Extracto
CTF18-replicación del complejo del factor C incluyendo Dscc1 (replicación del ADN y la cohesión de cromátidas hermanas 1) está implicada en la cohesión cromátida hermana, la replicación del ADN, y la estabilidad del genoma en
S. cerevisiae
y
C. elegans
. Se realizó previamente perfiles de expresión génica en células de cáncer colorrectal primario con el fin de identificar nuevas dianas moleculares para el tratamiento de cáncer colorrectal. Una característica de la firma de la transcripción asociada a cáncer se descubre de este esfuerzo es la elevada expresión del proto-oncogen
DSCC1
. Aquí, hemos interrogado la base molecular para la expresión anormal de DSCC1 humano en el cáncer colorrectal y su capacidad para promover la supervivencia de las células cancerosas. Quantitative PCR y los análisis inmunohistoquímicos corroboraron que el nivel de expresión de DSCC1 es elevado en el 60-70% de los tumores colorrectales en comparación con sus mucosa colónica no canceroso emparejado. Un
in silico
evaluación del presunto
DSCC1
región promotora de ADN consenso de la transcripción elementos reguladores reveló un posible papel de la familia E2F de proteínas de unión al ADN en el control de la expresión DSCC1. la reducción mediada por ARNi de E2F1 expresión reducida de DSCC1 en células de cáncer colorrectal. Ganancia y experimentos de pérdida de función demostraron que DSCC1 está implicado en la viabilidad de las células cancerosas en respuesta a estímulos genotóxicos. Nos revelan que la expresión de E2F-dependiente de DSCC1 confiere propiedades anti-apoptóticas en células de cáncer colorrectal, y que su supresión puede ser una opción útil para el tratamiento del cáncer colorrectal
Visto:. Yamaguchi K, Yamaguchi R, Takahashi N, Ikenoue T, Fujii T, Shinozaki M, et al. (2014) La sobreexpresión de Cohesión Establecimiento Factor DSCC1 través de E2F en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10.1371 /journal.pone.0085750
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado: noviembre 30, 2013; Publicado: 17 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Yamaguchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (# 23790126), MEXT /JSP, Japón, para K. Yamaguchi y Centro Global COE Program "de la educación y la investigación para la medicina avanzada basada en el genoma de la medicina y la personalizada control de las enfermedades infecciosas en todo el mundo ", MEXT /Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Japón a Y. Furukawa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias humanas más frecuentes en el mundo. En las células de CRC, la perturbación de los sistemas empleados para la integridad genética o epigenética hace diferentes características, tales como la inestabilidad cromosómica (CIN), la inestabilidad de microsatélites (MSI), y CpG fenotipo isla methylator (CIMP). Una gran mayoría de los tumores colorrectales presentan CIN que incluye cambios genéticos brutos tales como deleciones, amplificaciones, inversiones, reordenamientos, la ganancia o pérdida de la totalidad o gran parte de los cromosomas y translocaciones [1]. Un estudio anterior identificó mutaciones somáticas en cinco genes, incluyendo
MRE11
,
ZW10
,
ZWILCH
,
ROD
, y
TILÍN
, entre los 100 genes candidatos CIN-humanos que comparten similitud con la levadura o volar "inestabilidad" genes [2]. Sus datos sugieren que al menos una de las tres funciones, incluyendo la reparación de doble filamento romper, la función del cinetocoro, y la segregación de cromátidas, se deteriora en los tumores CIN por mutación somática. Otro estudio buscado mutaciones de 102 homólogos humanos de los genes de levadura CIN en 132 cánceres colorrectales. En consecuencia, se identificaron un total de 11 mutaciones en cinco genes que incluía cuatro asociados con la cohesión de cromátidas hermanas (
SMC1L1
,
CSPG6
,
NIPBL
, y
STAG3
, los homólogos de la levadura
SMC1
,
SMC3
,
SCC2
, y
SCC3
, respectivamente) [3]. Desde la cohesión de cromátidas hermanas es indispensable para los procesos celulares tales como la segregación de cromosomas, la reparación de recombinación homóloga, y la regulación de la transcripción [4], alteraciones genéticas en los componentes y los reguladores deben desempeñar un papel crucial en el CIN de los tumores colorrectales.
