oral
Extracto
Antecedentes
La expresión alterada de MCL-1, un miembro de anti-apoptótica de la familia Bcl-2, se ha relacionado con la progresión y el resultado de una variedad de tumores malignos. Hemos informado anteriormente de la sobreexpresión de la proteína MCL-1 en los cánceres orales humanos. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el significado clínico-patológico de la expresión de tres conocidos MCL-1 isoformas en los tumores orales y el efecto de la orientación MCL-1L isoforma de quimiosensibilidad de las células de cáncer oral.
Métodos
La expresión de MCL-1 isoforms- MCL-1L, Mcl-1S & amp; MCL-1ES se analizó en 130 tumores orales pareadas y 9 líneas de células orales utilizando cuantitativa en tiempo real PCR & amp; proteína por Western Blot. Los niveles MCL-1 mRNA se correlacionaron con los parámetros clínico y pronóstico de los pacientes con cáncer oral. También se evaluó el efecto de MCL-1L o shRNA Obatoclax (una pequeña molécula inhibidor de MCL-1), en combinación con cisplatino en quimiosensibilidad de las células de cáncer oral.
Resultados
anti-apoptótica MCL 1L se expresa predominantemente, sobre isoformas bajos o indetectables pro-apoptóticos Mcl-1S y MCL-1E. Las transcripciones MCL-1L se sobreexpresa significativamente en todas las líneas celulares de cáncer y tumores en el 64% oral frente a las normales adyacentes (
P Hotel & lt; 0,02). En pacientes con cáncer oral, expresión elevada MCL-1L se asoció significativamente con positividad nodo (
P = 0,021
), el tamaño del tumor avanzado (
P = 0,013
) y la mala supervivencia global (
P
= 0,002). El análisis multivariado indicó MCL-1L ser un factor pronóstico independiente de los cánceres orales (
P = 0,037)
. MCL-1L shRNA desmontables o su inhibición por Obatoclax en combinación con cisplatino reducen sinérgicamente la viabilidad y el crecimiento de las células cancerosas orales que cualquiera de los tratamientos por separado.
Conclusión
Nuestros estudios sugieren que la sobreexpresión de MCL-1L se asocia con un mal pronóstico y la quimio-resistencia en los cánceres orales. MCL-1L es un factor pronóstico independiente y una posible diana terapéutica en cáncer oral
Visto:. Palve V, S Mallick, Ghaisas G, Kannan S, T Teni (2014) La sobreexpresión de MCL-1L empalme variante se asociado con un mal pronóstico y quimiorresistencia en los cánceres orales. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10.1371 /journal.pone.0111927
Editor: Kithiganahalli N. Balaji, Instituto Indio de Ciencia, Bangalore, India
Recibido: June 9, 2014; Aceptado: 9 Octubre 2014; Publicado: 19 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Palve et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer oral es el cáncer más frecuente entre los varones de la India y está predominantemente asociado con el hábito del tabaco de mascar-prevalente en el país [1]. A pesar de los recientes avances en las modalidades de tratamiento como la cirugía, la radioterapia /quimioterapia, la supervivencia a largo plazo de los pacientes con cáncer oral no ha cambiado significativamente. Los factores asociados a un mal pronóstico del cáncer oral incluyen, presentación en una fase clínica avanzada & amp; incontrolada recurrencia locorregional [2]. Por lo tanto, es importante para dilucidar los mecanismos implicados en el desarrollo y progresión del cáncer oral e identificar dianas moleculares para un mejor manejo de la enfermedad.
