Extracto
catión orgánico /transporte de carnitina 2 (OCTN2) es responsable de la captación celular del agente antineoplásico, oxaliplatino. modificación epigenética es un posible mecanismo de expresión fármaco-transportador alterado en el cáncer, lo que se altere la eficacia de los fármacos quimioterapéuticos. Sin embargo, los mecanismos que gobiernan la regulación OCTN2 no se entienden completamente. En este estudio, los niveles bajos de OCTN2 en HepG2 y células LS174T fueron elevados por el reactivo de desmetilación, decitabina (DCA). Para revelar aún más el mecanismo epigenético de la baja regulación de OCTN2, encontramos que la Región-1 dentro de la
OCTN2
promotor (que abarca -354-85) fue un determinante de expresión OCTN2 en un ensayo indicador de luciferasa. Por otra parte, PCR específica de metilación (MSP) y secuenciación genómica bisulfito mostró que el grado de sitios CpG metilados individuales dentro de esta región se correlacionó inversamente con los niveles de OCTN2 en diferentes células cancerosas. Aplicación de DCA a las células HepG2 y LS174T invierte el estado de hipermetilación del
OCTN2
promotor y aumentó OCTN2 expresión, la mejora de la captación celular de oxaliplatino. Por lo tanto, se identificó que la metilación del promotor es responsable de la epigenética baja regulación de OCTN2 en HepG2 y células LS174T. Dado el papel esencial de OCTN2 en la absorción de cáncer de células de agentes quimioterapéuticos, y por lo tanto la eficacia del tratamiento, el tratamiento previo con un reactivo de desmetilación es una posible estrategia para la optimización de las farmacoterapias contra los cánceres
Visto:. Qu Q, Qu J, Zhan M, Wu LX, Zhang YW, Lou XY, et al. (2013) Participación diferente de la metilación del promotor en la expresión de catión orgánico /Carnitina Transporter 2 (OCTN2) en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (10): e76474. doi: 10.1371 /journal.pone.0076474
Editor: Suresh Yenugu, Universidad de Hyderabad, India
Recibido: 16 Julio, 2013; Aceptado: 29 Agosto 2013; Publicado: 16 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Qu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de becas del Estado de Consejo de Becas de China (Expediente N ° 201 206 370 103), la Fundación Científica Nacional de China (Nº 81273595, 81072706), la Fundación Científica de Hunan (núm 11K073, 10JJ4020), el Proyecto de "863" (núm 2012AA02A518), NCET-10 hasta 0843 y la Fundación de Investigación de Innovación del estudiante de tercer ciclo en la provincia de Hunan, China (CX2011B056). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el humano
SLC22A5
gen, que codifica un transportador de 63 kDa catión orgánico /2 carnitina (OCTN2), se encuentra en la región de clúster de citoquinas en el cromosoma 5q31 [1], [2]. OCTN2 se expresa en diversos tejidos, incluyendo riñón, músculo esquelético, corazón, colon, cerebro, hígado, etc [3]. defectos funcionales de OCTN2 están asociados con varias enfermedades, incluyendo la deficiencia primaria de carnitina, la enfermedad de Crohn y el asma [4] - [8]. OCTN2 no sólo transporta carnitina, pero también reconoce la terapéutica clínicamente importantes, tales como mildronate, verapamilo, pirilamina, oxaliplatino, imatinib y cefaloridina [9] - [13]. OCTN2 se asocia con la acumulación de oxaliplatino y la citotoxicidad en células HEK293 transfectadas OCTN2-[11]. Los dos alelos de
OCTN2
(rs2631367 y rs2631372) pueden ser predictores importantes en pacientes tumor del estroma gastrointestinal reciben terapia con imatinib [12]. Estos informes indican que los defectos funcionales y /o expresión aberrante de OCTN2 pueden afectar a la disposición y la posterior eficacia terapéutica de sus sustratos.