Se realizó el análisis previamente perfil de expresión génica en el CCR [5], y se identificó que la replicación del ADN y la cohesión cromátida hermana 1 (
DSCC1
, también conocido como
DCC1
) fue elevada frecuencia en los tumores colorrectales en comparación con la mucosa colónica no canceroso. Dcc1p, un homólogo de DSCC1, se identificó primero como miembro del factor de replicación C alterativa complejo (RFC) en la levadura, y físicamente asociados con Ctf8p y Ctf18p [4]. Eliminación del componente, Ctf18p, Ctf8p, o Dcc1p, dio lugar a graves defectos de cohesión de cromátidas hermanas, y aumento de la sensibilidad a las drogas microtúbulos despolimerización, lo que sugiere que estos componentes son esenciales para el mantenimiento de la integridad de la cromatina [4]. Aunque Dcc1p no era esencial para la viabilidad de la levadura, la supresión de Dcc1p llevó a la letalidad sintética en combinación con la mutación de otras proteínas de cohesión de cromátidas hermanas [6]. Además de la implicación en la cohesión de cromátidas hermanas, el complejo CTF18-DSCC1-CTF8-RFC juega un papel crucial en la replicación del ADN a través de la interacción con el ADN de cadena sencilla y cebada como un cargador de antígeno nuclear de proliferación celular [7]. Por otra parte, el análisis de redes genética de genes funcionalmente relacionados en la levadura sugiere que los componentes del complejo CTF18-DSCC1-CTF8-RFC interactúan con la vía de control de huso MAD /BUB, la RAD51 vía de reparación del ADN de doble filamento se rompe, el daño en el ADN Rad9 punto de control, y la vía de punto de control de la replicación del ADN TOF1 /MRC [8], [9]. El hallazgo de que la mutación en CTF18-RFC aumentó la inestabilidad de repetición triple corrobora el papel de este complejo en el puesto de control de la replicación de ADN [10]. Estos datos indicaron que DSCC1 juega un papel importante en la replicación, eje de control y la reparación del ADN, lo que nos llevó a investigar si la expresión desregulada de DSCC1 está implicado en la tumorigénesis colorrectal humano.
A continuación, se muestra por primera vez que DSCC1 es con frecuencia hasta reguladas en el CCR al menos en parte a través de la activación de la transcripción mejorada por E2F. También revelan que la expresión elevada de DSCC1 confiere la quimio-resistencia en las células CRC proporcionando células tumorales con propiedades anti-apoptóticos. Estos resultados contribuirán a una mejor comprensión de la CRC, y servir como punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico y tratamiento de la CRC.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este proyecto fue aprobado por el comité ético del Instituto de Ciencias Médicas, la Universidad de Tokio (IMSUT-IRB, 21-14-0806). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes de este estudio. Todos los tejidos de cáncer colorrectal y los correspondientes tejidos no cancerosos se obtuvieron a partir de muestras quirúrgicas de los pacientes que se sometieron a cirugía.
Cultivo de células
CRC humano líneas celulares HCT116, HCT-15, SW480, DLD-1 , LoVo, Caco-2, LS174T, HT-29, y RKO se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas las células se cultivaron en el medio adecuado suplementado con FBS (Life Technologies, Carlsbad, CA) y solución de antibiótico /antimicótico (Sigma, St. Louis, MO).
Preparación de plásmidos que expresan DSCC1 y E2Fs
toda la región codificante de
DSCC1
cDNA (GenBank nº de acceso NM_024094) se amplificó mediante RT-PCR usando un conjunto de cebadores; cebador directo: 5'-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 'y el cebador inverso: 5'-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3' (nucleótidos subrayados indican los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción). Los productos de PCR fueron clonados en el
Eco RI y
Xho I
sitios de pcDNA3.1 /myc-His. Nosotros, los plásmidos generados, además, que expresan DSCC1 marcada con HA (pCAGGS-DSCC1). Las construcciones de pcDNA3-HA-E2Fs fueron amablemente proporcionados por el Dr. JR Nevins (Duke University, Durham, Carolina del Norte).