cánceres orales repetidas ocasiones se han asociado con la desregulación de apoptosis [3]. Los miembros pro y anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 son los principales reguladores de la apoptosis celular y juegan un papel crítico en la regulación de la supervivencia celular [4]. MCL-1 (célula de leucemia mieloide-1) es un importante miembro anti-apoptótica de la familia de genes Bcl-2, esencial para el desarrollo, la diferenciación y la proliferación [5]. expresión celular de MCL-1 está estrechamente regulada a través de múltiples mecanismos transcripcional y post-transcripcional [6]. El aumento de MCL-1 de expresión puede producir mejora moderada viabilidad a corto plazo en una amplia gama de tipos de células. MCL-1 puede promover la supervivencia celular mediante la supresión de la liberación de citocromo-c de la mitocondria a través de la heterodimerización y la neutralización de efectoras pro-apoptóticos BH3-sólo las proteínas tales como Bak y Noxa [7]. La sobreexpresión de MCL-1 se ha informado en una variedad de tumores malignos incluyendo hematopoyético, linfoide y tumores sólidos [8], [9]. La sobreexpresión de MCL-1 se ha asociado con características tumorales agresivas, resistencia al tratamiento y mal pronóstico en cáncer de mama, gástrico, de ovario & amp; cánceres de cuello uterino [10] - [13]
Aunque el gen MCL-1 se ha estudiado ampliamente en el mieloma múltiple y la leucemia, hay informes aislados sobre el análisis de MCL-1 en cáncer de cabeza y cuello.. Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado la sobreexpresión significativa de proteínas MCL-1 en líneas celulares de cáncer orales, lesiones premalignas (OSF) y los tumores orales mediante técnicas de inmunohistoquímica [14]. También hemos demostrado alta PCNA y MCL-1 expresión de la proteína que se asocia con un mal pronóstico en pacientes con cáncer tratados con radioterapia orales definitiva [15]. Sin embargo, la situación es compleja debido a la existencia de tres distintas Mcl-1 isoformas que tienen funciones contrastantes saber anti-apoptótica MCL-1L y pro-apoptótica MCL-1S & amp; MCL-1ES [16]. Curiosamente, nuestro laboratorio ha informado recientemente la asociación de anti-apoptótica MCL-1L isoforma con la supervivencia y radioresistance de células de carcinoma escamosas orales [17].
MCL-1 también se ha demostrado que desempeñan un papel en la quimiorresistencia de una variedad de cánceres, pero el papel de sus isoformas en la quimio-resistencia no se ha estudiado en los cánceres, incluyendo el cáncer oral. La radiación seguida de quimioterapia es el tratamiento común para el cáncer oral y MCL-1 sobreexpresión se ha demostrado que proporcionan resistencia a los fármacos quimioterapéuticos convencionales, tales como cisplatino [18]. Varios informes han demostrado que MCL-1 promueve la supervivencia celular y la orientación MCL-1 a través de moléculas BH3-miméticos pueden inducir la muerte celular en las células cancerosas resistentes a cisplatino [19], [20]. Recientemente, Obatoclax, un inhibidor de molécula pequeña mimético BH3 Se ha demostrado que antagonizar proteína MCL-1 y superar MCL-1 mediada por la resistencia a la apoptosis [21], [22]. Nuestros estudios recientes indican MCL-1 a ser importante para la supervivencia de las células cancerosas orales y por lo tanto como objetivo MCL-1 podría ser útil en el tratamiento de pacientes con cáncer oral. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, este tipo de estudios no están disponibles en el cáncer oral. El presente estudio se llevó a cabo por lo tanto para evaluar la significación clínica de MCL-1 isoformas en el cáncer oral y la eficacia de la focalización MCL-1 a chemosensitize células de cáncer oral
in vitro.
Materiales y Métodos en
Los cultivos de células
Siete de células de cáncer oral, líneas- SCC25, QLL1 (del Dr. Park, Yonsei University College of Medicine, Corea [23] & amp; Dr. Rheinwald, Escuela de Medicina de Harvard, Boston [ ,,,0],24]); UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 & amp; UPCI: SCC074 (Del Dr. S Gollin, Universidad de Pittsburgh, PA) [25]; AW8507 & amp; AW13516 [26] se utilizaron en el estudio. Además, un inmortalizado fetal mucosa bucal (FBM) [27] y un queratinocito displásicos oral (DOK) (del Dr. Ken Parkinson, la Escuela de Medicina de la reina Mary & amp; Odontología, Reino Unido) [28] líneas celulares también fueron utilizados en el estudio. Las células se mantuvieron en MEM o IMDM suplementado con 10% FBS & amp; 1% mezcla de antibióticos estándar en 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C, tal como se describe anteriormente [17], [23], [29].
tejidos orales
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Tata Memorial Centre y Sharad Pawar Dental College, India. consentimientos informados escritos se obtuvieron de todos los participantes en el estudio. ingenuas muestras tumorales de tratamiento primario orales y sus tejidos normales adyacentes fueron obtenidos de 130 pacientes sometidos a cirugía de cabeza y en el cuello y la Unidad del Depósito tejido tumoral ICMR Nacional, Tata Memorial Centre, Mumbai, India. tejidos inflamados orales (n = 20) fueron recolectados como tejidos normales sanos de pacientes sometidos a cirugía dental menor en el Departamento de Patología Oral, Sharad Pawar Dental College, Vardha, India. Todos los tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. Las características clínico-patológicas de la cohorte se ilustran en la Tabla 1.
