Extracto
N-Myc-aguas abajo de genes regulados 2 (
NDRG2
) es un gen supresor de tumor candidato, que desempeña un papel importante en el control de crecimiento del tumor. El objetivo de este estudio fue investigar la expresión de
NDRG2
de genes en tejidos de cáncer de vejiga (BC) y varias líneas celulares de cáncer de vejiga, y para buscar su significado clínico y patológico. Noventa y siete por carcinoma de vejiga y 15 secciones de tejido normal de la vejiga se analizaron de forma retrospectiva con la inmunohistoquímica. La línea celular de cáncer de vejiga humano T24 estaba infectado con Len-
NDRG2
o LEN-LacZ. Los efectos de
NDRG2
sobreexpresión en células T24 y T24 xenoinjertos de ratones desnudos se midieron a través de las curvas de crecimiento de células tumorales, curvas de crecimiento, el análisis de citometría, transferencia de western y ensayo Transwell fluir.
NDRG2
fue altamente expresado en el tejido normal de la vejiga, pero ausente o raramente expresan en tejidos cacinomatous (χ
2 = 8,761, p & lt; 0,01). El
NDRG2
nivel se correlacionó negativamente con el grado del tumor y el estadio del tumor (r = -0,248, p & lt; 0,05), así como un mayor nivel de c-myc (r = -0,454, p & lt; 0,001). La expresión de
NDRG2
fue baja en las tres líneas celulares de BC. T24 células infectadas con Len-
NDRG2
mostró una inhibición de la proliferación tanto de
in vitro
y
in vivo
, y
NDRG2
sobreexpresión puede inhibir el crecimiento tumoral y invasión
in vitro
Visto:. Li R, Yu C, Jiang M, L Gao, Li J, Wang Y, et al. (2013) La sobreexpresión de N-Myc Downstream-Regulado Gen 2 (NDRG2) Regula la proliferación e invasión de células del cáncer de vejiga
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 8 (10): e76689. doi: 10.1371 /journal.pone.0076689
Editor: Raffaele Un Calogero, Universidad de Turín, Italia |
Recibido: 27 de mayo de 2013; Aceptado: August 26, 2013; Publicado: 16 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31070681). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La incidencia de cáncer de vejiga es cada vez mayor. Se estima que 386,300 nuevos casos y 150.200 muertes por cáncer de vejiga en 2008 se produjeron en todo el mundo [1]. En los hombres, el cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común sólo después de próstata, de pulmón y colorrectal, que representa el 7% de todos los casos de cáncer en EE.UU. [2]. En más de 75% de los casos, el diagnóstico se hace en una etapa temprana de la enfermedad (estadios Ta y T1). A pesar de haber recibido un tratamiento adecuado, la tasa de supervivencia global a cinco años para la enfermedad patológica T2 es 52-77%, 40-64% de la enfermedad T3, y T4 o linfático ganglios positivos 26-44% [3]. Hay intervenciones terapéuticas numéricas para tratar esta enfermedad; Sin embargo, la tasa de supervivencia global no ha mejorado en los últimos veinte años. Por lo tanto, para establecer una nueva forma de terapia que utiliza el agente antioncogen para mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes es altamente deseable.
La N-myc regula aguas abajo de genes 2 (
NDRG2
) pertenece a la NDRG familia, que incluye cuatro miembros:
NDRG1, NDRG2, NDRG3
y
NDRG4
. La homología de secuencia humana dentro de la
NDRG
familia es 57-65% y el
NDRG
familia ha sido investigado en algunos de cáncer humano y trastornos del sistema nervioso [4]. Como un gen para regular aguas abajo de Myc,
NDRG2
expresión se ha confirmado que reducirse en muchos tipos de carcinomas, incluyendo cáncer de tiroides, cáncer de hígado, meningioma, cáncer de páncreas y cáncer de próstata [5-11]. Estos estudios sugieren que
NDRG2
podría desempeñar un papel importante en el control de la morbilidad de los carcinomas. El
NDRG2
se ha confirmado estar implicados en el crecimiento celular y la diferenciación, por su parte,
NDRG2
expresión en gliomas de alto grado se ha demostrado asociarse con la supervivencia [12,13].