PCR cuantitativa y análisis del número de copias del gen
-PCR en tiempo real se realizó a través el sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Los ADN genómicos fueron extraídos de las líneas celulares de CRC para el análisis del número de copias. PCR cuantitativa se realizó en el sistema de detección ABI PRISM 7900HT secuencia, utilizando sondas marcadas con FAM (5'-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 ') y un conjunto de cebadores (adelante: 5'-GGCGCGCTTTCAAACG-3', inversa: 5'-3-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC ') para
DSCC1
, y el número de copias TaqMan ensayos de referencia RNasa P como un control cuantitativo (Life Technologies). El número de copias de
DSCC1 Hoteles en las células cancerosas se calculan en comparación con el ADN genómico a partir de voluntarios sanos utilizando CopyCaller Software.
Fraccionamiento subcelular y la inmunotransferencia
Las células fueron lisadas en radioinmunoprecipitación tampón de ensayo (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% Nonidet P-40, 0,1% de SDS) complementado con un conjunto de cóctel inhibidor de la proteasa III (Calbiochem, San Diego, CA). Los extractos nucleares se prepararon usando el kit Nuclear Extract (Active Motif, Carlsbad, CA). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia se realizó utilizando los anticuerpos indicados. Peroxidasa de rábano conjugada de cabra anti-ratón o anti-conejo IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) sirvió como el anticuerpo secundario para el sistema de detección ECL (GE Healthcare).
inmunotinción
Primaria Los anticuerpos utilizados para la tinción inmunohistoquímica y inmunocitoquímica fueron anti-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Taiwán) y anti-Myc (Sigma). La especificidad del anticuerpo DSCC1 fue confirmada por el bloqueo con la proteína recombinante DSCC1 (datos no mostrados). Estos experimentos se realizaron como se describe anteriormente [11].
La inducción de la apoptosis y citometría de flujo
Para estudiar la inducción de la apoptosis, las células fueron tratadas con camptotecina (Wako, Osaka, Japón), doxorrubicina (LC Laboratories, Woburn, MA), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), o expuestos a irradiación? (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canadá). Expresión de poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y se escindió de la caspasa-3 se detectó mediante análisis de transferencia Western usando anti escindido PARP (9541) y los anticuerpos 3 anti-caspasa-(9662), respectivamente (Cell Signaling Technology, Danvers , MA). Evaluación de la apoptosis también se llevó a cabo por la anexina V y PI doble tinción utilizando Alexa Fluor 488 Anexina V /Dead Cell Apoptosis Kit (Life Technologies). Brevemente, las células cultivadas se trataron con vehículo o camptotecina durante 24 h. Las células fueron teñidas con anexina V y PI, y posteriormente se analizaron en un citómetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando el software FlowJo (Árbol Star, Ashland, Oregón).
ensayo de viabilidad celular
Los plásmidos que expresan ARN corto horquilla (shRNA) usando el promotor U6 (psiU6BX3.0) se prepararon como se describe anteriormente [12]. Los plásmidos que expresan DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) se construyeron mediante la clonación de oligonucleótidos de doble cadena en el
Bbs
sitios I del vector psiU6BX3.0. Dos secuencias diana, 5'-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 '(shDSCC1 nº 1) y 5'-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3' (shDSCC1#2), se utilizaron para DSCC1 shRNAs. Como controles negativos, se preparó un plásmido de segmentación mejorada de la proteína fluorescente verde (psiU6-shEGFP) y los dirigidos a las secuencias codificadas de shDSCC1#1 (5 'AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3'; psiU6-shDSCC1#1scr) o shDSCC1#2 (5 ' AACACGUUAAUAACCGGUG-3 '; psiU6-shDSCC1#2scr). Ensayos de viabilidad celular se realizaron como se ha descrito anteriormente utilizando células HCT116, SW480, y RKO transfectadas con plásmidos que expresan shEGFP, shDSCC1, o scramble shDSCC1 [11]. Para investigar el efecto de la sobreexpresión DSCC1 sobre la proliferación celular, las células transfectadas SW480 y HCT116 con pCAGGS-DSCC1 y establecimos dos o tres clones que expresan establemente DSCC1 exógeno. También se establecieron las células de control SW480 y HCT116 transfectadas con el vector vacío como células simuladas.
