paso a paso que resulta de una tolerancia adquirida para un genoma no diploide, a través de la inactivación de la vía p53, así como el cromosoma aberrante segregación [20]. A pesar de que la inactivación de las mutaciones en
TP53
y la estabilización de la proteína p53 son frecuentes en NEECs, que ocurre hasta en el 90% de los tumores serosos (revisado en [19]), la base genética del cromosoma missegregation en NEECs sigue siendo poco conocida.
en la levadura, el cromosoma missegregation puede surgir de mutaciones en los genes que regulan la cohesión de cromátidas hermanas [21], [22]. Mitótico cromátida hermana de cohesión se refiere a la conexión física entre cromátidas hermanas replicados por el complejo de proteínas cohesinas hasta anafase, para asegurar la segregación fiel de cromátidas hermanas en células hijas. En
S. cerevisiae
, el complejo de cohesina consiste en la SMC1, Smc3, la Scc1, y subunidades SCC3 y se carga en la cromatina en el final de G1 por un proceso que requiere la Scc2-SCC4 complejo [23], [24], [25 ]. establecimiento cohesión posterior depende de la acetilación de Smc3 por la acetiltransferasa Eco1 [26], [27], [28], así como las actividades de Chl1 y el factor de replicación alternativa C (Rfc) complejo CTF18-Ctf8-DCC-Rfc [ ,,,0],21], [29]. establecimiento de Cohesión es antagonizado por las actividades de la Wpl1-Pds5 complejo y el complejo Elg1 RFC [30], [31]
.
Las proteínas que regulan la cohesión de cromátidas hermanas están muy conservadas durante la evolución. En células de mamíferos, el complejo de cohesina mitótico está formado por SMC1A (hSmc1), SMC3 (hSmc3), RAD21 (hScc1), y SA1 /SA2 (hScc3). loading Cohesin depende de NIPBL (hScc2) y MAU2 (hScc4) (revisado en [32]). establecimiento de Cohesión requiere la acetilación de SMC3 por las acetiltransferasas ESCO1 y ESCO2 [33] y también está regulada por el complejo CHTF18-RFC [34] y por DDX11 (hChl1) [35], [36].
No es un creciente cuerpo de evidencia que implica la alteración mutacional de los genes de cohesión de cromátidas hermanas en el cáncer humano. supresiones somáticas y mutaciones de varios genes que regulan la cromátida hermana de cohesión se han descubierto recientemente en el cáncer colorrectal, sarcoma, glioblastoma, melanoma, leucemia mieloide aguda y enfermedades mieloides de Ewing [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Hemos descrito previamente somáticas mutaciones de pérdida de función de
ATAD5 Hoteles en los cánceres de endometrio [44]. ATAD5 es el ortólogo humano de
S. cerevisiae
Elg1, que forma un complejo RFC-como que participa en la cohesión de cromátidas hermanas [45], [46].
En el presente estudio, hemos tratado de determinar si los genes de cohesión adicional hermana cromátidas son somáticamente mutado en tumores de endometrio. Nos resequenced los ortólogos humanos de los 19 genes implicados en la regulación de la cohesión de cromátidas hermanas, así como los genes adicional segunda de inestabilidad cromosómica candidato (CIN), a partir de las 24 NEECs primarias. Los genes mutados se secuenciaron posteriormente de 83 tumores de endometrio adicionales. Nuestro estudio descubrió mutaciones somáticas no sinónimas en
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A
en un subgrupo de tumores de endometrio humano.