Varios informes sugieren la participación de peroxisoma alfa del receptor activado por el proliferador (PPARA) y gamma ( PPARg) en la regulación transcripcional de OCTN2 en diversos tejidos. Sin embargo, la baja regulación de OCTN2 ha sido reportado en los tumores con elevada expresión de PPARA y PPARg [14] - [16]. Un estudio reciente encontró que los niveles disminuidos de OCTN2 en varias líneas celulares de cáncer epitelial podría ser restaurado por el reactivo de desmetilación 5-aza-citidina [17]. Estos resultados implican que otros mecanismos cooperan con la red de factor de transcripción para modular la expresión de OCTN2, tales como la metilación del ADN. Metilación
ADN es un mecanismo epigenético importante que modula la expresión génica. El dinucleótido CpG cerca de los sitios de inicio de la transcripción es abundante en los promotores de genes, y se refiere como islas CpG. La metilación de las islas CpG se asocia con la transcripción de genes reprimidos y la metilación del ADN anormal puede conducir a la expresión aberrante de genes. A diferencia de la mutación del gen, la metilación del ADN puede ser reversible alterada por agentes de desmetilación tal como la decitabina (5-aza-2 'desoxicitidina, DCA) y 5-aza-citidina. Estos agentes se incorporan en el ADN e inactivan citosina ADN C5-methyltransferases [18]. Por lo tanto, la hipótesis de que el estado de metilación diferencial de
OCTN2
puede estar correlacionada con la expresión aberrante de OCTN2 en las células cancerosas.
En este estudio, se investigó si la metilación de islas CpG actúa como un posible mecanismo responsable de la baja regulación de OCTN2 en líneas celulares de cáncer. Mediante el uso de la PCR específica de metilación (MSP), la secuenciación genómica de bisulfito, y
in vitro
ensayos de metilación, nos han proporcionado pruebas de que la metilación del promotor de ADN es un mecanismo esencial suprimir OCTN2 expresión en líneas celulares de cáncer. La aplicación de un reactivo de desmetilación, que modula el estado de metilación de la
OCTN2
promotor, aumentó la expresión de OCTN2 e hizo las células cancerosas sean más sensibles al oxaliplatino.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
Decitabine, bisulfato de sodio, hidroquinona y oxaliplatino se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). reactivo TRIzol y Lipofectamine 2000 fueron obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA).
Cultivo celular y tratamiento con DCA
La línea celular de hepatoma HepG2, cáncer de colon línea celular LS174T, glioma línea celular U251, línea celular de cáncer de las vías biliares QBC-939 y el mono africano riñón línea celular COS-7 verdes se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las líneas celulares se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2, excepto la línea celular QBC-939, que se cultivó en RPMI 1640. Las células se tratados con DCA a una concentración final de 0,5 M o 1 M y renovado cada 24 h durante una semana.
purificación de ARN, síntesis de cDNA y cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN celular total fue aislado a partir de las células tratadas utilizando el reactivo TRIzol. cDNA fue sintetizado a partir de 1 g de ARN total usando la primera síntesis de ADNc kit (Takara, Dalian). RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR Green (Bio-rad) y los cebadores se enumeran en la Tabla S1. RT-PCR se realizó durante 40 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s, seguido de una extensión final a 72 ° C durante 2 min. La expresión de mRNA relativa se normalizó a la limpieza de genes
β-actina
y el análisis se llevó a cabo utilizando el 2
-ΔΔCt método [19].
Western Blot
total de las proteínas celulares se extrajeron y las concentraciones se cuantificaron mediante el ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Las proteínas se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en 10% geles de poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se sondeó con un anticuerpo anti-conejo OCTN2 (1:400, laboratorios de Abcam, Cambridge, MA) o anticuerpo β-actina (1:1000, Abcam Labs). Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo marcado con DyLight 800 de conejo policlonal (1:7500, KPL Inc., Gaithersburg, MD), protegido de la luz. Las membranas fueron teñidos escaneados por el sistema óptico de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences). Se calcularon las proporciones de OCTN2 contra β-actina.