Promotor reportero ensayos y mutagénesis dirigida
plásmidos informadores de luciferasa que contiene el
DSCC1
promotor fuera preparado por la clonación de la región flanqueante 5 'de
DSCC1
en el
Mlu I y
Bgl
sitios de enzimas de restricción II de vectores pGL3-Basic (Promega, Madison, WI ). Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb en la región flanqueante 5 'de
DSCC1
se amplificó por PCR utilizando ADN genómico a partir de voluntarios sanos y un conjunto de cebadores (directo: 5'-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3 ', inversa : 5'-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 '). Los plásmidos mutantes que contienen sustituciones en sitios de unión de E2F putativos de la
DSCC1
promotor se generaron por mutagénesis dirigida al sitio usando el QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos se transfectaron con los plásmidos indicadores junto con PRL-TK (Promega) utilizando Fugene 6 reactivo. Las células se recogieron 24 horas después de la transfección, y las actividades reportero se midieron por el sistema de luciferasa dual (TOYO B-Net, Tokio, Japón). Por la caída de la expresión de E2F1, E2F1 sintética siRNA fue comprado a Sigma (sentido: 5'-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 ', antisentido: 5'-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3').
ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina
para investigar la interacción de E2F1 con el
DSCC1
región promotora, una inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP) ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo de Agilent mamíferos chip con ligeras modificaciones. células HCT116 se reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y se inactivó con 0,4 M de glicina. extractos de la cromatina se esquilada por digestión con nucleasa micrococcal, y, posteriormente, proteínas de ADN complejos se inmunoprecipitaron con 3 g de anti-E2F1 anticuerpo policlonal (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) unido a Dynabeads IgG recubiertos con anti-conejo ( Life Technologies). IgG de conejo no inmune (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como control negativo. Los ADN precipitados se sometieron a análisis de PCR cuantitativa con un conjunto de cebadores (hacia delante (-26) 5'-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 'y revertir (127) 5'-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3') para amplificar el
DSCC1
región promotora. Especificidad del ensayo se determinó mediante la amplificación de una región en dirección distal en el
DSCC1
promotor con los siguientes cebadores: adelante (-1279) 5'-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 'y revertir (-1111) 5' GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 '. Además, las amplificaciones de ciclo de división celular 2 (
CDC2
) (
GAPDH
) promotor se utilizaron para los controles positivos y negativos, respectivamente promotor y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (cebadores:
CDC2
adelante 5'-CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 ',
CDC2
revertir 5'-ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3',
GAPDH
adelante 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 ',
GAPDH
revertir 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 ').
resultados
Expresión de DSCC1 se eleva con frecuencia en CRC
con el fin de identificar nuevas moléculas diana para el tratamiento y /o diagnóstico biomarcadores de la CRC, se realizó previamente análisis del perfil de expresión de los tumores colorrectales y sus tejidos colorrectales normales emparejados por cDNA microarray [5]. Entre los genes desregulados en los tumores colorrectales, la expresión de la replicación del ADN y cromátida hermana cohesión 1 (
DSCC1
) se incrementó más de dos veces en 5 de 7 tipos de cáncer colorrectal en comparación con la mucosa del colon no canceroso correspondiente (Figura 1A ). Análisis en tiempo real PCR posterior usando un adicional de 20 tejidos CRC y la correspondiente mucosa no canceroso revelaron que
DSCC1
expresión fue elevado más de dos veces en 12 de los 20 tumores (Figura 1A). Una tinción inmunohistoquímica mostró proteína DSCC1 acumulado en 29 de 40 tejidos de CRC en comparación con el correspondiente adyacente mucosa del colon no cancerosos (Figura 1B). Aunque se realizaron búsquedas de correlaciones entre la expresión y clinicopathological factores, incluyendo la edad y el sexo del paciente, la ubicación, el tamaño y los datos histológicos de los tumores tales como la profundidad de la invasión, compromiso de los ganglios linfáticos, y la invasión vascular o vaso linfático, ninguno de los factores se asoció significativamente con la expresión DSCC1 (Tabla S1). Además, el análisis de transferencia Western usando líneas celulares de CRC reveló que DSCC1 se expresa abundantemente en HCT116, células HT-29, y DLD-1, y que se expresa en niveles bajos en SW480, SW620, y las células Caco-2 (Figura 1C) . Aunque se comparó la estabilidad de la proteína DSCC1 en células HCT116 (DSCC1-alta) y SW480 (DSCC1-bajo) mediante ensayo de cicloheximida persecución, DSCC1 fue relativamente estable en ambas células HCT116 y SW480. El tratamiento con MG132, un inhibidor del proteasoma también no mejoró la expresión DSCC1 (Figura S1A). Estos datos sugieren que la estabilidad de la proteína no es probable que desempeñe un papel importante en la expresión elevada de DSCC1 en las células cancerosas.