El aislamiento de ARN y PCR en tiempo real
ARN a partir de sedimentos de células y tejidos se extrajeron utilizando el reactivo TRI (Sigma, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se disolvió en agua tratada con DEPC y ADN contaminante se eliminó por tratamiento ADNasa I (Sigma, EE.UU.). La integridad del RNA se analizó por electroforesis y las muestras se conservaron a -80 ° C hasta su análisis, como se describe anteriormente [17]. El ADNc se sintetizó con 500 ng de ARN total, usando un kit de síntesis de primera hebra de ADNc (MBI Fermentas, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA fue sometido por cuantitativa en tiempo real PCR utilizando PCR TaqMan Universal Master Mix (ABI, 4304437) y Mcl-1 isoforma específica sondas de expresión génica (ABI,
MCL-1L
: Hs00172036_m1;
MCL -1S
: Hs00766187_m1 & amp;
MCL-1ES
: 4331348). La amplificación se realiza en tiempo real, sistema de PCR ABI-7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.). GAPDH (ABI, Hs99999905_m1) se utilizó como control interno para normalizar la variación de la muestra entre en la entrada & amp ARN; la eficiencia de amplificación. Todas las reacciones de amplificación se realizaron por triplicado, con el agua tratada con DEPC como controles negativos. El análisis de datos de expresión génica se realizó utilizando el comparativo C
T método de cuantificación relativa [30].
Western Blot
Las proteínas se extrajeron de sedimentos de células y tejidos tumorales como se describe anteriormente [14]. Brevemente, se pulverizaron 30 mg de tejido congelado en el amplificador y mortal; mano de mortero con nitrógeno líquido, se disolvió en ProteoJET refrigerada mamíferos Lisis Celular reactivo que contiene ProteoBlock inhibidor de la proteasa Cocktail (Fermentas, EE.UU.) y se sometió a ultrasonidos en hielo. Las células o tejidos lisados fueron aprobados por centrifugación a 14000 rpm a 4 ° C. La estimación de proteínas se realizó por el método de Bradford. Los lisados de tejidos /células (30-50 g) se resolvieron en 12% de geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en TBS durante 2 horas. y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo monoclonal de ratón contra MCL-1L (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Las membranas fueron despojados y se volvieron a sondar con el anticuerpo policlonal de conejo contra la ß-actina (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) como control de carga. Los anticuerpos secundarios utilizados eran peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Las proteínas se visualizaron con el kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Estados Unidos). análisis de densitometría de la película de rayos X desarrollado se realizó utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).
MCL-1L caída
La expresión de MCL-1L se downregulated por clonación de MCL-1L casete shRNA en el sistema lentiviral pTRIPZ según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, EE.UU.). Una secuencia de oligonucleótido no la orientación se clonó como control. Las partículas virales se generaron por co-transfección de las construcciones de MCL-1LshRNA-pTRIPZ recombinantes y empaquetado de los plásmidos en las células HEK293FT. Además, tres líneas celulares de cáncer orales saber AW8507, UPCI: SCC029B & Amp; UPCI: SCC040 se transdujeron y la selección estable se realizó utilizando marcador de selección de puromicina. La expresión para shRNA fue inducida por doxiciclina y post 72 hrs. de tratamiento, los niveles de MCL-1L se evaluaron mediante qRT-PCR y Western Blot. El silenciamiento específico de MCL-1L se confirmó en tres experimentos independientes.