(A) los niveles de expresión de
NDRG2
disminución proteínas, mientras que el grado de malignidad de los aumentos de carcinoma de vejiga (x400) (1). tejido de la vejiga normales; (2) de la vejiga del papiloma (T0-Ta); (3) el cáncer de vejiga de alto nivel (T2-T4). (B) Los niveles de expresión de c-Myc proteína aumenta mientras que el grado de malignidad de los aumentos de carcinoma de vejiga (x400) (4). tejido de la vejiga normales; (5) de la vejiga del papiloma (T0-Ta); (6) El cáncer de vejiga de alto nivel (T2-T4). Las secciones de (B) (4-6) se originaron a partir de los mismos bloques de parafina como (A) (1-3), respectivamente.
Aunque varios estudios han investigado la función de
NDRG2
en los tumores comunes, no ha habido caracterización funcional de la función potencial de
NDRG2
gen en el cáncer de vejiga. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar el papel de
NDRG2
en el cáncer de vejiga humana. En primer lugar, se analizó la expresión de
NDRG2 Hoteles en tejidos de carcinoma de vejiga humana y la comparación con los tejidos normales de la vejiga por inmunoquímica. Se encontró que el nivel de expresión de
NDRG2 Hoteles en BC tejidos fue menor que en los tejidos normales. A continuación, se utilizaron líneas celulares de cáncer de vejiga como modelos para evaluar el efecto de
NDRG2
sobre el crecimiento tumoral, la diferenciación y la invasión
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados sugieren que
NDRG2
tiene un papel antioncogénico potencial en el cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Muestras Clínicas
Fijado en formol y embebidos en parafina- bloques de tejidos de carcinoma de vejiga fueron recogidos al azar de 112 pacientes y controles (edad media de 63,4 años, rango de 21 a 81 años) del Departamento de Cirugía urológica del hospital Xijing, FMMU (Xi'an, china) entre 2008 y 2011.These muestras compuestas de 15 tejidos normales de la vejiga, la vejiga 20 del papiloma (T0-Ta), 38-bajo nivel cáncer de vejiga (Tis-T1) y 39 muestras de cáncer de vejiga de alto nivel (T2-T4). Se obtuvo consentimiento escrito de cada sujeto. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Xijing, Xian, China.
(A) análisis de PCR en tiempo real de
NDRG2
la expresión del ARNm. nivel (B) Expresión de
NDRG2
proteína como se ensayó mediante western blot. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente para al menos tres veces. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar (** p & lt; 0,001) ..
La inmunohistoquímica (SP: estreptavidina-perosidase)
ratón anti-humano
NDRG2
anticuerpo monoclonal y el anticuerpo monoclonal c-Myc se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology Company (Santa Cruz, EE.UU.).. El kit de inmunohistoquímica fue adquirido de la Compañía Boster (Wuhan, China). La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las siguientes preparaciones se hicieron a partir de cada bloque de tejido:. Una muestra teñida con él (el estadio patológico se comprobaron por patólogos), un portaobjetos se incubaron con anti-
NDRG2
anticuerpo, un portaobjetos se incubaron con el anticuerpo c-myc
con el fin de determinar con precisión la expresión positiva y para minimizar la tasa de falsos positivos, hemos utilizado dos sistemas de puntuación semicuantitativa arbitory para evaluar el alcance y la intensidad de la tinción por tres patólogos de forma independiente. Las puntuaciones se definen como sigue: (1) la medida de la puntuación de tinción: 0 punto para la tinción de & lt; 5%, 1 punto para la tinción de 6% a 25%, 2 puntos para la tinción de 26% a 50%, 3 puntos para la tinción 51 % a 75%, y 4 puntos para la tinción de & gt; 75% (2). La intensidad de la tinción de puntuación: 0 puntos para la tinción negativa, 1 punto para la tinción positiva débil, 2 puntos por tinción moderada y 3 puntos por tinción fuerte (tan). Para cada muestra, los resultados derivados de los dos sistemas de puntuación se multiplicaron. Los resultados de la determinación se dividieron en cuatro niveles: negativo (0 a 1, -), débilmente positivo (2-4, +), positivo (5-8, + +), positivo fuerte (9 a 12, + + +) . Imágenes se realizó con un microscopio óptico (Olympus, Nagano, Japón) y se calcula con el análisis estadístico.