(A) coeficientes de la expresión relativa de
DSCC1 Hoteles en siete tejidos de cáncer colorrectal a sus tejidos normales en nuestros datos de microarrays (panel superior) correspondiente. Niveles relativos de expresión de
DSCC1
en otros 20 tumores colorrectales adicionales y la correspondiente mucosa no canceroso se analizó mediante PCR cuantitativa (panel inferior). Cantidad de
DSCC1
se normalizó a
HPRT1
expresión. eje Y indica la relación de la media de
DSCC1
expresión en el tumor para que en su tejido normal correspondiente. Los datos representa la media ± SD de tres experimentos. (B) imagen representativa de la tinción inmunohistoquímica de DSCC1 en un tejido de cáncer de colon humano que contiene las células cancerosas y mucosa normal adyacente. (C) Expresión de DSCC1 en líneas celulares de CRC se detectó por Western Blot utilizando anticuerpos anti-DSCC1. (D) las células HCT116 se sondaron con anticuerpo anti-DSCC1 seguido de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con FITC (verde). Los núcleos fueron contra el teñidas con DAPI (azul). (E) HCT116, RKO, y DLD-1 células fueron separados en el citoplasma (CF) y las fracciones nucleares (NF), y las proteínas citoplasmáticas y nucleares se sometieron a SDS-PAGE seguido de transferencia Western. La pureza de las fracciones se determinó por la presencia de β-tubulina (marcador citoplásmico) y lamin B (marcador nuclear). (F) Copia análisis del número de
DSCC1 Hoteles en ocho líneas celulares de CRC y células HEK293. relativo número de copias de
DSCC1
gen se determinó mediante PCR cuantitativa utilizando
RPPH1
como una referencia endógena. El número de copias se calculó dividiendo sus productos de la PCR por los de leucocitos periféricos de voluntarios sanos, y, posteriormente, la multiplicación por 2.
El análisis inmunohistoquímico de forma inesperada representa DSCC1 acumulada en el citoplasma y núcleo de cáncer DSCC1-positivo células (Figura 1B), aunque Dscc1 se informó a desempeñar un papel en el establecimiento de la cohesión durante la replicación del ADN en la levadura. Para dilucidar su localización subcelular, se llevó a cabo la tinción inmunocitoquímica de DSCC1 endógena en las células HCT116. De acuerdo con la tinción inmunohistoquímica de tejidos de cáncer, la proteína DSCC1 se localizó tanto en citoplasma y el núcleo (Figura 1D y S1B). Además, el análisis de transferencia de Western usando fracciones citoplasmáticas y nucleares extrae de HCT116, RKO, y las células (Figura 1E) y células que expresan Myc-etiquetados DSCC1 confirmó su localización subcelular en el citoplasma así como el núcleo 1 DLD-(Figura S1C y S1D) .