La muerte celular por tinción PI
PI (yoduro de propidio, Santa Cruz Biotechnology, CA) tinción se realizó para la detección de células muerte en las tres líneas celulares de cáncer orales (AW8507, UPCI: SCC029B & amp; UPCI: SCC040) después de diferentes combinaciones de tratamientos. Brevemente, las células se recogieron por tripsinización, publicar diferentes tratamientos como se describió anteriormente. Las células se lavaron con PBS y se añadieron 10 l PI. Las células se incubaron a continuación durante 2 min en la oscuridad y se analizaron a 488 nm, en un citómetro de flujo (FACS calibre, BD, EE.UU.).
MTT ensayo
Las células se sembraron a 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos que contenían DMEM con 10% de FBS. Después de 24 h, las células se dejaron sin tratar o se trataron con diferentes concentraciones de cisplatino (0,025 a 10,0 mg /ml) (MP Biomedicals, India) o Obatoclax (0, 1,0 a 10,0 nM) (Selleck chem EE.UU.). Los 50% concentraciones inhibidoras (CI50) para el cisplatino y Obatoclax se calcularon a partir de las curvas de supervivencia para todas las líneas celulares. DMSO que contenía medio sirvió como el control respectivo. Después de la incubación de las células con Obatoclax y /o cisplatino durante 72 h, el crecimiento de las células se evaluó por el ensayo MTT, según las instrucciones del fabricante (Sigma, EE.UU.). Brevemente, el medio gastado se retiró y se añadieron 50 l de solución de MTT (1 mg /ml) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37 ° C en CO
2 incubadora y los cristales de formazán en células viables se disolvieron mediante el uso de sulfóxido de dimetilo (DMSO, 100 ul por pocillo). La placa se agitó en un agitador orbital durante 10 min y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando la longitud de onda de referencia de 690 nm en lector de micro placa (Spectramax, EE.UU.). Cinco pozos fueron utilizados para cada concentración de fármaco, y el experimento se repitió tres veces. En otro experimento, para evaluar si la combinación de tratamientos sería conseguir la inhibición de crecimiento más alta que el tratamiento individual, las células de cáncer oral se trataron con doxiciclina a desmontables MCL-1 expresión o Obatoclax (5 nM) para inhibir la actividad de Mcl-1, seguido de cisplatino a una la concentración más baja que la dosis IC50. Todos los experimentos se realizaron por triplicado
tripán azul & amp ensayo.; Microscopía confocal
Las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 por pocillo. La expresión de Mcl-1 fue el blanco ya sea por tratamientos doxiciclina o Obatoclax o en combinación con cisplatino como se describe anteriormente. Las células se trypsinzed después de 48 hrs. de tratamiento y de azul de tripano se realizó (0,4%) de la tinción. El número de células viables se contaron usando un hemocitómetro y se comparó con el control sin tratar. Los datos se muestran a partir de tres experimentos independientes. La obtención de imágenes de células después de diferentes tratamientos se realizó utilizando un microscopio invertido con software de navegador LSM Image 4.2 (Carl Zeiss, EE.UU.).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando una versión con licencia de SPSS 15,0 paquete de software. Para correlacionar estadísticamente la expresión de MCL-1 isoformas con parámetros clínico, los datos se dichotomized en dos grupos a saber: el MCL-1 isoforma altos y los bajos expresadores expresadores. Para la comparación de la expresión de MCL-1 isoformas en las normales y tejidos sanos adyacentes histológicamente normales significan que se utilizaron. La correlación entre los parámetros clínico (sexo, edad, localización, hábitos, tamaño, ganglios, metástasis, recurrencia) se realizó mediante la prueba de Chi cuadrado (χ
2). Las curvas de Kaplan-Meier se utilizaron para evaluar la supervivencia global y la diferencia dentro de los grupos se calculó con Log Rank prueba de significación. Los parámetros predictivos en el análisis univariado se incorporaron en el análisis multivariante mediante la prueba de riesgos proporcionales de Cox para identificar los factores que fueron predictores independientes de la supervivencia. El software Graphpad Prism5 se utilizó para trazar gráficos y los datos de dos amp similares y; grupos disímiles fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student & amp; prueba de Mann Whitney. La variación entre las medias de los grupos se analizó por análisis de una sola vía de la prueba de varianza (ANOVA). Los datos se presentan como media ± desviación estándar. El valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Expresión de MCL-1 isoformas en líneas celulares orales
QRT-PCR análisis reveló, alta expresión predominante de. anti-apoptótica isoforma MCL-1L más bajos o indetectables pro-apoptóticos Mcl-1S y MCL-1ES expresión en todas las líneas celulares orales (Figure1a). MCL-1L se encontró que se sobreexpresa significativamente en ambos mRNA & amp; nivel de proteína en las siete líneas de células de cáncer oral (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 y AW13516) en comparación con lo normal inmortalizada FBM & amp; línea de células displásicas DOK (Figura 1)
(a) Expresión de MCL-1 L & amp.; MCL-1S ARNm en las líneas celulares orales; MCL-1 ES niveles fueron indetectables (* P≤0.03) (b) la expresión de proteínas MCL-1L en líneas celulares orales.