Ensayo de viabilidad celular
líneas celulares de cáncer fueron tratados con 1 mM DCA o DMSO al 0,1% durante una semana. Posteriormente, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 /pocillo, y se expone a oxaliplatino a diversas concentraciones (0, 0,3, 1, 3, 10, 33, 100 o 330 mM) para 48 h. La viabilidad celular se midió por el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI) y IC
50 valores se calcularon con el programa SPSS versión 13.0.
metilación específica de PCR (MSP) y el bisulfito de secuenciación PCR (BSP)
para predecir las regiones ricas en dinucleótidos CpG cerca del sitio
OCTN2
inicio de la transcripción, se utilizó el software metil-Primer (http://www.urogene.org/methprimer/) de acuerdo con la siguientes criterios: la longitud de la isla CpG & gt; 100 pb, observada /esperada relación CpG & gt; 0,6 y el porcentaje de G más C & gt; 50%. Se realizaron búsquedas en el
OCTN2
secuencia genómica que incluye 1,5 kb aguas arriba y aguas abajo de 2 kb del sitio de inicio de transcripción (TSS). De acuerdo con las islas CpG predichos, MSP y cebadores BSP se han diseñado y se enumeran en la Tabla S1. Se aisló el ADN genómico de líneas celulares de cáncer y modificación con bisulfito del ADN se realizó como se describe [20]. Bisulfito de ADN modificado se recuperó por Asistente Up System Clean ADN (Promega) y se trató con 5,5 l de NaOH y luego se precipita con etanol. El ADN precipitado se resuspendió en agua, y luego amplificada con MSP o BSP cebadores. La condición de la PCR fue como sigue: 94 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 s, temperatura de hibridación (Tabla S1) durante 30 s, 72 ° C durante 60 s, y finalmente 72 ° C durante 5 min. Los fragmentos de ADN amplificados se corrieron en geles de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de etidio. productos BSP se purificaron mediante un kit de purificación de ADN (Takara, Dalian) y se insertan en pGEM-T vector fácil (Promega). Cinco clones para cada línea celular se seleccionaron aleatoriamente y se secuenciaron. La secuencia metilada de
OCTN2
se comprobó la alineación utilizando methBLAST.
Construcción de plásmidos y
in vitro
La metilación de ensayo
De acuerdo con las islas CpG en predichos la secuencia genómica, que divide el promotor en tres regiones. Se amplificaron tres regiones que contienen diferentes islas CpG (cebadores listados en la Tabla S2) y se insertaron en el vector pGL4.17 (Promega). Estos recombinantes, pGL4.17-Región1, Región2 y Región 3 se verificaron mediante secuenciación automática. El plásmido respectivo fue linealizado por
Xho I y
sometido a
in vitro of the metilación de ensayo como se describe en nuestros trabajos anteriores [21]. Los productos de metilación fueron digeridos por
Kpn I y
inserta en el vector pGL4.17. Estos nuevos recombinantes que contienen las regiones promotoras metilados fueron nombrados pGL4.17-mRegion 1, pGL4.17-mRegion 2 y pGL4.17-mRegion 3, respectivamente.
transfección transitoria y Luciferase Informe de ensayo
COS-7 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos a una densidad de 10
5 /pocillo en 500 l DMEM y 10% de FBS. Después de 8 h, las células fueron transfectadas con vectores de luciferasa construidos (0,2 g /pocillo) usando Lipofectamine 2000. El vector pGL4.17 que carece de un promotor sirvió como control negativo. Se utilizó el vector de control interno PRL-TK (0,02 g /pocillo) para normalizar la actividad de luciferasa. Después de 8 h, cada pocillo de células transfectadas se lavó dos veces y luego se añadieron 100 l de tampón de lisis reportero para lisar las células. Cada grupo tenía pocillos por triplicado y se repitió más de tres veces. actividad luciferasa dual (unidades relativas de luz, RLU) se determinó mediante un luminómetro.
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron con un ANOVA de una vía para la significación seguido de una prueba post-hoc utilizando el software SPSS 13.0. comparación de los datos con un
p valor Red de menos de 0,05 (
p Restaurant & lt; 0,05). Se consideraron significativamente diferentes
Resultados
OCTN2 ARNm y proteínas niveles en diferentes líneas celulares de cáncer
ARN celular total y las proteínas se extrajeron a partir de líneas celulares de cáncer y OCTN2 expresión se midió por RT-PCR cuantitativa y transferencia Western, respectivamente. La expresión más alta de OCTN2 estaba en QBC-939, seguido de U251, LS174T y células HepG2 (Fig. 1). Las expresiones de OCTN2 en las células U251 QBC-939 y fueron significativamente más alta que en U251, las células LS174T (
p
& lt; 0,05).