Materiales y Métodos
Ética declaración
el NIH Oficina de sujetos humanos de investigación determinó que esta investigación no era "la investigación con sujetos humanos" por la Regla Común (45 CFR 46), y por lo tanto que no era necesaria la revisión del CEI para la secuenciación de las muestras anónimas en este estudio.
muestras clínicas
anónimo, de los tejidos tumorales endometriales primarios (45 20 células claras, y 42 endometrioid serosas,) y emparejaron los tejidos histológicamente normales se obtuvieron de la Cooperativa Red de Tejidos humanos, o desde el repositorio muestras biológicas en el Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA. Seis casos de tumor emparejados y los ADN normales se obtienen de Oncomatrix. Todos los tejidos tumorales se recogieron antes del tratamiento. Un hematoxilina y eosina (H & amp; E). Sección teñida de cada muestra de tumor fue revisado por un patólogo para verificar la histología y para delinear las regiones de tejido con un alto contenido de células tumorales (≥70%)
aislamiento de ácidos nucleicos y identidad pruebas
ADN genómico se aisló de tejido macrodissected utilizando el kit Puregene (Qiagen). Emparejados, los ADN de tumor normal fueron genotipo utilizando el kit de Coriell Asignación de identidad (Coriell) según las instrucciones del fabricante. fragmentos de genotipificación se separan tamaño en un ABI-3730
xl
analizador de ADN (Applied Biosystems) y alelos fue evaluado utilizando GeneMapper (Applied Biosystems).
Identificación de genes ortólogos
se identificó una lista consolidada de ortólogos humanos conocidos y candidatos de estabilidad de los genes del cromosoma de levadura (con funciones demostradas en cromátida hermana de cohesión) a través de enfoques de especies cruzadas estándar. En pocas palabras, InParanoid 7 y las bases de datos HomoloGene se les preguntó para identificar ortólogos conocidos, mientras que BLASTp se empleó para identificar los candidatos de la tapa-hit (basado en E-valor) de las secuencias de proteínas no redundantes dentro de la
Homo sapiens
base de datos .
PCR transcriptasa inversa (RT-PCR)
ARN total fue extraído de 5 endometrioide y 2 líneas celulares de cáncer de endometrio serosas utilizando el reactivo Trizol (Ambion). Una mezcla total humano disponible en el mercado de control de ARN (Applied Biosystems) se utilizó como control positivo. la síntesis de ADNc se realizó en 1 g de ARN total con el kit de archivo cDNA de alta capacidad usando hexámeros aleatorios (Applied Biosystems). ADNc (0.2μl) fueron amplificados por PCR utilizando los pares de cebadores proporcionados en la Tabla S1. La amplificación consistió en 40 ciclos utilizando los siguientes parámetros: 94 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, con una etapa de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio en 0,5 x tampón TAE y se visualizaron bajo iluminación ultravioleta.
Líneas celulares y análisis de transferencia de Western
líneas celulares de cáncer de endometrio serosos (ARK1 y ARK2) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Alessandro Santin (Escuela de Medicina de Yale). líneas celulares de cáncer de endometrio endometrioide (RL-95-2, HEC1A, HEC1B, ANC3A) y una línea celular derivada de un adenocarcinoma de endometrio pobremente diferenciado (KLE) se obtuvieron de la American Type Culture Collection, o el repositorio línea celular NCI Programa de Terapéutica del Desarrollo . Las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato seguido por lisis en tampón RIPA enfriado con hielo (Thermo Scientific) que contiene 1 mM Na-ortovanadato, mM NaF 10, y cóctel inhibidor de la proteasa 1X (Roche). Los lisados se centrifugaron y cantidades iguales de lisado aclarado se desnaturalizaron a 95 ° C en 2 x tampón de muestra de SDS (Sigma) antes de la SDS-PAGE y transferencia a membranas de PVDF (Bio-Rad). Los anticuerpos primarios y secundarios conjugados con HRP fueron: αMRE-11 (Señalización Celular), αCHTF18 (Novus Biológica), αESCO1 (Novus Biológica), α-α /β-tubulina (Señalización Celular), HRP de cabra anti-ratón (Señalización Celular) , y de cabra anti-conejo HRP (Cell Signaling). Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (Pierce).