Expresión de MCL-1 isoformas en los tejidos orales
QRT-PCR análisis reveló significativa (p≤0.02) alta expresión de MCL-1L mRNA en 64% (84/130) de los tumores orales de diferentes subsitios en comparación con el tejido normal (Figura 2a). Por otra parte, no se observó diferencia significativa entre la expresión de Mcl-1L de tumores de diferentes subsitios. La expresión relativa de MCL-1L isoforma fue ~ 5 veces más alta que Mcl-1S y ~ 10 veces superior a MCL-1ES isoforma en los tumores orales (datos no mostrados). Del mismo modo, el análisis de transferencia Western mostró la expresión de proteínas de alto MCL-1L en los tumores orales versus los tejidos normales adyacentes (Figura 2B).
(a) Expresión de MCL-1L mRNA en tumores orales normales vs. de diferentes subsitios (* P≤0.02); (B) la expresión de proteínas MCL-1L en normal adyacente frente a tumores
Correlación de MCL-1 de expresión con parámetros clínico & amp.; resultado
El análisis univariante reveló una correlación significativa de la expresión de alto MCL-1L con positividad nodo (p = 0,021) y los tumores avanzados (p = 0,013). Sin embargo, no se observó una correlación significativa entre la expresión de MCL-1 isoformas y de género, la edad, el tabaco /alcohol, hábitos sitio primario & amp; la diferenciación de los pacientes con cáncer oral (Tabla 2). Cabe destacar que la baja expresión de pro-apoptóticos Mcl-1S isoforma mostró una tendencia hacia la significación positiva con tumores poco diferenciados (p = 0,053).
Correlación de MCL-1 de expresión con la supervivencia global
Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de expresadores bajas y altas de MCL-1L mostró una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,002). Los pacientes que expresan alta anti-apoptótica MCL-1L exhibieron supervivencia global pobres frente a los que expresan bajo MCL-1L (Figura 3a). A la inversa, los pacientes que expresan altos pro-apoptóticos Mcl-1S exhibió significativamente mejor supervivencia global (p = 0,051) en comparación con los que tienen bajas Mcl-1S (Figura 3b). En particular, la proporción relativa de MCL-1L /Mcl-1S también mostró una correlación positiva (p = 0,006) con la pobre supervivencia global de los pacientes con cáncer oral (Figura 3C). Además, el análisis univariado reveló también la supervivencia global pobres en los ganglios positivos en comparación con los pacientes con ganglios negativos de cáncer oral (p = 0,003). Los otros parámetros como la edad, el tabaco hábitos /alcohol y la diferenciación no influyeron significativamente la supervivencia global de estos pacientes.