(A), el análisis de los niveles de mRNA de OCTN2 en líneas celulares de cáncer. El ARN total en células de cáncer se purificó mediante reactivo TRIzol para la síntesis de ADNc y los niveles de mRNA de OCTN2 se analizaron por RT-PCR cuantitativa. (B), el análisis de los niveles de proteína de OCTN2 en células de cáncer. Las proteínas totales se extrajeron y los niveles de proteína de OCTN2 se analizaron por Western Blot. La expresión relativa de ARNm y proteínas se normalizó a ß-actina. La expresión de HepG2 se establece como 1. Todos los ARNm y análisis de proteínas se realizaron tres veces. Diferencia significativa a partir de células HepG2 o LS174T se denota con asterisco (*,
p Hotel & lt; 0,05) o el signo de número (#,
p Hotel & lt; 0,05), respectivamente
Efectos de DCA en la expresión de OCTN2 en líneas celulares de cáncer
para examinar si las expresiones discrepantes de OCTN2 en diferentes líneas celulares de cáncer se debió a la metilación del promotor, se trataron las líneas celulares de cáncer con DCA y determinamos la expresión restaurada de OCTN2. En la Fig. 2, DCA notablemente hasta reguladas la expresión relativa de ARNm OCTN2 y proteínas en las células HepG2 con 0,5 M (1,38 veces, 1,61 veces) y 1 tratamiento M (1,52 veces, 2,07 veces) (
p
& lt; 0,05), en comparación con el grupo control. Del mismo modo, el tratamiento de DCA conduce a un aumento de los niveles de OCTN2 en las células LS174T. Sin embargo, el DCA no cambió la expresión de OCTN2 en células U251, que ya tenían altos niveles de expresión OCTN2 QBC-939 y
.
(A), el análisis de los niveles de mRNA de OCTN2 en líneas celulares de cáncer tratados con DCA. Después del tratamiento con 0,5 y 1 M DCA, el ARN total en células de cáncer se purificó mediante reactivo TRIzol para la síntesis de ADNc y los niveles de mRNA de OCTN2 se analizaron por RT-PCR cuantitativa. (B), el análisis de los niveles de proteína de OCTN2 en líneas celulares de cáncer tratados con DCA. Las proteínas totales se extrajeron y los niveles de proteína de OCTN2 se analizaron por Western Blot. La expresión relativa de ARNm y proteínas se normalizó a ß-actina. Los datos presentados representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. Diferencia significativa del grupo de control de DMSO al 0,1% se denota con asteriscos (*,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01).
OCTN2 secuencia genómica Puertos Tres islas CpG
Se realizaron búsquedas en el
OCTN2
secuencia genómica para la ubicación de los dinucleótidos CpG utilizando el software metil-imprimación. dinucleótidos CpG se encuentran ampliamente situados cerca de la SAT (Fig. 3A). De acuerdo con la intensidad ubicación de dinucleótidos CpG, se observaron tres islas CpG putativas localizadas en el
OCTN2
secuencia genómica. CpG isla-2 se encuentra cerca de UTR y el exón 1, la isla CpG-3 se encuentra en el intrón 1, y la isla CpG-1 se encuentra aguas arriba de la TSS (Fig. 3A).