Diseño del cebador y la amplificación por PCR
Los pares de cebadores fueron diseñados, utilizando métodos publicados [47], para orientar el 97,4% (458 de 470) de todos los exones de los 21 genes en la pantalla de detección de mutación (Tabla S2), y todos los exones de los tres genes en la pantalla prevalencia mutación (Tabla S3). Las condiciones de PCR están disponibles bajo petición.
secuenciación de nucleótidos
Los productos de PCR fueron sometidos a bidireccional, secuenciación de Sanger utilizando cebadores M13 y el BigDye Terminator Versión 3.1 Ciclo de Secuenciación Kit (Applied Biosystems). Las reacciones de secuenciación se realizaron en 3730 ABI
xl
analizadores de ADN (Applied Biosystems). la calidad de traza secuencia se evaluó con el programa Base de llamada, Phred [48], [49]. Todos los rastros fueron incluidos en el análisis posterior, ya que los polimorfismos de inserción-deleción pueden imitar datos de mala calidad de una medida de Phred calidad, pero pueden contener datos de secuencia válidos. Todas las secuencias de un par de cebadores dado fueron ensambladas utilizando Consed [50]; amplımeros superpuestas fueron montados por separado para permitir independiente de validación cruzada de las llamadas en las regiones superpuestas. Variantes de secuencia, incluidas las diferencias de un solo nucleótido y corto (& lt; 100 pares de bases) inserciones y deleciones, se identificaron utilizando PolyPhred v6.11 [51] y un algoritmo (DIPDetector) en el local optimizado para la mejora de la sensibilidad en la búsqueda de las inserciones y deleciones de datos de rastreo alineados. DIPDetector análisis de trazas de secuenciación Sanger y predice las inserciones y deleciones mediante el examen de las alineaciones primera lectura para obtener homocigotos variantes. A continuación busca firmas de inserciones y supresiones heterocigotas dentro de la salida de la Phred basecaller ejecutar con la opción - poli [49]. Después de formar dos vectores que contienen las bases con áreas de los picos más altos en cada posición de la lectura (o asignar el pico zona más alta para ambos vectores cuando el pico segundo más grande tiene un área de menos de 10% del tamaño del pico más grande), los intentos DIPDetector a fase de estos vectores mediante la inserción de los cambios potenciales de todos los tamaños posibles en todas las posiciones posibles de la lectura, y las puntuaciones de estos cambios de acuerdo a qué tan bien la resultante cambió de vectores se ajustan a las bases observadas dentro de la traza. genoma humano hg18 montaje (NCBI Build 36.1) se utilizó como la secuencia de referencia. posiciones variantes fueron referencia cruzada con dbSNP entradas (Build 129) para identificar polimorfismos conocidos. Para determinar si nuevas variantes eran mutaciones somáticas o polimorfismos de la línea germinal, el ADN tumoral apropiada y el ADN normal correspondiente se re-amplificación en una PCR independiente seguido por análisis de la secuencia de la posición variante. Se evaluó el impacto previsto de mutaciones somáticas en función de las proteínas
in silico usando
liberar Mutación Evaluador 2 (http://mutationassessor.org/), SIFT (http://sift.jcvi.org/), y Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml).
Cálculo de pantalla de detección de potencia
La potencia estimada para detectar una mutación en un gen conjunto de 24 tumores es 1- (1-X)? 24, donde X es la fracción real de los tumores con una mutación en ese gen.
resultados y Discusión
en una pantalla de descubrimiento de mutación , se analizaron 24 NEECs primarios para la presencia de variantes de nucleótidos dentro de los exones de codificación y uniones de empalme de genes de inestabilidad cromosómica 21 candidatos, que se expresan, en diferentes niveles, en líneas celulares de cáncer de endometrio (Figura S1). Diecinueve de estos genes están implicados en la regulación de la cohesión de cromátidas hermanas, en base a su homología de secuencia con genes de cohesión en
S. cerevisiae
(Tabla 1). Los 24 NEECs consistieron en 17 EC serosas y 7 de células claras EC; cinco de los tumores serosos (T33, T45, T65, T69, T70) fueron sometidos recientemente a la secuenciación del exoma [52]. Se incluyeron solamente los tumores MSI-estables en la pantalla de detección; los datos de MSI se han reportado en otras partes [52].