Cell Culture
Hemos seleccionado T24 humana, 5637 y BIU-87 líneas de células para ser utilizado en el investigación en curso. Estas líneas celulares se han confirmado previamente como las líneas celulares adecuadas para la investigación de cáncer de vejiga. Como control normal, se optó por células de vejiga humano (SV-HUC-1). Todas las líneas celulares se adquirieron en el Banco de Células, Academia de Ciencias de China, Shanghai, China. Las células se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sijiqing Hangzhou, China). Todas las líneas celulares se cultivaron en condiciones estériles a 37 ° C y 5% de CO
2.
(A) Detección de la eficacia de la infección lentiviral, y contraste de fases (izquierda) o GFP (derecha) eran imágenes obtenido cuatro días después de la infección. (B) Análisis de PCR en tiempo real de
NDRG2
la expresión del ARNm en células T24. (C) Análisis de transferencia Western de
NDRG2
expresión de la proteína. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar (** p & lt; 0,01) ..
-PCR cuantitativa en tiempo real
El ARN total fue extraído a partir de células usando el reactivo TRIzol (Takara Bio, Japón) y se transcribió inversamente usando M-MLV transcriptasa inversa (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: GAPDH, 5'-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 'y 5'-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3';
NDRG2
, 5'-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3 'y 5'-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3'. El programa de amplificación consistió en la activación de la polimerasa a 95 ° C durante 30 segundos y 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 segundos, hibridación y extensión a 59 ° C durante 30 segundos. Los niveles relativos de expresión se normalizaron mediante la comparativa ciclo umbral (2
-ΔΔCt). La PCR en tiempo real realizó mediante el uso del sistema CFX96 Touch PCR (Bio-Rad). Todos los experimentos mencionados anteriormente se repitieron al menos tres veces.
Análisis Western Blot
Se recogieron todas las células en fase exponencial y luego la proteína total se extrajo con tampón de lisis que contiene 1% de Tween 20, y, finalmente, se cuantificó con el ensayo BCA. La misma cantidad de proteínas 20 microgramos se sometieron a 10% de concentración de SDS-PAGE. Las proteínas separadas por SDS-PAGE dentro de los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (NC) (Amersham, St. Giles, RU). Posteriormente, las membranas NC se bloquearon con 5% de leche no grasa durante 1 hora a temperatura ambiente y después se incubaron con el ratón anti-humano
NDRG2
de anticuerpos (1: 800) (Santa Cruz, EE.UU.) durante la noche a 4 ° DO. detección de la proteína GAPDH se utilizó como control interno. Después de lavar tres veces, los borrones transferidos contienen
NDRG2
bandas se visualizaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anti-ratón o anti-anticuerpo secundario de conejo (dilución 1: 2000, Santa Cruz) durante 2 horas a temperatura ambiente. a continuación, se aplicaron las quimioluminiscencia mejorada (ECL) soluciones de detección del sistema (Pierce, NJ), y se cuantificaron mediante el software Kodak Digital Science ID (Kodak, NY).