(A), análisis computacional reveló tres islas CpG putativos dentro de la secuencia genómica OCTN2 por el software metil-imprimación como se describe en
material y Métodos
. (B), el análisis de MSP para las islas CpG de OCTN2 en 1 M DCA líneas celulares de cáncer tratados y no tratados. MSP se realizó con los cebadores específicos para amplificar la diana CpG fracciones islas y correr en un gel de agarosa al 2%. Todo el análisis de MSP y BSP se repitieron en tres ocasiones. U: secuencia no metilada; M:. Metilado secuencia
estado de metilación de las islas CpG dentro OCTN2 por MSP
Para aclarar aún más el estado de metilación de las islas CpG dentro de
OCTN2
en diferentes células del cáncer líneas, se analizaron tres islas CpG por MSP, distingue el ADN metilado a partir de ADN no-metilado. En la Fig. 3B, la isla CpG-1 (CpG1) estaba completamente metilado en las células HepG2, parcialmente metilado en las células LS174T y U251, y un-metilado en las células QBC-939. productos parcialmente metilados de la isla CpG-2 (CPG2) fueron encontrados en LS174T y células QBC-939, pero éstas eran un-metilado en células HepG2 y U251. En casi todas las líneas celulares, la isla CpG-3 tenía más productos metilados que no metilado. En la Fig. 3C, después del tratamiento con DCA, los productos de un-metilado de CpG1 se incrementaron en HepG2, LS174T y células U251. Este hallazgo indica que DCA puede causar de-metilación dentro de CpG1. Un resultado similar se observó en CPG2. tratamiento DCA se incrementó productos no-metilados de CpG3 en las células HepG2, pero no causó cambios significativos en otras células.
Efecto de metilado y no metilado-Un regiones promotoras de la transcripción de la Actividad OCTN2 utilizando un
in vitro
luciferasa reportero de ensayo
Para determinar qué metilado islas CpG juegan un papel esencial en la regulación negativa de OCTN2, se construyeron plásmidos informadores de luciferasa teniendo regiones ya sea un-metilados o metilados (Fig. 4). plásmidos construidos se transfectaron en células COS-7 y se utilizaron para evaluar la actividad transcripcional. En comparación con pGL4.17 (Control), pGL4.17-Región1 representada aumentó notablemente la actividad de luciferasa de 102,5 veces (
p Hotel & lt; 0,01), mientras que la actividad de la luciferasa de pGL4.17-Región2 y Región 3 fuera sólo aumento de 11,4 veces y 3,5 veces (
p Hotel & gt; 0,05). Este resultado indica que la Región 1 que abarca desde -354 hasta 85 pb juega un papel esencial en la actividad promotora. Curiosamente, sólo la actividad de la luciferasa de un-metilado Región-1 fue más alta que su vector metilado (29,7 veces,
p
& lt; 0,01). Regiones-2-metilados de la ONU y -3 no mostraron diferencias significativas en la actividad luciferasa en comparación con sus correspondientes regiones metiladas. Es posible que los estados de metilación de la Región-2 y -3 que contienen CpG isla-2 y -3, respectivamente, son irrelevantes para
OCTN2
expresión. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el aumento de la metilación puede inhibir la actividad promotora de la Región-1.
Construido vector de luciferasa pGL4.17 que contiene regiones promotoras no metilados y metilados se transfectaron en células COS-7 con el vector de control pRL-TK. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se lavaron y se ensayaron para actividad de luciferasa. la actividad de luciferasa relativa se midió en pocillos por triplicado. Los datos presentados representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. diferencia significativa entre el grupo de tratamiento de pGL4.17 se denota con asteriscos (*,
p Hotel & lt; 0,05; **,
p Hotel & lt; 0,01). diferencia significativa entre el grupo de la región de metilado en la misma región se denota con un signo de número (#,
p Hotel & lt; 0,05).
Determinación de perfiles de metilación del ADN de OCTN2 por BSP
Para evaluar el perfil de metilación de CpG en los sitios Región-1, la secuenciación genómica de bisulfito en varias líneas celulares de cáncer se llevó a cabo. En la Fig. 5A, la secuencia genómica del promotor OCTN2 se visualiza y sitios CpG fueron marcados. Una secuencia metilada de
OCTN2
abarca -325 a -92 pb en las células HepG2 se comprobó para la alineación usando methBLAST y se presenta en la Fig. 5B. Otras secuencias metiladas de LS174T, QBC-939 y las células U251 se presentan en la Fig S1, S2 y S3. En la Fig. 5C, los perfiles de metilación mostró que las tasas de sitios CpG metilados (/número total CpG mCpG) fueron 72,2% y 60,0% en las células HepG2 y LS174T, respectivamente, que es mucho más alta que las tasas de metilación medidos en QBC-939 (20,0%) y U251 células (11,1%). Por otra parte, después de 1 mM tratamiento DCA en HepG2, las tasas de sitios CpG metilados se redujo a 13,3% (fig. 6). Dado que los sitios CpG hipermetilados dentro de OCTN2 son rescatados por tratamiento DCA en células HepG2 y LS174T, estos resultados proporcionan evidencia directa de que los sitios CpG metilados individuales en el promotor puede regular con precisión la expresión de OCTN2.