Se obtuvieron los datos de secuencia de alta calidad para el 87,6% (5,64 Mb) de bases (6,44 Mb) dirigidos. Después de excluir las variantes que fueron anotados como polimorfismos de nucleótido único (SNP) dentro de dbSNP (Build 129), había 109 variantes de nucleótidos únicos que representaban posibles mutaciones somáticas. Para determinar si estas variantes eran mutaciones somáticas o variantes de la línea germinal, que volvió a amplificar y secuenciado las posiciones variantes de la DNA tumor apropiado y el ADN normal correspondiente. Tres variantes fueron
hueso fide mutaciones somáticas
, presentes en el ADN del tumor pero ausente en el ADN normal correspondiente. Los genes mutados somáticamente fueron
ESCO1 gratis (establecimiento de la cohesión 1 homólogo 1 (
S. Cerevisiae
)),
CHTF18 (
cromosoma transmisión fidelidad factor de 18 homólogo (
S. cerevisiae
)), y
MRE11A gratis (meióticas recombinación homólogo de 11 A (
S cerevisiae
)).; cada gen se muta en 4% (1 de 24) de NEECs en la pantalla de descubrimiento. Aunque no se encontraron pruebas de mutaciones somáticas en los genes CIN 18 candidatos restantes, es importante reconocer que la pantalla de nuestro descubrimiento tiene poder suficiente para detectar todas las mutaciones somáticas presentes en NEECs. Estimamos que en una pantalla de 24 NEECs, el poder de detectar los genes que están mutados somáticamente en el 5%, 10% o 15% del total de NEECs es de 71%, 92% y 98%, respectivamente.
Seguidamente, trató de determinar con mayor precisión la frecuencia y el espectro de mutaciones somáticas en
ESCO1, CHTF18, España y
MRE11A
en el cáncer de endometrio. Para ello, hemos realizado una pantalla de prevalencia en el que resequenced los exones de codificación y sitios de empalme de los tres genes de otros 28 tumores serosos, 13 tumores de células claras, y 42 tumores endometrioide, no seleccionados para el estado de MSI.
en las pantallas de descubrimiento y prevalencia combinada, hemos descubierto mutaciones somáticas no sinónimas dentro de
ESCO1
,
CHTF18
, y
Hoteles en MRE11A, respectivamente, 3,7% (4 de 107) , 1,9% (2 de 107) y 1,9% (2 de 107) de los tumores de endometrio (Tabla 2 y Figura S2). En general, 7,7% (5 de 65) de NEECs y 2,4% (1 de 42) de EECs tenían mutaciones somáticas en uno o más de los tres genes. En comparación con conocidos genes del cáncer de consenso con roles establecidos en el cáncer de endometrio, y mutado de manera significativa los genes del cáncer,
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A
se mutaron con poca frecuencia (Figura S3 , figura S4, Figura S5) [44], [52], [53], [54], lo que sugiere que estos tres genes son los genes controladores patógenos o bien raros de cáncer de endometrio o que son genes no patógenos que han adquirido mutaciones de pasajeros . Inmunotransferencia confirmó la expresión de MRE11A y CHTF18 en el panel de líneas celulares de cáncer de endometrio (Figura S6); ESCO1 se expresó de forma variable entre estas mismas líneas celulares.