Lentivirus infección
Para producir lentivirus, 293T células fueron co-transfectadas con GFP-Plen
NDRG2
o Plen-GFP-lacZ, que se amplifica en
E. coli DH5
, se purificó usando un kit de plásmido Maxi (Qiagen, Valencia, CA), y se transfectaron en 70% de células confluentes 293T utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). partículas lentivirales se recogieron de los sobrenadantes 72 horas después de la transfección y se purificaron por ultracentrifugación. Estas partículas se denominan en lo sucesivo como len-
NDRG2
, y LEN-lacZ (control negativo). Se seleccionaron las células T24 establemente infectadas usando blasticidin, contando las células positivas a la proteína fluorescente verde (GFP) bajo microscopía de fluorescencia (Olympus, Japón), aplicado a la concentración mínima de blasticidin, después de una valoración de serie, necesaria para matar las células T24 no infectadas. La línea celular se divide en los siguientes tres grupos experimentales: Células 1)
NDRG2
grupo (Len-
NDRG2
células infectadas), 2) grupo Lacz (infectados por LEN-lacZ), y 3) grupo CON (células no infectadas). Tanto en tiempo real PCR y Western blot confirmó que con éxito células T24 infectadas con el lentiviral y la sobreexpresión de
NDRG2
adecuadamente después de la infección. También Hemos comprobado la expresión diferencial de proteínas que se correlacionaron con la etapa del ciclo celular, la apoptosis y la migración celular y la invasión (proteína del ciclo celular: cyclinD1, CDK4; proteína apoptosis de las células: p21; migración celular y la proteína de la invasión: MMP-2 y MMP-9)
. Las pruebas de inhibición del crecimiento
Cell
In Vitro
Este ensayo incluyó ensayos de MTT, ensayos de formación de colonias y el análisis de citometría de (FCA) (BD Biosciences, NJ) fluya. Cada ensayo se aplicó a cada uno de los tres grupos (el control en blanco; LEN-LacZ, el control negativo, y len-
NDRG2
, el grupo experimental). Se repitieron los experimentos de cinco veces (1). ensayo MTT: Todas las células, incluidos los infectados, fueron cultivadas en fase exponencial y separado por tratamiento con tripsina. Las células viables (2000 células /ml) se inocularon en placas de 96 pocillos y cada grupo tenía seis pozos reduplicative. En diferentes puntos de tiempo, el reactivo MTT se añadió 20 l /pocillo (5 mg /ml) y se incubó a 37 ° C durante 4 h. La reacción se detuvo por la adición de 150 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO), seguido de agitación durante 10 min. Los valores de absorbancia (A) se midieron con una enzima de escala metros autocinético (Bio-Rad, EE.UU.) a 490 nm de longitud de onda. curvas de crecimiento de la célula luego fueron luego dibujan sobre la base de los valores promedio A (2). La formación de colonias de ensayo: Las células se sembraron en seis placas -bien (200 células /pocillo) (en tres pocillos por duplicado) y se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2. Después de dos semanas, las células se fijaron con metanol durante 20 min y después se tiñeron con Giemsa para 20 min. ddH
2O se utilizó para lavar las células tres veces para obtener un fondo limpio. El número de colonias y el número de células en cada colonia se contaron y se analizó estadísticamente (3). células T24 (1 x 10
6 células /pocillo) se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos con lentivirus infectados Len-
NDRG2
: FCA. Se recogieron tres grupos de células después de 48 h y 72 h, respectivamente, y finalmente se centrifugaron y se fijaron en 95% de etanol. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C, las células se tiñeron con yoduro de propidio 0,5% (10μl) en presencia de 0,01% de ARNasa A y 0,1% de Triton X-100, a continuación, se midió con un citómetro de flujo.
(A y B) ensayo de formación de colonias. La regulación positiva de
NDRG2
inhibe la formación de colonias. (C) Las curvas de crecimiento de células de las células T24 por el método MTT. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente para al menos tres veces. Los resultados se muestran como la media ± SD (* = p & lt; 0,001).
migración y la invasión ensayos
invasión de ensayo con un ensayo de membrana y la migración recubierta con Matrigel sin Matrigel la membrana se realizaron utilizando un 24 pocillos Transwell inserciones (filtros 8μm de poros, BD Biosciences, Bedford, MA), que se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. se recogieron y se resuspendieron las células en fase exponencial (2 × 10
5 células /ml) en medio libre de suero, a continuación, se sembraron y se resuspendieron en medio de cultivo 200μl en la cámara superior. A continuación, el medio de cultivo con 20% de FBS se colocó en la parte inferior así. El Transwell se incubaron a 37 ° C y 5% de CO ambiente
2 durante la noche. Se dejó que las células T24 para migrar a través de una porosa a la parte inferior de la membrana. Después de la incubación, las células en la parte inferior de la membrana se fijaron con metanol durante 5 min y después se tiñeron con Kristallviolet. El número de células invasoras o migración de las células se determinó mediante microscopio con un aumento de 400x en cada membrana y se calculó el número medio de células por campo. Todos los ensayos se repitieron al menos tres veces de forma independiente.