(A), la secuencia genómica que abarca -325 a -92 pb en el promotor de la región-1 de
OCTN2
. Dieciocho sitios CpG fueron localizados y marcados. (B), bisulfito de análisis de secuenciación genómica de la Región-1 de
OCTN2
en células HepG2. Bisulfito de ADN modificado fue amplificado por BSP como se describe en
Materiales y métodos
y luego secuenciados. señaló la estrella representa sitios CpG metilados. (C), los perfiles de metilación del ADN de los dinucleótidos CpG metilados individuales en cuatro líneas celulares de cáncer. Después de BSP, cinco clones se seleccionaron y se secuenciaron al azar. Las secuencias metiladas se comprobaron para la alineación usando methBLAST. Los círculos abiertos y cerrados representan citosinas no metiladas o metilados, respectivamente.
(A), bisulfito de análisis de secuenciación genómica de las células HepG2 tratadas con DCA. Después de que el tratamiento de la DCA, el ADN se extrajo y se sometió a modificación con bisulfito. Bisulfito de ADN modificado fue amplificado por BSP como se describe en
Materiales y métodos
y luego secuenciados. señaló la estrella representa sitios CpG metilados. (B), los perfiles de metilación del ADN de los dinucleótidos CpG metilados individuales en células HepG2 tratadas con DCA. Después de BSP, cinco clones se seleccionaron y se secuenciaron al azar. Las secuencias metiladas se comprobaron para la alineación usando methBLAST. Los círculos abiertos y cerrados representan citosinas no metiladas o metilados, respectivamente.
Efectos de DCA en mejorar la sensibilidad de las células del cáncer de oxaliplatino
Para entender mejor si el estado de metilación de la
OCTN2
gen afecta a la sensibilidad de las células cancerosas a oxaliplatino, las células cancerosas fueron pre-tratados con DCA seguido de exposición a oxaliplatino. La viabilidad celular se evaluó y se calcularon los IC
50 valores. En la figura 7. A, cuando las células fueron expuestas al oxaliplatino a los 3, 10, 33 y 100 M, la viabilidad celular de HepG2 tratadas con DCA y LS174T se redujo en comparación con las células tratadas con DMSO (
p
& lt; 0,05 ), pero no cambió en U251 y células QBC-939. En la Fig. 7B, la IC
50 valores para las células HepG2 y LS174T tratados con DCA se redujo a 51,6% y 44,8% (
p
& lt; 0,05), respectivamente, en comparación con las células tratadas con DMSO, pero se mantuvieron sin cambios en las células U251 QBC-939 y. Por lo tanto, es posible que DCA sensibiliza a las células HepG2 y LS174T al oxaliplatino mediante el aumento de OCTN2 expresión y el aumento de la absorción de oxaliplatino.
Las células de cáncer se trataron previamente con 1 M DCA durante 1 semana, se sembraron en 96 pocillos placas a 1 × 10
4 células /pocillo en 100 l DMEM y 10% de FBS. Después de 8 h, las células fueron expuestas a oxaliplatino a varias concentraciones (0,1, 0,3, 1,0, 3,3, 10, 33, 100 o 330 mM) durante 48 h en medio de cultivo fresco. La viabilidad celular se determinó mediante un kit de ensayo de células MTS proliferantes. Cada concentración se determinó en tres pozos. Los datos presentados representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. (A), se muestra la viabilidad celular a cada concentración. Las diferencias significativas de tratamiento DMSO se indican con un asterisco (*,
p
& lt; 0,05). (B), IC
50 valores se calcularon con el software SPSS 13.0. Los datos presentados representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. diferencias significativas respecto a las células no tratadas se indican con un asterisco (*,
p Hotel & lt; 0,05).