copia análisis del número de
DSCC1
Para resolver si la amplificación del gen está implicado en la sobreexpresión DSCC1, se realizó un análisis del número de copias por PCR cuantitativa usando RNasa P como control . En comparación con los leucocitos periféricos de voluntarios sanos, el número de copias de
DSCC1
no fue mayor en las líneas celulares de CRC analizadas (Figura 1f). Vale la pena señalar que se observó una disminución en el número de copias en células HT-29 que expresan abundantemente DSCC1 (Figura 1C). Además, se analizó el número de copias alteración de
DSCC1 Hoteles en colon y adenocarcinoma de recto (El proyecto del Genoma del Cáncer El cáncer colorrectal Atlas) usando la base de datos cBioPortal (http://www.cbioportal.org/public-portal/). Como resultado, se encontró que los cambios de número de copias putativa en 7 de los 257 adenocarcinomas colorrectales (2,7%), lo que sugiere que la amplificación de
DSCC1
no juega un papel importante en la mayor expresión DSCC1.
la regulación de
DSCC1
actividad promotora
Para resolver el mecanismo de expresión DSCC1 elevada en CRC, se determinó la actividad del promotor de
DSCC1
en células HCT116. reportero de ensayo usando plásmidos que contienen una región flanqueante 5 'de
DSCC1
(pDSCC1-1023 /+ 109) mostraron que esta región tiene un promotor de la actividad sustancial (datos no mostrados). En la región, hemos identificado un motivo putativo E2F vinculante, EBS1 (-3 /+ 5; 5 'CTTGGCGC-3') usando el JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) y bases de datos TFSEARCH (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (Figura 2A). Este supuesto sitio de unión compartida alta similitud con el motivo consenso para E2F, TTTSSCGC con S = G o C. Dado que los factores de transcripción E2F están desreguladas con frecuencia en una variedad de tumores, hemos probado el efecto de E2Fs en el
DSCC1
la actividad del promotor. A pesar de E2F1, E2F2, E2F3, E2F4 y aumentaron la actividad promotora, E2F6 no cambió la actividad. E2F1, que mostró la inducción más fuerte entre los cuatro miembros, aumentó la actividad de una manera dependiente de la dosis (Figura 2B y S2A). Esta mejora también se observó en otras líneas celulares, incluyendo LoVo, HeLa, y HEK293 (datos no mostrados). Para examinar la posible participación de EBS1 en la mejora, que mide la actividad de reportero usando las construcciones pDSCC1-10 /+ 109 y 10 + /+ 109, en presencia o ausencia de E2F1 (Figura 2C). actividades reportero basales de estos plásmidos indicadores no fueron significativamente diferentes en ausencia de plásmidos E2F1. Supresión de EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) se redujo drásticamente la actividad del indicador E2F1 inducida (de 20,4 veces a 3,2 veces). Inesperadamente, la mejora de la actividad de reportero por E2F1 se observa todavía en + 10 /+ 109. La supresión adicional de hasta +70 del promotor (pDSCC1 + 70 /+ 109) completo disminución de la actividad reportera E2F1 inducida (Figura 2C). De acuerdo con este resultado, encontramos dos EBSS presuntiva adicional, EBS2 (+ 31 /+ 38; 5'-CTTCCGGC-3 ') y EBS3 (+ 57 /+ 64; 5'-TTGCCCGC-3') en la región entre +10 y +70. Para hacer frente a las responsabilidades de EBS1, EBS2, y EBS3 para la inducción, preparamos cuatro reportero construcciones mutantes (Figura 2D) sustituyendo el segmento GC-rico en motivos de consenso E2F, TTTSSCGC (S = C o G) o STTTS, porque éstos núcleo motivos eran según se informa crucial para E2F de unión [13], [14]. En comparación con el tipo salvaje pDSCC1-10 /+ 109 (inducción 14,8 veces), ambos tipos de EBS1-mutante plásmidos (pDSCC1-10 /+ 109 mut1, y Mut1 ') notablemente disminuye la actividad del indicador en respuesta a E2F1 (5,2 veces y 5,8 veces, respectivamente). Las mutaciones en tanto EBS1 y EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 mut1 + 2) se redujo aún más en la actividad E2F1 inducida (3,7 veces). Las sustituciones que contienen mutante plásmido reportero en los tres elementos (pDSCC1-10 /+ 109 mut1 + 2 + 3) casi disminuyó la mejora (1,7 veces), lo que sugiere que los tres motivos de unión a E2F son responsables de la regulación de los
DSCC1
promotor de la actividad.