Ensayos de inhibición de crecimiento
In Vivo
Seis semanas de edad, machos Balb /c ratones desnudos fueron adquiridos de Shanghai Experimental Animal Center, de Shanghai, china. El len-
NDRG2
grupo y las células del grupo LEN-lacZ se recogieron y se resuspendieron con 1 × PBS y la concentración se ajustó a 5 × 10
7 por ml, solución de células 200μl (1 x 10
7 células) se inyectaron por vía subcutánea en los flancos izquierdos de los ratones desnudos. Los ratones se dividieron al azar en dos grupos: Len-
NDRG2 Opiniones y LEN-LacZ (n = 5 por grupo). Cuando el tamaño medio de los tumores inoculados llegó a 300 mm
3 (como se calcula mediante la ecuación: V [mm
3] = ab
2/2)
in vivo
, los ratones fueron sacrificados por dislocación y muestras tumorales cervicales fueron recogidos, fotografiados y medidos por sus volúmenes y peso. Los ratones se diseccionaron para comprobar si había metástasis en otro órgano y los ganglios linfáticos. La expresión de
NDRG2
proteína en los tumores inoculados de los ratones nude se detectó por Western blot. También se midieron otros marcadores para la expresión de proteínas, incluyendo las proteínas del ciclo celular: cyclinD1, CDK4; proteína de apoptosis de las células: p21; la migración celular y la invasión de proteínas:. MMP-2, MMP-9
(A) T24cells infectadas con Len-
NDRG2
lentivirus eran más obviamente arrestado en G0 /G1cycle. (B) Los porcentajes de células apoptóticas en Len-
NDRG2
grupos fueron mayores que en los otros dos grupos (1-3). 48 h después de la infección (4-6); 72 h después de la infección; (1 y 4) de control en blanco (PBS); (2 y 5) LEN-LacZ; (3 y 6) Len-
NDRG2
. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente para al menos tres veces. Los resultados se muestran como la media ± DE
Grupo
NDRG2. (-)
NDRG2 (+)
X
2
valor
valor p
normal tissue312Bladder carcinoma59388.761. & lt; 0.01Table 1. La expresión de NDRG2 en los tejidos normales de carcinoma de tejido de la vejiga y de la vejiga
CSV Descargar Análisis CSV
estadística
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS17.0 (empresa SPSS, IN). Todos los datos se representan como la media ± error estándar derivado de al menos tres experimentos independientes. Por inmunohistoquímica, las diferencias entre los grupos fueron validados utilizando las pruebas de Chi-cuadrado y correlación de Pearson. El análisis de varianza (ANOVA), Student-Newman-Keuls (SNK) pruebas y test no paramétrico se realizaron para determinar si había diferencias entre los resultados de los ensayos de
in vitro
y
in vivo
ensayos. Un
P
-valor inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
La frecuencia de la expresión positiva de
NDRG2 Hoteles en tejidos de carcinoma de vejiga era 39.17 % (38/97), que fue menor que en los tejidos normales de la vejiga (80%, 12/15), (χ
2 = 8,761,
P
& lt; 0,01) (Tabla 1).
NDRG2
expresión, tanto en frecuencia como los niveles, no fue correlacionada con el género o la edad, pero se correlacionó inversamente con el estadio del tumor (r = -0,248,
P Hotel & lt; 0,05) (Tabla 2) . La inmunohistoquímica mostró que
NDRG2
proteico positivo manchaba en el citoplasma de los tejidos normales y carcinoma de vejiga (Figura 1A). Los niveles de expresión de
NDRG2 Hoteles en carcinoma de vejiga se correlacionaron inversamente con c-Myc en carcinoma de vejiga (r = -0.454,
P Hotel & lt; 0,001). (Figura 1B)
(a) El efecto de
NDRG2
sobreexpresión de ciclo celular G1 y la apoptosis como reguladores ensayó mediante western blot. (B) Cuantificación relativa de la expresión de proteínas, normalizado a los niveles de GAPDH. La figura muestra la tendencia de cada grupo como se indica. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente para al menos tres veces. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar (** p & lt; 0,01) ..
