Extracto
NEDD9, una proteína de adhesión focal andamio, se ha propuesto recientemente para regular la invasión y metástasis en algunos tipos de cáncer, pero desconocida en el cáncer cervical. El objetivo de este estudio fue determinar si NEDD9 estuvo implicado en la progresión y metástasis de cáncer de cuello uterino. Los resultados experimentales mostraron proteína NEDD9 se sobreexpresa en el cáncer de cuello de útero en comparación con los tejidos normales de epitelio cervical. La sobreexpresión de NEDD9 se correlacionó con el grado histológico, metástasis en los ganglios linfáticos, y la FIGO etapa del cáncer de cuello uterino. Silenciamiento de NEDD9 resultó en la desfosforilación de tirosina de FAK y SRC oncoproteínas, y la disminución de la migración celular y la invasión en las células SiHa y HeLa de carcinoma cervical. La sobreexpresión de NEDD9 llevó a la fosforilación de tirosina de la FAK y SRC oncoproteínas, y el aumento de la migración celular y la invasión. Por otra parte, la fosforilación de tirosina de NEDD9 se redujo de manera significativa a través de la supresión de la fosforilación de la tirosina de la FAK o SRC, lo que sugiere un bucle de retroalimentación positiva de la fosforilación de la tirosina entre NEDD9 y FAK o SRC. Además, nuestros datos muestran que el silenciamiento NEDD9 disminución de la expresión de vimentina y el aumento de la expresión de E-cadherina en células de cáncer cervical, y viceversa. E-cadherina era sujeto a la regulación de NEDD9, FAK y SRC, pero alteró ni NEDD9 total de tirosina fosforilada ni. Nuestros hallazgos sugieren que NEDD9 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de cuello uterino y células, y sobreexpresa NEDD9 promueve la migración y la invasión en células de carcinoma de cuello uterino, probablemente a través de un circuito de retroalimentación positiva de la fosforilación de la tirosina entre NEDD9 y FAK o SRC
Cita.: Sima N, Cheng x, y M, Ma D, Xie X, W Lü (2013) La sobreexpresión de la proteína de andamiaje NEDD9 promueve la migración y la invasión en el cáncer de cuello uterino a través de tirosina fosforilada FAK y SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10.1371 /journal.pone.0074594
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: 19 Febrero, 2013; Aceptado: 5 Agosto 2013; Publicado: 18 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sima y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.801.227;. 81272862), la Fundación Provincial de Zhejiang Ciencias Naturales de China (Nº Y2100403;. LY12H16020), el Programa Nacional de Investigación básica de China (Nº 2009CB521808), la fundamental Fondos de investigación de las Universidades central de china y el Programa Provincial de Zhejiang para el cultivo de talentos innovadores de salud de alto nivel. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el tercer tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado en las mujeres en todo el mundo, especialmente en los países en desarrollo. Cada año, aproximadamente 529.800 mujeres se enfrentan con esta enfermedad, lo que representa el 9% del total de los nuevos casos de cáncer [1]. Aunque las estrategias actuales de tratamiento, tales como la histerectomía radical y la radioterapia tienen buenos resultados clínicos, casi 275.100 muertes son atribuidas al cáncer de cuello uterino cada año. Además, la cirugía es sólo apto para enfermedades de la etapa y los resultados de radioterapia a principios de efectos secundarios indeseables, tales como la insuficiencia ovárica, estenosis vaginal, radiocystitis y proctitis por radiación que influyen en la calidad de vida del paciente [2]. Por lo tanto, estos hechos ponen de relieve la necesidad urgente para el desarrollo de dianas terapéuticas más eficaces y novedosos.
NEDD9 gen, identificado por primera vez en las células precursoras neuronales en 1992, se había reducido regulado durante el desarrollo del sistema nervioso central del ratón [ ,,,0],3]. Después, este gen también se encuentra en otras especies y tejidos. Law et al [4] proyectará una biblioteca de ADNc para los genes que inducen la levadura en ciernes filamentoso de
S. cerevisiae
a fin de encontrar genes candidatos que podrían coordinar la señalización celular y la morfología. Se identificó un gen "nuevo" y asignado como reforzador humano de filamentation 1 (HEF1). Otro equipo de investigación encontró que la proteína relacionada con el p130Cas una novela de 105 kD se tirosina fosforilada por la participación de las integrinas beta 1 en los linfocitos T y la designó como sustrato asociado-Crk tipo de linfocitos (Cas-L) [5]. Por lo tanto, NEDD9 tenía otros dos nombres independientes de la historia. proteínas NEDD9 regulan complejos de proteínas que controlan el ciclo celular y la apoptosis, la migración, la quimiotaxis, y la diferenciación [6]. FAK y SRC fueron implicados como objetivos importantes de NEDD9 y fueron fosforilados y activan mutuamente, que fue considerado como el "proceso de regulación central" de NEDD9 [7].
Expresión
En los últimos años, alteración de andamios proteína NEDD9 ha surgido como contribuir a la metástasis del cáncer en múltiples tipos de cáncer, como el cáncer de mama [6,8], glioblastoma [9], melanoma [10], de pulmón [11,12] y carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) [13]. Sin embargo, ningún estudio hasta la fecha se realiza para determinar si NEDD9 está asociado con carcinoma de cuello uterino humano. Los informes recientes han sugerido que NEDD9 se sobreexpresa en algunas carcinoma humano, tales como melanoma [10] y HNSCC [13]. Aquí detectamos expresión NEDD9 en tejidos de cáncer de cuello uterino humanos y exploramos el papel de NEDD9 en la progresión del cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestra de tejido recogida
La muestras de tejidos del cuello uterino y de los ganglios linfáticos y los parámetros clínicos de 67 pacientes de cáncer cervicouterino (38 carcinomas escamosos de cuello uterino y 29 adenocarcinomas), que se sometieron a cirugía durante 2005 para 2009, en el hospital de Mujeres, la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, se recogieron y se muestran los datos detallados en la Tabla S1. Además, 22 muestras de tejidos normales del cuello uterino como controles se derivaron de los pacientes que se sometieron a histerectomía a causa de las enfermedades ginecológicas benignas. Ningún paciente recibió quimioterapia o radioterapia antes se obtuvieron los tejidos. El estudio fue revisado y aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Mujer de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes o de sus representantes legales.