(A) secuencia de nucleótidos de la región -10 a 90 pb humana
DSCC1
. Tres motivos de unión a E2F putativos están subrayados. (B) pDSCC1-1023 /+ 109 se transfectaron transitoriamente con PRL-TK y pcDNA3 HA-E2Fs en SW480, o con PRL-TK y pcDNA3 HA-E2F1 (0,01-1 mg) en SW480 y células HCT116. (C) pDSCC1-10 /+ 109 o los más cortos construcciones del promotor E2F1 se transfectaron con el vector vacío o en células SW480. (D) Análisis de la mutación dirigida al sitio de E2F sitios de unión putativos en la región promotora proximal. pDSCC1-10 /+ 109 o sus clones mutantes se transfectaron con E2F1 o el vector vacío en células SW480. Los datos representa la media ± SD de tres experimentos independientes. La actividad del promotor indica que la unidad de luciferasa relativa o la inducción veces sobre transfectante vector vacío. (E) La cromatina inmunoprecipitación se realizó usando anticuerpo anti-E2F1. Los ADN precipitados se sometieron a la amplificación de
DSCC1
promotor por PCR cuantitativa. Para determinar la unión a la EBS, la amplificación de una región aguas arriba distal en el
DSCC1
promotor se utilizó para la normalización específico. Una diferencia significativa se determinó mediante la prueba t. células HCT116 (F) fueron transfectadas con el control o E2F1 siRNA (25 nM) durante 48 h.
DSCC1
expresión fue detectado por PCR cuantitativa. Una diferencia significativa se determinó mediante la prueba t. células SW480 (G) fueron transfectadas con el control o E2F1 siRNA (25 nM), seguido de 8 h más tarde por la transfección con el plásmido reportero (pDSCC1-10 /+ 109) y vector de expresión de E2F1 o el vector vacío. Después de 48 h, se midió la actividad de luciferasa. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes.
Interacción de E2F1 con el
DSCC1
región promotora
Para determinar si E2F1 se une a la región promotora
DSCC1
, se realizó un chip de ensayo cuantitativo con anticuerpo anti-E2F1 y un conjunto de cebadores que abarcan los tres elementos E2F-putativo vinculante. El promotor de la división celular gen ciclo 2 (
CDC2
), un objetivo E2F1 bien conocido, se enriqueció 13,4 veces con el ADN inmunoprecipitado (Figura S2B). Como era de esperar, el
DSCC1
región promotora se enriqueció con hasta 15,4 veces en el ADN, lo que sugiere una interacción del
DSCC1
región promotora con E2F1 (Figura 2E).
Para confirmar la participación de E2F1 en la regulación de la expresión DSCC1, se investigó el efecto de silenciamiento de la expresión de E2F1 en DSCC1. PCR en tiempo real y análisis de Western blot mostró que el agotamiento de E2F1 disminución de la expresión DSCC1 (Figura 2F y S2C). RNAi mediada desmontables de la actividad E2F1 se confirmó mediante ensayo de indicador que muestra la reducción significativa de la
DSCC1
la actividad del promotor de 10,4 (Ctrl siRNA) a 4,7 veces por E2F1 siRNA en células SW480 (Figura 2G). Estos resultados sugieren que
DSCC1
transactivación es decir, al menos en parte, regulada por E2F1 en el CCR a través de su interacción con el
DSCC1
región promotora, y que los tres EBSS juegan un papel importante en la la activación transcripcional. Para investigar más a fondo si la expresión DSCC1 es modulada por la actividad de transcripción E2F, se comparó la expresión relativa de
DSCC1
con
CDK1 gratis (
CDC2
), como lecturas de la actividad transcripcional de E2F , utilizando dos conjuntos de datos independientes (e-MEXP-3715 y geod-23878) en la base de datos del Atlas de la Expresión génica (http://www.ebi.ac.uk/gxa/). En los conjuntos de datos,
DSCC1
y
CDK1
fueron significativamente hasta reguladas en los tumores de colon en comparación con los tejidos normales del colon (Figura 3). Cabe destacar que ambos conjuntos de datos calculados altos valores de coeficiente de correlación (E-MEXP-3715,
r = 0,912 y
geod-23878,
r = 0,864
) entre
DSCC1
y
CDK1
, apoya la opinión de que
DSCC1
es otro gen aguas abajo regulado por E2F.