Discusión
En este estudio, se encontró que hipermetilación en el
OCTN2
promotor es responsable de la regulación a la baja de
OCTN2 Hoteles en células HepG2 y LS174T. Hemos detectado con precisión el grado de metilación de sitios individuales metiladas CpG en la región promotora de MSP y BSP, que fue inversamente correlacionada con la expresión de OCTN2 en diferentes células cancerosas. Por otra parte, el DCA pre-tratamiento de las células HepG2 y LS174T aumentó la muerte celular inducida por oxaliplatino a través OCTN2 desmetilación.
El papel esencial de la metilación del ADN ha atraído mucho interés como un posible mecanismo subyacente a la expresión aberrante de oncogenes, supresores de tumores genes y genes de reparación del ADN en las células de carcinoma. Recientes hallazgos muestran un papel para la metilación del ADN en la regulación de la expresión de los transportadores, tales como SLC22A1, A2, A3 (OCT1, OCT2, OCT3), SLC22A18, SLC5A8, Ntcp, Oatp1b2, Bsep, ABCG2, ABCG5 /G8 [22] - [ ,,,0],27]. Para comprender el mecanismo por el cual OCTN2 expresión está reprimida en las células HepG2 y LS174T, se trataron estas líneas celulares con el DCA reactivo de desmetilación y observó un aumento en OCTN2 ARNm y los niveles de proteína en las células HepG2 y LS174T, mientras que ningún cambio se produjo en QBC-939 y las células U251. Un reciente estudio también encontró que los niveles bajos de OCTN2 se incrementaron en un DCA en papillomavirus16 humano E6 y S7- queratinocitos expresan [17]. DCA inhibe la ADN metiltransferasa enzimas (DNMTs) y otras corrompe la integridad de la huella de metilación, lo que conduce a la interrupción de las firmas y la regulación de la expresión génica [28] epigenéticos. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la regulación a la baja de OCTN2 en HepG2 y células LS174T puede deberse a la metilación aberrante promotor.
El análisis de las tres islas CpG putativos dentro de
OCTN2
, se observó que las islas CpG muestra diferentes estados de metilación en diferentes células cancerosas, y que la hipermetilación podría reducirse por DCA. Por lo tanto, hemos tratado de identificar cuál de las islas CpG desempeña un papel fundamental en la regulación de la expresión OCTN2. En el ensayo de luciferasa, sólo el promotor de la región-1 que abarca desde -354 hasta 85 pb mostró un incremento en la actividad del promotor. Por otra parte, la metilación de Región-1 que imita los patrones de metilación en las células, inhibió completamente la actividad del promotor. Este resultado proporciona la evidencia de que Región-1 es un posible factor determinante de la expresión OCTN2, porque la hipermetilación de la Región-1 inhibe la actividad transcripcional de OCTN2 en las células LS174T y HepG2.
secuenciación genómica bisulfito detectada con precisión los sitios CpG metilados individuales dentro de promotor de la región-1, que fue hypermethylated significativamente en HepG2 y LS174T comparación con las células U251 QBC-939 y. El grado de metilación del ADN se correlacionó inversamente con la expresión de OCTN2 en estas células cancerosas. Estos hallazgos pueden explicar razonablemente los niveles más bajos de OCTN2 en células HepG2 y LS174T, en comparación con la expresión en células U251 QBC-939 y. Por otra parte, el DCA invierte la metilación de CpG en los sitios Región-1 en las células HepG2 en consonancia con el aumento de la expresión OCTN2.
dinucleótidos CpG metilado dentro de la región promotora-1 inhiben la expresión de
OCTN2
probablemente a través de dos mecanismos. En primer lugar, muchos enlaces de factor de transcripción pueden ser bloqueados por los dinucleótidos CpG metilados en el
OCTN2
promotor. Se analizaron promotor Región-1 de
OCTN2 fotos: por software TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), y encontramos que el factor de transcripción sitios de la proteína de unión a la especificidad 1 consenso (SP1) y el dedo de zinc mieloide 1 (MZF-1) se superponen algunos sitios clave CpG (Fig S4). Además se está trabajando para investigar si la metilación de CpG sitios de bloques específicos de estos factores de transcripción. Un segundo mecanismo posible es la regulación aberrante de enzimas metiltransferasa de DNA y el reclutamiento de metilación dependiente de factores de nucleoproteína tal como la proteína de unión a metil-CpG MeCP1 y MeCP2 [29] - [31]. Vamos a investigar cómo los sitios CpG hypermethylated de OCTN2 reclutan a estas proteínas relacionadas con la metilación y reprimen la expresión de OCTN2.