estimaciones (ac) Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes con cáncer oral con baja o alta expresión de Mcl- 1 isoformas; (D) El análisis multivariado de pacientes con cáncer oral
El análisis multivariado
Entre las dos isoformas (MCL-1 L & amp; MCL-1S). Analizaron, theMcl-1L expresión influyó en la general la supervivencia de pacientes con cáncer oral. La variable MCL-1L, que había surgido significativas en el análisis univariado, se examinó utilizando el modelo de regresión de Cox en el análisis multivariante (Figure3d). Los pacientes que expresan alta MCL-1L exhibieron supervivencia general más corta y un mayor riesgo de supervivencia de los pobres 3.2 de tiempo en comparación con los que expresan bajo MCL-1L (p = 0,037). Esto implica que MCL-1L es un factor pronóstico independiente para el cáncer oral
shRNA mediada por la regulación de MCL-1L
En las tres líneas celulares de cáncer orales (AW8507, UPCI:. SCC040 & Amp; UPCI: SCC029B) transducidas con partículas de lentivirus MCL-1L shRNA-pTRIPZ, la expresión MCL-1L se downregulated con éxito un tratamiento de post doxiciclina. Los pocillos de control representan las células sin tratamiento doxiciclina. La cuantitativa en tiempo real PCR y Western blot confirmó la regulación a la baja de MCL-1L, tanto a nivel de ARNm y proteínas, en todas las líneas celulares de cáncer de tres (Figura 4). Sin embargo, los niveles de MCL-1S & amp; MCL-1ES se mantuvo inalterada (datos no mostrados)
(a & amp; b). ShRNA mediada por la regulación de MCL-1L ARNm & amp; proteína en la AW8507, UPCI: SCC040 & amp; células de cáncer oral, SCCC29B en comparación con el control
Efecto de MCL-1L knockdown & amp;. /o cisplatino sobre la muerte celular
La inducción de la muerte celular se analizó por tinción con PI seguido por análisis FACS en las tres líneas celulares de cáncer orales (AW8507, UPCI: SCC040 & amp; UPCI: SCC029B) publicar diferentes tratamientos como se ha descrito anteriormente. El mediada desmontables shRNA de abundantemente expresado isoforma MCL-1L o tratamiento cisplatino reveló la inducción de la muerte celular en todas las líneas celulares. La muerte celular inducida en AW8507, UPCI: SCC040 & amp; UPCI: SCC29B, puesto MCL-1L caída fue del 31% (DE 2,5), 27% (DE 1,5) y 24% (SD 3,5) o enviados cisplatino tratamiento fue del 50% (DE 2,1), 42% (DE 2,7), y 46% (SD 3,1), respectivamente. Por otra parte, mediada por shRNA desmontables MCL-1L seguido de cisplatino tratamiento en conjunto mostró 78% (SD, 1.2), 71% (DE 1,8) y 82% (DE 2,0) de la muerte celular, respectivamente. Los tratamientos combinados de MCL-1L desmontables y cisplatino mostraron una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) la diferencia en la inducción de muerte celular en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solos (Figura 5b), de ese modo, lo que sugiere un efecto sinérgico de los tratamientos combinados sobre la muerte celular.
Efecto de BH3 mimética Obatoclax y /o cisplatino sobre la viabilidad celular y el crecimiento
la figura 6a ilustra imágenes de microscopía confocal de células representativas AW8507 tratados con cisplatino y /o Obatoclax. Es interesante que los tratamientos combinados de Obatoclax & amp; El cisplatino mostró un aumento de la muerte celular en comparación con los tratamientos individuales. Adicionalmente, se realizó el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano para determinar el efecto sobre la viabilidad celular en líneas celulares de cáncer oral (AW8507, UPCI: SCC040 & Amp; UPCI: SCC029B) después de diferentes tratamientos. Cabe destacar que el BH3 mimético Obatoclax o cisplatino podría reducir con éxito la viabilidad celular en todas las tres líneas celulares de cáncer. Por otra parte, la combinación de cisplatino y Obatoclax juntos de manera significativa (p & lt; 0,05) redujo la viabilidad celular en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. El tratamiento combinado de Obatoclax & amp; El cisplatino exhibió una reducción 3-7 veces en la viabilidad celular en comparación con los tratamientos individuales (Figura 6B). Además, el ensayo de proliferación de MTT también reveló una disminución significativa (p & lt; 0,05) la reducción en el crecimiento celular (2-4 veces) después del tratamiento combinado de cisplatino y Obatoclax en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solos (Figura 6c) de ese modo, lo que sugiere un efecto sinérgico de la . combinado de tratamiento sobre la viabilidad celular y el crecimiento de las células cancerosas orales
(a) confocal imágenes representativas microscópicas de células AW8507 publican diferentes tratamientos; (B) Evaluación de la viabilidad celular por ciento de las células de cáncer oral poste de diferentes tratamientos de ensayo de azul de tripano colorante de exclusión (* P & lt; 0,05, frente a los tratamientos individuales); (C) Análisis de la proliferación de células de cáncer oral después de diferentes tratamientos por el ensayo de MTT. (* P & lt; 0,05, frente a los tratamientos individuales).