ESCO1, España que codifica una acetiltransferasa lisina que es esencial para el establecimiento de la cohesión de cromátidas hermanas en células de mamífero, se mutó en somáticamente 2,2% (1 de 45) de serosa ECs, 10% (2 de 20) de células claras ECs, y 2,4% (1 de 42) de endometrioide ECs. Dos de los
ESCO1
mutaciones se prevé que afectar la función de la proteína. El ESCO1
mutante R786C missense, dentro del dominio acetiltransferasa, se prevé que afectará la función de proteínas tanto por el SIFT y algoritmos PolyPhen (Tabla 2). Los autores especulan que la ESCO1
E338X mutante sin sentido, lo que hemos descubierto en una serosa-CE, puede ser una pérdida de la función mutante ya que una proteína producida por este alelo sería prematuramente truncada y dejar de incluir el dominio acetiltransferasa. Por otra parte, la descomposición mediada por el antisentido de la
ESCO1
E338X Versión taquigráfica podría conducir a la haploinsuficiencia.
CHTF18
fue mutado somáticamente en 2.2% (1 de 45) de EC serosas y 2.4% (1 de 42) de los EC endometrioide. En las células humanas, el complejo CHTF18-RFC regula la acetilación de la SMC3 la cohesión de la subunidad por ESCO1 y ESCO2 acetiltransferasas [34], lo que contribuye a la creación de la cohesión de cromátidas hermanas. El complejo CHTF18-RFC también ha sido implicado en la estimulación de la actividad η ADN polimerasa, y en el reclutamiento de la ADN polimerasa ε a los sitios de síntesis de reparación del hueco de llenado de [55], [56]. Ambos de los mutantes CHTF18 que hemos descubierto en el cáncer endometrial localizar a la carboxi-terminal de la proteína (Figura 1), dentro de una región (residuos 576-876) que media la unión a RFC2-5 [57]. El CHTF18
mutante R854W se prevé que afectará posiblemente la función de proteínas por la mutación del asesor y filtrar algoritmos (Tabla 2). Curiosamente, la mayoría de los
CHTF18
mutaciones observadas en otros tipos de cáncer también se localizan en el extremo C-terminal de la proteína codificada [58]. Estas observaciones plantean la posibilidad de que las mutaciones sin sentido somáticas en el C-terminal de CHTF18, encontraron aquí y en otros tipos de cáncer, podrían perturbar la interacción CHTF18-RFC.
mutaciones somáticas individuales están indicados mediante cuadrados (mutaciones sin sentido) o diamantes (mutaciones de cambio de sentido). posiciones de dominio se derivan de [65], [66], [61], [59], [67]. GAR: glicina-arginina-ricos motivo; RBD: RAD50 dominio de unión; RFC cuadro:. cuadro de replicación factor C
MRE11A
fue mutado somáticamente en el 4,4% (2 de 45) de los EC serosa. No
se observaron mutaciones MRE11A
entre los tumores de células claras o endometrioide. MRE11A posee tanto actividad endonucleasa y 3'-5 'exonucleasa y, como un componente de la MRE11A-RAD50-NBS1 (MRN) complejo, que desempeña un papel esencial en la respuesta celular al doble filamento se rompe (revisado en [59]). En células de mamíferos, también se requiere el complejo MRN para la fosforilación mediada por ATR de la subunidad SMC1 de cohesinas [60], y el agotamiento de siRNA
MRE11A
en los resultados de las células humanas en los defectos de cohesión [37]. El MRE11A
D131N mutante somática, que hemos descubierto en un CE serosa, se produce en un residuo altamente conservadas evolutivamente en el tercer motivo phosphoesterase dentro del dominio nucleasa [61] y se prevé que afectará la función de proteínas (Figura 1 y la Tabla 2 ). El MRE11A
mutante D692Y, en el dominio de unión a ADN, también se prevé que sea funcionalmente significativa (Tabla 2). Aunque las mutaciones somáticas intrónica en
MRE11A
han sido reportados en microsatélites inestable cánceres de endometrio [62], [63], [64], a nuestro entender, el presente estudio es el primer informe de mutaciones somáticas de
MRE11A
en microsatélites tumores de endometrio estables (Tabla 2). Es de destacar que la MRE11A
variante D131N, que era somática en nuestro estudio, también se ha observado como una variante rara población (TMP_ESP_11_94212851) en el Proyecto de Secuenciación Exoma NHLBI (URL: http://evs.gs.washington.edu /SVE /), con una frecuencia del alelo menor de 0,0233% en la población EuropeanAmerican.