Clinicopathological
nivel de expresión de NDRG2
valor r
p-valor
Características -
+
++ +++
Sexo Masculino 401173Female 1912500.320.759Age ≤60years231061 & gt; 60 años 361362- 0.0490.637Grade Papilloma10442Low22961High271020-0.2480.014Table 2. la relación entre la expresión de NDRG2 y las características de carcinoma de vejiga.
los datos se presentan como n (número de muestras). La significación estadística se evaluó con la prueba de correlación de Pearson. Descargar CSV CSV
Tanto western blot y PCR en tiempo real mostraron que las tres líneas celulares antes de Cristo tenían menores niveles de expresión de
NDRG2
proteína y ARNm de las células de la vejiga humanos normales (SV-HUC-1). Entre las tres líneas celulares antes de Cristo, las células T24 mostraron los más bajos niveles de expresión (Figura 2A, B).
(A) Análisis de la invasión de las células T24 tratadas con Len-
NDRG2
. La capacidad de invasión se estimó mediante Transwell recubierta con Matrigel. La invasividad de Len-
NDRG2
células grupo fue significativamente menor que en los otros dos grupos. ** P & lt; 0,001. (B) Análisis de migración de las células T24 tratadas con Len-
NDRG2
. La capacidad de migración se estimó mediante Transwell no recubierto con Matrigel. La capacidad de migración de las len-
NDRG2
células grupo fue significativamente menor que en los otros dos grupos. ** P & lt; 0,001. (C y D) La expresión de MMP-2 y MMP-9 se midieron después de las células T24 se infectaron con len-
NDRG2
. Len-
NDRG2
grupo reducido de MMP-2 y MMP-9 expresión en comparación con los otros grupos (** p<0.01).
Group
G0/G1
G2/M
S
Apoptosis
Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± ± 0.4720.10 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± ± 0.1515.34 0.1712.88 ± 3.01Table 3. La proporción de la fase del ciclo celular y la apoptosis celular inducida por Len- NDRG2 en células T24.
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(a) len-
NDRG2
suprime el crecimiento de tumores en comparación con LEN-LacZ. Además del crecimiento del tumor no suprimida, el grupo LEN-lacZ se encontró que tenían metástasis en los ganglios linfáticos. (B) curvas de crecimiento del tumor. (C) las relaciones de masas tumorales a las masas de ratón en diferentes grupos. (D) masas de tumores en dos grupos. las curvas e histogramas se elaboraron basan en los valores medios ( . n = 5) en dos grupos los resultados se muestran como la media ± SD (*, ** p & lt;. 0.001) guía empresas
se demostró mediante microscopía de fluorescencia que la eficacia de la infección era alto bienestar más del 95% (Figura 3A). en tiempo real PCR análisis mostró que los niveles de expresión de ARNm de
NDRG2
en el len-
NDRG2
grupo fue significativamente mayor que en el LEN-lacZ (grupo negativo) y grupos CON (
P
& lt; 0,05) (Figura 3B). El análisis de transferencia Western mostró que la
NDRG2
nivel de proteína en la len-
NDRG2
grupo fue mayor que en los grupos CON (Figura 3C) LEN-lacZ y. El len-
NDRG2
también causó la sobreexpresión de
NDRG2 Hoteles en células T24. La formación curvas de crecimiento de células y colonias mostró que la sobreexpresión de
NDRG2
podría suprimir el crecimiento de las células T24 más que la de los otros dos grupos. En los ensayos de curvas de crecimiento celular, la inhibición se inició a la tercera días y se hizo más obviamente a partir de entonces (F≥44.58,
P
& lt; 0,01) (Figura 4). El FCA mostró que las células T24 con len-
NDRG2
podrían aumentar la proporción de células en G
0 /G
1 en comparación con los grupos LEN-LacZ y control negativo, indicando que el ovexpression de
NDRG2
habían hecho las células T24 de detención en el ciclo G1 (48 h: F = 41,92,
P Hotel & lt; 0,01; 72 h: F = 24.11,
P
& lt; 0,01). (Figura 5, Tabla 3.) El western blot mostró que la sobreexpresión de
NDRG2
downregulated CDK4 y cyclinD1, mientras que p21 regular al alza en las células T24 (Figura 6a, b).