Discusión
En el presente estudio, se evaluó la expresión de MCL-1 isoformas (MCL-1L, Mcl-1S & amp; MCL-1ES) en los tumores orales frente a tejidos normales, para determinar si serían útiles como marcadores de pronóstico en pacientes con cáncer oral. Hasta el momento, la información limitada sobre el papel de MCL-1 isoformas en la patogénesis del cáncer oral. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para correlacionar la expresión de los tres MCL-1 isoformas con parámetros clínico de pacientes con cáncer oral. Nuestro estudio demuestra alta expresión significativa de anti-apoptótica MCL-1L en la mayoría de líneas celulares de cáncer y tumores orales (64%) en comparación con los correspondientes normales. También demostramos que la alta expresión MCL-1L se asoció significativamente con los pobres resultados de los pacientes con cáncer oral. Además, la orientación de Mcl-1L por shRNA o Obatoclax en combinación con cisplatino podría inducir sinérgicamente la muerte celular en células de cáncer oral. Por lo tanto, la sobreexpresión de MCL-1L puede representar un mecanismo importante que contribuye a la supervivencia de células de cáncer oral, contribuyendo así en el desarrollo y progresión de cáncer oral
.
La desregulación de genes de apoptosis regulación se ha informado a desempeñar una clave papel en el desarrollo y la progresión de varios tumores malignos humanos. El anti-apoptótica de Mcl-1 es un miembro importante de la apoptosis regulación de Bcl-2 de la familia y se ha demostrado que se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo, cervical, de ovario, de páncreas, hepatocelular, de pulmón de células no pequeñas, cánceres de células germinales testiculares y melanomas [8]. En particular, el presente estudio, por primera vez demuestra la sobreexpresión de la variante de empalme MCL-1L en líneas & amp orales de células cancerosas; mayoría de los tumores orales versus los tejidos normales. Sólo hay un único informe que analiza MCL-1 isoformas & amp; su importancia clínica hasta el momento en los carcinomas renales de células claras [31]. En contraste con nuestros resultados, sin embargo, este estudio demostró una asociación de baja expresión MCL-1L con fenotipos agresivos en los carcinomas renales de células claras. Además, no hay información disponible sobre la expresión de MCL-1 isoformas en los cánceres orales. En el presente estudio, la correlación de MCL-1 isoformas y parámetros clínico de pacientes con cáncer oral, reveló una asociación significativa de la variante de empalme MCL-1L con el tamaño del tumor avanzado (p = 0,013) y la positividad ganglionar (p = 0,021). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de baja versus altos expresadores de MCL-1L ARNm mostró que la alta expresión MCL-1L se asoció significativamente con un mal supervivencia global (p = 0,002). Como se observa en el presente estudio para MCL-1 isoformas, alta MCL-1 expresión de la proteína y su asociación con mal pronóstico se ha demostrado en cuello uterino, gástrico, de pulmón y de ovario [11] - [13], [32]. Sin embargo, un estudio previo de nuestro laboratorio no pudo encontrar la asociación más arriba a nivel de proteínas MCL-1 [14]. El presente estudio se realizó para dilucidar el perfil de expresión de MCL-1 isoformas en líneas celulares orales y una gran cohorte de tumores, lo que demostró la asociación de la expresión anti-apoptótica MCL-1L con el pronóstico en el cáncer oral. Este es el primer estudio, lo que demuestra la correlación de la variante de empalme MCL-1L con la evolución de los pacientes con cáncer oral y MCL-1L como un marcador pronóstico independiente para los cánceres orales.