la exclusividad mutua o co-ocurrencia de mutaciones somáticas en dos o más genes puede indicar redundancia funcional o sinergia funcional, respectivamente. Para determinar el patrón de mutaciones somáticas en los genes de cohesión en el cáncer de endometrio, se combinaron los resultados del presente estudio con nuestro análisis previo de la
ATAD5 (hELG1)
gen en esta misma cohorte de CE [44]. Aunque el número de casos es pequeño mutados, se observó que las mutaciones somáticas en
ESCO1
y
ATAD5
tendido a co-ocurren en el cáncer de endometrio (
P = 0,0102
, dos -tailed de la prueba exacta, al igual que las mutaciones somáticas en
ESCO1
y
CHTF18 gratis (
P = 0,0011)
(Figura 2 y Tabla 3) Fisher). Estas observaciones plantean la posibilidad de que podría haber una sinergia funcional entre
ESCO1
y
ATAD5
mutantes, y entre los
ESCO1
y
CHTF18
mutantes, en el endometrio cáncer. En este sentido, cabe destacar que las mutaciones somáticas en
ESCO1
y
ATAD5
tienden a co-ocurrir en tumores colorrectales (
P = 0,000001
) (Figura S7) , basado en un análisis de los datos disponibles públicamente mutación generada por el Atlas del Genoma del cáncer [http://cbio.mskcc.org/cancergenomics/]. Una alternativa, pero no se excluyen mutuamente, posibilidad es que las mutaciones concurrentes de los genes de cohesión en el cáncer de endometrio pueden reflejar un fenotipo hipermutable subyacente. previamente se evaluó la cohorte de 107 tumores en este estudio de la inestabilidad de microsatélites y
MSH6
mutaciones [44], [52], los cuales pueden dar lugar a hipermutabilidad debido a la reparación de genes defectuosos (MMR). Aunque tres de los tumores con mutaciones del gen de cohesión en este estudio eran o MSI-inestable o
-mutated MSH6 gratis (Figura 2), se observó ninguna asociación estadísticamente significativa entre las mutaciones en los genes de cohesión de cromátidas hermanas y defectos en la reparación de genes (Tabla S4 y S5 Tabla).
tumores individuales (T) se indican mediante barras verticales de color gris. Los tumores se componen de NEECs (T3, T51, T62, T68, T77, T79, T113) y un CEE (T88). Genes (izquierda) y mutaciones somáticas no sinónimas (cajas de color naranja) se indican.
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A
fueron analizados en este estudio; *
ATAD5
mutaciones,
MSH6
mutaciones e inestabilidad de microsatélites (MSI) han sido previamente descrito en otra parte [44], [52].
en resumen, hemos identificado mutaciones raras, no sinónimas, somáticas en
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A
en un subgrupo de tumores endometriales primarios. Se requerirán más estudios para determinar si estas mutaciones son eventos de controlador que contribuyen a la patogénesis del cáncer de endometrio.
Apoyo a la Información
Figura S1. análisis
RT-PCR de genes inestabilidad cromosómica humana 21 candidatos en 7 líneas celulares de cáncer de endometrio humano. La electroforesis en gel de los productos de RT-PCR confirma la expresión de los genes candidatos 21 de inestabilidad cromosómica en líneas celulares de cáncer de endometrio serosas y endometrioide. se muestran los controles positivos y negativos de PCR (agua). .