Dado el papel esencial de OCTN2 en la captación celular de cáncer y por lo tanto la eficacia del tratamiento de oxaliplatino, la metilación de
OCTN2
podría utilizarse como un objetivo para la mejora de la eficacia terapéutica. Después del tratamiento con 1 mM DCA, las células HepG2 y LS174T se hicieron más sensibles a oxaliplatino, pero no las células QBC-939 y U251. Por otra parte, en las células tratadas DCA, el aumento de expresión de OCTN2 confiere una mayor absorción de oxaliplatino y más citotoxicidad de las células no tratadas DCA. Aunque DCA en altas concentraciones causa inestabilidad genómica global y la citotoxicidad, DCA en bajas concentraciones actúa principalmente para inhibir DNMT en lugar de inducir la muerte celular [32]. Por lo tanto, el DCA se administró concomitantemente con oxaliplatino, y la restauración resultante de expresión OCTN2 mejora la absorción y la eficacia de oxaliplatino.
Conclusión
En conclusión, que reveló el mecanismo epigenético de la regulación a la baja de
OCTN2
en diferentes células cancerosas. La región promotora que abarca -354-85 fue un determinante de expresión OCTN2. El grado de sitios CpG metilados dentro de la región se correlacionó inversamente con los niveles de OCTN2 en células de cáncer. La aplicación del agente de desmetilación, DCA, invierte el estado de hipermetilación de la
OCTN2
promotor y aumentó OCTN2 expresión, lo que conduce a una mayor absorción de las células de cáncer de oxaliplatino que causan a ser más sensibles a oxaliplatino. Dado el papel esencial de OCTN2 en la captación celular de cáncer y por lo tanto la eficacia del tratamiento de varios agentes quimioterapéuticos, el tratamiento previo de un reactivo de desmetilación es una posible estrategia para la optimización de la farmacoterapia contra los cánceres.
información de apoyo
Figura S1. La metilación
Perfiles alrededor del sitio de inicio de la transcripción de
OCTN2
en células LS174T. Se extrajo el ADN y se sometió a modificación con bisulfito. Bisulfito de ADN modificado fue amplificado por BSP y secuenciado como se describe en
Materiales y métodos
. señaló la estrella representa sitios CpG metilados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s001 gratis (TIF)
figura S2. La metilación
Perfiles alrededor del sitio de inicio de la transcripción de
OCTN2 Hoteles en células QBC-939. Se extrajo el ADN y se sometió a modificación con bisulfito. Bisulfito de ADN modificado fue amplificado por BSP y secuenciado como se describe en
Materiales y métodos
. señaló la estrella representa sitios CpG metilados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s002 gratis (TIF)
Figura S3. La metilación
Perfiles alrededor del sitio de inicio de la transcripción de
OCTN2
en células U251. Se extrajo el ADN y se sometió a modificación con bisulfito. Bisulfito de ADN modificado fue amplificado por BSP y secuenciado como se describe en
Materiales y métodos
. señaló la estrella representa sitios CpG metilados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s003 gratis (TIF)
figura S4.
análisis del sitio de la región promotora del
OCTN2
vinculante por el software TFSEARCH factor de transcripción. Para revelar el mecanismo por el que los sitios CpG metilados inhiben
OCTN2
la transcripción, estudiamos las secuencias de consenso putativos para los factores de transcripción. sitios CpG están en las líneas rojas. secuencias consenso putativo se indican mediante líneas de puntos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0076474.s004 gratis (TIF)
Tabla S1.
Los cebadores para la RT-PCR cuantitativa, MSP y BSP
doi: 10.1371. /journal.pone.0076474.s005 gratis (PDF) sobre Table S2.
Los cebadores para la construcción de vectores indicadores de luciferasa
doi: 10.1371. /journal.pone.0076474.s006 gratis (PDF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. . Jie Liu y el Dr. Helen Renaud, que proporcionó ayuda del lenguaje.