(A) La efecto de
NDRG2
sobreexpresión en el ciclo celular, la apoptosis y metástasis como reguladores ensayó por transferencia de Western. (B) Cuantificación relativa de la expresión de proteínas, normalizado a los niveles de GAPDH. Western blots se analizaron con software unidimensional Kodak Digital Science. La figura muestra la tendencia de cada grupo como se indica. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente para al menos tres veces. Los resultados se muestran como la media ± SD (* p & lt; 0,01).
ensayos de migración Transwell y ensayos de invasión Transwell recubiertas con Matrigel se realizaron con células T24. Las micrografías representativas fueron tomadas de la superficie inferior del filtro transwell, y células que migraron o invadieron fueron teñidas con Kristallviolet. Como se muestra en la Figura 7A, el potencial invasivo, que se determina por la capacidad de las células para invadir una barrera Matrigel, también se suprimió considerablemente en
NDRG2
-overexpressing células (
P
& lt; 0,01 ). Además, la expresión de
forzado NDRG2
en células T24 suprimió significativamente su migración a través de la transwell (P & lt; 0,01). (Figura 7B)
En ensayos de Western blot, en comparación con la LEN-lacZ grupo y controles en blanco, el grupo de len-
NDRG2
puede suprimir la MMP-2, MMP-9 nivel de expresión de proteínas en células T24 (Figura 7C, D). MMP-2 y MMP-9 fueron altamente expresado en la metástasis del cáncer de vejiga, por lo que el
NDRG2
probablemente inhibe la metástasis de cáncer de vejiga mediante la regulación de la expresión de MMP-2 y MMP-9.
las curvas de crecimiento del tumor se elaboró mediante la medición del tamaño de los tumores. Todos los ratones desnudos sobrevivieron después de las inyecciones con lentivirus. Las células fueron inyectadas T24 2 semanas más tarde, el volumen del tumor de los dos grupos comenzaron a aparecer de manera diferente. De tres semanas, la diferencia en el volumen del tumor comenzó a mostrar estadística significativa (F≥31.65, p & lt; 0,001) (Figura 8B). En comparación con el grupo LEN-lacZ, el peso del tumor por len-
NDRG2
fue significativamente más ligero (F≥39.82, p & lt; 0,001) (Figura 8D). La relación de peso del tumor de peso de ratón indicó que la condición física de los ratones en len-
NDRG2
grupo era mucho mejor que la de los ratones en el grupo LEN-LacZ (F = 39.81, p & lt; 0,001) (Figura 8C), lo que indica que la sobreexpresión de
NDRG2
podría suprimir el crecimiento de tumores. Al anatomizing los ratones, las metástasis de ganglios linfáticos ipsilaterales se muestran en el grupo LEN-LacZ, pero no otros órganos estaban involucrados; Sin embargo, en el NDRG2 Len-
grupo sin ninguna lesión metastásica se encontró (Figura 8A). Western blot mostró que el
NDRG2
proteína se reguló en los tumores de Len-
NDRG2
grupo, y que la sobreexpresión de
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downregulated cyclinD1, CDK4, MMP-2, MMP-9; y p21 upregulated
in vivo gratis (Figura 9A, B).
Discusión
Aproximadamente el 75% de todos los pacientes con cáncer de vejiga vuelva a ocurrir dentro de los primeros 5 años [14], este alta tasa de recurrencia de cáncer de vejiga y su potencial metastásico significativa han hecho de la atención y el pronóstico de los pacientes impugnable. Por lo tanto, para aumentar la tasa de diagnóstico precoz y también para establecer nuevos enfoques terapéuticos se necesitan con urgencia a través de la investigación de cáncer de vejiga.
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es un gen supresor de tumor candidato, y una serie de estudios han confirmado que juega un papel importante en la proliferación celular, la apoptosis y la metástasis [15,16]. Nuestros resultados en el estudio actual obtenido a partir de cáncer de vejiga apoyan estos hallazgos preliminares.