Esta asociación se muestra mediante dos conjuntos de datos de microarrays, e-MEXP-3715 (a) y geod-23878 (B), en la base de datos Atlas de la Expresión génica (http://www.ebi.ac.uk/gxa/). El coeficiente de correlación de Pearson (r) entre
DSCC1
y
CDK1
valores de expresión se calculó para evaluar su correlación.
Efecto de DSCC1 sobre la proliferación de CRC células
Para abordar el papel de su elevada expresión en células de CRC, se investigó si DSCC1 está implicada en la proliferación de células cancerosas. Se llevó a cabo el ensayo de viabilidad celular utilizando plásmidos que expresan tanto DSCC1 shRNA (shDSCC1#1 o#2 shDSCC1) y el gen resistente a la neomicina. Los plásmidos que contienen la secuencia codificada de DSCC1 shRNAs (shDSCC1#1scr y shDSCC1 2scr #) y el plásmido que contiene EGFP shRNA (shEGFP) sirvieron como controles. La transfección con estos DSCC1 shRNAs (shDSCC1#1, o shDSCC1 2 #) redujo la expresión de DSCC1, mientras que la transfección con los controles (shEGFP, shDSCC1#1scr y shDSCC1 2scr #) no tuvo ningún efecto (Figura 4A). células HCT116 se cultivaron en medios que contienen una concentración apropiada de G418 y la viabilidad celular se midió. Se encontró que el número de células viables transfectadas con DSCC1#1 o DSCC1#2 shRNA se redujo significativamente en comparación con las transfectadas con EGFP, DSCC1#1scr, o DSCC1#2scr shRNA, lo que indica que DSCC1 juega un papel en la viabilidad de las células cancerosas (Figura 4B). se obtuvo de datos consistente en SW480 y células RKO (Figura S3 A). Estos resultados se han confirmado en experimentos repetidos.
Células HCT116
(A) fueron transfectadas con el control (Mock y EGFP) y DSCC1 shRNAs durante 48 horas utilizando el kit de Nucleofector y Western blot se llevó a cabo. La expresión de β-actina sirvió como control. (B) La viabilidad de las células transfectadas con shRNAs se midió por WST-8 ensayo. Los datos representa la media ± SD de tres transfecciones independientes. Los valores de p se calcularon con la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples a las células transfectadas con shEGFP. (C) La sobreexpresión de DSCC1 en las células SW480 se confirmó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-DSCC1. número equivalente de tres células simuladas y tres DSCC1 se sembró en placas de 96 pocillos, y ensayos de proliferación celular se llevaron a cabo en los puntos de tiempo indicados. Los datos representa la media ± SD de cinco experimentos. Una diferencia significativa entre las células simuladas y DSCC1 se determinó por dos vías ANOVA de medidas repetidas.
Además, establecimos SW480 células que expresan constitutivamente DSCC1 exógeno, y se comparó su proliferación con células de control transfectadas con mock vector (Figura 4C). En consonancia con los datos DSCC1-caída, las células que expresan DSCC1 exógeno mostraron proliferación celular aumentada en comparación con células SW480 parentales o células de control (
p
= 2,2 × 10
-5). Del mismo modo, exógeno DSCC1-expresión mejorada de la proliferación de células HCT116 (Figura S3B).
Papel de DSCC1 en la inducción de apoptosis
Desde E2F1 confiere resistencia a las agresiones genotóxicas [15], [16 ], [17], se investigó además si la expresión DSCC1 elevado desempeña un papel en la sensibilidad de las células cancerosas a genotóxico estímulos. SW480 células que expresan DSCC1 exógeno (SW480-DSCC1#1,#3, y#8) fueron expuestos a irradiación?, Y la inducción de la apoptosis se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-PARP escindida.