ACTB
y
GAPDH
sirvió como control positivo genes
doi: 10.1371 /journal.pone.0063313.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Secuencia de cromatogramas que muestra mutaciones somáticas en
ESCO1
,
CHTF18
, y
MRE11A Hoteles en los ADN de tumores de endometrio, en comparación con los ADN normales emparejados
doi.: 10.1371 /journal.pone.0063313.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
Oncoprints mostrando la distribución de las mutaciones somáticas en los tumores endometriales serosos como se informa en este estudio (*) y en otros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa un tumor individual (T). mutaciones somáticas no sinónimas y MSI + se indican mediante las barras rojas. Para
MSH6
, germinal variantes de importancia funcional desconocida se muestran mediante barras de color naranja. La frecuencia observada (%) de los casos mutados, para cada gen, se muestra a la derecha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s003 gratis (TIF)
figura S4.
Oncoprints mostrando la distribución de las mutaciones somáticas en los tumores endometriales de células claras como se informa en este estudio (*) y en otros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa un tumor individual (T). mutaciones somáticas no sinónimas y MSI + se indican mediante las barras rojas. Para
MSH6
, una variante de la línea germinal de importancia funcional desconocida se muestra por la barra naranja. La frecuencia observada (%) de los casos mutados, para cada gen, se muestra a la derecha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s004 gratis (TIF)
Figura S5.
Oncoprints mostrando la distribución de las mutaciones somáticas en los tumores endometriales endometrioides como se informa en este estudio (*) y en otros lugares [44], [52], [53], [54]. Cada barra azul representa un tumor individual (T). mutaciones somáticas no sinónimas y MSI + se indican mediante las barras rojas. Para
MSH6
, germinal variantes de importancia funcional desconocida se muestran mediante barras de color naranja. La frecuencia observada (%) de los casos mutados, para cada gen, se muestra a la derecha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s005 gratis (TIF)
Figura S6.
inmunotransferencias que muestra los niveles de expresión de la MRE11A, CHTF18 y ESCO1 proteínas entre un panel de 7 líneas celulares de cáncer de endometrio humano. Tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s006
(TIF)
Figura S7.
Oncoprint presentan patrones de mutaciones somáticas en
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, y
ATAD5
en el cáncer colorrectal, según lo informado por The Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA). (Panel superior) tumores colorrectales individuales se indican mediante barras verticales de color gris. Genes (izquierda) y mutaciones somáticas no sinónimas (barras de color naranja) se indican. (Panel inferior) en el cáncer colorrectal, las mutaciones en
ATAD5
y
ESCO1
mostró una fuerte tendencia a la co-ocurrencia; mutaciones en
MRE11A
y
ESCO1
, y en
ATAD5
y
MRE11A
mostró una tendencia a la co-ocurrencia. Los datos se obtuvieron a partir de 224 muestras secuenciadas; Se accedió a los datos del TCGA, y la exclusividad mutua calculan a través del Portal de Genómica del Cáncer CBio (http://www.cbioportal.org/public-portal/).
doi:10.1371/journal.pone.0063313.s007
(TIF)
Table S1.
cebadores de RT-PCR para evaluar la expresión de los genes inestabilidad cromosómica humana 21 candidatos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s008 gratis (XLSX)
Tabla S2. cebadores de PCR
utilizan para amplificar los genes inestabilidad cromosómica humana 21 candidatos dentro de la pantalla de detección
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s009 gratis (DOC) sobre Table S3. cebadores de PCR
utilizan para amplificar y secuenciar
CHTF18, ESCO1, España y
MRE11A Bienvenidos en la pantalla de validación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s010
(DOC) sobre Table S4.
estado de inestabilidad de microsatélites,
MSH6
,
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, y
ATAD5 Opiniones de la 107 tumores endometriales en este estudio
doi: 10.1371. /journal.pone.0063313.s011 gratis (XLSX) sobre Table S5.
frecuencia de mutaciones somáticas en el
ESCO1
,
CHTF18
,
MRE11A
, y
ATAD5
genes de cohesión en 105 tumores de endometrio, de acuerdo con la inestabilidad de microsatélites y
MSH6
estado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0063313.s012 gratis (XLSX)
Reconocimientos
agradecemos a nuestros colegas por cuidadosa lectura del manuscrito y la discusión reflexiva.