Hemos demostrado que
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juega un papel importante en el cáncer de vejiga que es similar a su papel en otros tumores malignos. inmunohistoquímica resultados mostraron que el nivel de expresión positiva de
NDRG2 Hoteles en tejidos de carcinoma de vejiga fue significativamente menor que en los tejidos normales de la vejiga. Los niveles de expresión de
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disminuyó a medida que el grado de malignidad de carcinoma de vejiga aumentado. También se encontró que la expresión de
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se correlacionó inversamente con c-Myc, similar a la observada en otras células tumorales. Mientras tanto, el
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niveles de expresión en líneas celulares de cáncer de vejiga (T24, 5637 y BIU-87) fueron inferiores a la línea celular normal de la vejiga (SV-HUC-1).
Los lentivirus han sido demostrado ser adecuado para la terapia génica, debido a que pueden estabilizar integrar en el genoma huésped para proporcionar la expresión a largo plazo del gen diana, además, los lentivirus se han confirmado ser progresivamente seguro por el desarrollo de los sistemas de plásmido de división para la producción de vectores para evitar la generación de competente para la replicación del virus [17].
Las investigaciones llevadas a cabo por Liu et al. se indica que
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era un nuevo gen diana que está regulado por p53 y
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los niveles de ARNm y proteínas pueden ser de hasta reguladas de una manera dependiente de p53. E informaron además que el silenciamiento de
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atenúa la apoptosis mediada por p53 [18]. Mientras tanto, se informó que
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-hasta podría regular la expresión de p53 en células de cáncer de mama [19]. Estos datos sugieren fuertemente que
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fue un factor importante en la regulación de la apoptosis de las células tumorales. Mientras tanto, el CDC20 estaba regulado por p53 para inhibir las células cancerosas malignas crecen [20]. Ciclina D1 desempeña un papel importante en el ciclo celular, se une a quinasas dependientes de ciclina (CDK4 /6), y promueve la fosforilación de RB1, la orquestación de progresión a través del punto de restricción de G1 [21].
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puede regular la expresión de las proteínas (p21, cyclinD1 y CDK4) en células de cáncer de vejiga a través de la regulación de p53. Utilizamos lentivirus mediada por
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estrategia de sobreexpresión de inhibir la proliferación de células T24, para promover su apoptosis tanto
in vitro
y
in vivo
; este mecanismo se ha demostracted mediante la regulación de la expresión de las proteínas p21, cyclinD1 y CDK4, que son importantes en la apoptosis celular y el ciclo
.
Recientemente, varios informes sugieren que
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podría desempeñar un papel vital en la inhibición de la metástasis tumoral. Se ha informado de que
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podría antagonizar de crecimiento transformante invasión de células tumorales mediada por factorβ1 específicamente abajo de la regulación de la expresión de metaloproteinasa de la matriz 2 y laminina 332 componentes de la vía, con supresión concomitante de la actividad de Rho GTPasa en carcinomas hepatocelulares [22 ]. La MMP-2 y MMP-9 fueron alta expresión en el cáncer de vejiga con invasión muscular y metastásico del cáncer de vejiga [21,23]. En este estudio, el ensayo de western blot mostró que Len-
NDRG2 Hoteles en células T24 se asoció con una reducción significativa de la MMP-9 expresión y reduce ligeramente la MMP-2 expresión que sugiere que
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-overexpression puede regular la expresión de MMP-2 y MMP-9 y la capacidad de inhibir la invasión de células de cáncer de vejiga metastásico. Esta conclusión fue respaldada por
in vivo
y
in vitro
ensayos. Tenemos la sospecha de que la expresión de
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suprime significativamente la MMP-2 y MMP-9 mediante la regulación de la señalización NF-kB en las células de cáncer de vejiga [24].
En conclusión, tenemos antioncogénico demostrado el papel de
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en el desarrollo y la invasión de cáncer de vejiga. Desde
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está implicada en muchos aspectos de la progresión del tumor, incluyendo el crecimiento celular, la regulación del ciclo celular, la invasión y la migración, que representa un objetivo terapéutico prometedor para el cáncer de vejiga. Sin embargo, más investigaciones siguen siendo necesarios para esclarecer aún más el mecanismo de
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. La investigación en esta dirección, finalmente, proporcionará nuevos métodos para el diagnóstico precoz, el tratamiento y el monitor novela postoperatoria en el cáncer de vejiga.