MCL-1 está estrechamente regulada en la transcripción, subir los niveles de transcripción y traducción [6] y el mecanismo exacto de MCL-1 sobreexpresión en cáncer oral no se conoce. El pro-apoptótica MCL-1S & amp; isoformas MCL-1E se expresaron en niveles bajos o indetectables en comparación con el expresado predominantemente MCL-1L y no se correlacionó con parámetros clínico de pacientes con cáncer oral. En particular, los cortos pro-apoptóticos Mcl-1S sólo se une a MCL-1L posiblemente neutralizando su función anti-apoptótica [33]. Por otra parte, la isoforma pro-apoptótica MCL-1ES identificado recientemente también puede unirse y neutralizar la función anti-apoptótica de longitud completa MCL-1L isoforma, a pesar de que se expresa en niveles muy bajos o indetectables. Por lo tanto, se analizaron las proporciones relativas de las isoformas de MCL-1L /MCL-1S, que reveló una correlación positiva significativa con la pobre supervivencia global de los pacientes, lo que implica que la baja expresión de Mcl-1S & amp; MCL-1ES en los cánceres orales es posiblemente insuficiente para neutralizar por completo la alta expresión de anti-apoptóticos MCL-1L isoforma. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio cuantificación de la expresión de los tres MCL-1 isoformas y su correlación con los parámetros clínico & amp; resultado de los pacientes con cáncer oral. Nuestros resultados también son compatibles con los informes previos en los cánceres gástricos y cervicales que demuestran la asociación entre la alta expresión de la proteína MCL-1 con el tamaño del tumor, el grado histológico, la afectación ganglionar, metástasis & amp; los pobres resultados clínicos [11], [34]. Por otra parte, la importancia pronóstica de alta expresión de la proteína MCL-1 también se ha demostrado en mama, de ovario, el cáncer no microcítico de pulmón de células y varias neoplasias hematológicas [10], [13], [35].
Mcl -1 se sobreexpresa en una variedad de tumores malignos humanos y propuesto para ser una diana terapéutica potencial [8]. MCL-1 sobreexpresión también parece ser un factor clave en la resistencia de diversos tipos de cáncer a los tratamientos convencionales, incluyendo la radiación y la quimioterapia. La regulación a la baja de MCL-1 se ha demostrado que sensibilizar a las células de neuroblastoma citotóxica células de melanoma de quimioterapia y resistentes a la apoptosis mediada por Fas [36], [37]. Por otra parte, en nuestro presente estudio, shRNA mediada por la regulación de MCL-1L ha demostrado que chemosensitize células de cáncer oral (AW8507, UPCI: SCC040 & Amp; UPCI: SCC029B) a cisplatino que indica un papel crucial para MCL-1 en la resistencia al tratamiento de los cánceres orales . Estudios dirigidos MCL-1 a través de la terapia antisentido también han demostrado que chemosensitize células de carcinoma hepatocelular
in vitro
[38], [39]. Aunque nuestro estudio indica el agotamiento de la expresión de Mcl-1L de 90% a 20% en shRNA (figura 4a) una muerte celular mínima (25%) se observó. Esto sugiere que, además de MCL-1 podría haber otros factores que contribuyen en la supervivencia de las células después del tratamiento con cisplatino. Otros estudios también han informado de proteínas como survivina [40], Oct4 & amp; Nanog [41], MUC4 [42], secretario Kin17 [43], etc. jugando un papel importante en la quimio-resistencia de las células de carcinoma escamoso oral. Sin embargo, este es el primer estudio que correlaciona la asociación de la variante de empalme de Mcl-1L con quimiorresistencia de cáncer oral.
Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado un papel para MCL-1L isoforma en radioresistance de células de carcinoma escamosas orales y como factor pronóstico en la predicción de la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes de cáncer oral tratados con radioterapia definitiva. [15], [17]. Por lo tanto, el agotamiento de MCL-1 parece ser un requisito previo para la radio /quimioterapia sensibilizar a las células cancerosas que sobreexpresan la proteína MCL-1, para promover la apoptosis. Se han hecho varios intentos para dirigir las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 de la familia incluyendo MCL-1 en los tumores utilizando una variedad de inhibidores. Entre estos, el inhibidor más prometedor, un BH3 mimético ABT-737 ha fallado para superar la resistencia debido a MCL-1 sobreexpresión. Otros estudios indican que, MCL-1 baja regulación solo puede potenciar ABT-737 letalidad en células de leucemia [44]. En el presente estudio una sartén Bcl-2 inhibidor de molécula pequeña, Obatoclax (GX15-070) que se sabe que antagonizan MCL-1 y superar MCL-1 mediada por la resistencia a la apoptosis se utilizó [21]. Obatoclax se ha demostrado para secuestrar anti-apoptóticos proteínas de la familia Bcl-2 y un máximo de regular la expresión de Puma, Noxa & amp; Bim que indujo apoptosis adicional en los mastocitos neoplásicos [45].