La inmunohistoquímica
Todos los tejidos se tiñeron inmunohistoquímica en secciones de 4 micras para evaluar la expresión NEDD9 en estas muestras. Anticuerpo monoclonal de ratón 2G9 contra NEDD9 (Abcam, 1: 1000) se empleó como el anticuerpo primario. EnVision
kit de detección de TM se utiliza en los procedimientos y 3,3'-diaminobencidina (DAB) se aplicó como cromógeno. Cada sección se anotó ciegamente para la determinación semicuantitativa de la intensidad de la tinción inmunohistoquímica por un patólogo. intensidad de la tinción se puntuó como sigue: 0, ninguna tinción; 1, positividad débil; 2, positividad moderada; y 3, fuerte positividad. Las puntuaciones de inmunohistoquímica compuestos se obtuvieron mediante la suma de las puntuaciones de intensidad multiplicada por la proporción de células de esta puntuación de intensidad. Por ejemplo, si la muestra mostraron tinción moderada (puntuación 2) en 20% de las células y tinción fuerte (anotó 3) en 30% de las células, las puntuaciones de inmunohistoquímica compuestos serían (2 × 0,2) + (3 x 0,3) = 1,3. Una puntuación media se utilizó para el análisis estadístico.
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer cervical humano SiHa (HPV16-positivas), CaSki (HPV16-positivas), HeLa (HPV18-positivas), C33A línea de queratinocitos no tumoral (HPV-negativa), humanos HaCaT y líneas de células de riñón embrionario humano HEK293 y HEK293T se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco. (DMEM; GIBCO, EE.UU.) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C
inmunofluorescencia
Cuarenta y ocho horas después de la siembra en cubreobjetos de vidrio, las células se fijaron con 3,7% de paraformaldehído y se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón 2G9 (1: 200) contra NEDD9 como anticuerpo primario. Después de aclarado tres veces con PBS, las células se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen) diluido 1: 1.500 en 2% de BSA como anticuerpo secundario. Los núcleos fueron marcados con Hoechest33342 (Sigma).
siRNAs Preparación y transfección
Sobre la base de una herramienta basada en la web libre de la literatura [14] y (http://www.dharmacon.com) , tres pares de siRNAs fueron diseñados contra NEDD9 ARNm. siRNAs contra HPV16 E6 /E7 y E-cadherina fueron diseñados como se describe anteriormente [15]. Todos los dúplex de siRNA (Tabla S2) se sintetizaron químicamente por GeneChem Co., Ltd. (Shanghai, China). Las transfecciones se realizaron en placas de 6 pocillos y utilizando Lipofectamine ™ 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
Lentiviral Producción
La secuencia de codificación completa de NEDD9 se amplificó por PCR a partir de los plásmidos que contienen clon de ADNc de NEDD9 (OriGene, EE.UU.) y se inserta en un vector de transferencia de genes lentivirus pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, EE.UU.). La secuencia de codificación de los ARN de horquilla corta (shRNAs) dirigidas a la proteína de fluorescencia verde (GFP) o NEDD9 (Tabla S2) se clonaron inmediatamente después de un promotor U6 pol III en un vector de transferencia de genes de lentivirus (Invitrogen, EE.UU.). Los vectores se empaquetaron posteriormente en partículas de lentivirus en células HEK293T. Los lentivirus se utilizaron para infectar células de cáncer cervical como se ha descrito anteriormente [16]. lentivirus producidos se titularon y se almacenan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PCR cuantitativa
Total de ARN se prepararon a partir de las células tratadas utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo usando un sistema de PCR 7300 en tiempo real (Applied Biosystems) y realizada por colorante SYBR Green de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de oligonucleótidos fueron sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, China). que se enumeran en la Tabla S2. la cuantificación relativa de la expresión del ARNm se calculó con la 2
-ΔΔCT método que se describió anteriormente [17].
transferencias de Western e inmunoprecipitación
Las transferencias Western se realizaron como se describe anteriormente [18] . Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis para la extracción de proteínas. Cincuenta microgramos de proteína total de cada muestra se sometió a una electroforesis en gel de SDS-PAGE 10%. Para la inmunoprecipitación, las células se rompieron en 250 l de tampón de inmunoprecipitación. Cantidades iguales de proteína (300 g) se sometieron a inmunoprecipitación seguida por análisis de transferencia Western. nivel de gris acumulado de bandas de Western blot se obtuvo utilizando el software ImageJ (NIH, EE.UU.) para el análisis cuantitativo cuantificación relativa. Los anticuerpos primarios fueron específicos para los siguientes proteínas: NEDD9 (ab18056) de Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), la CRSP (2101), fosfo-tirosina (9411), vimentina (3932) y E-cadherina (3195) Señalización forma de la célula, HPV16 E6 (MAB874), E7 (MAB8680) de Millipore, GAPDH (SC-59540) y β-actina (sc-1616-R) de Santa Cruz. Las bandas se visualizaron utilizando un kit ECL (Pierce, EE.UU.).
arañazos de cicatrización de heridas ensayo
ensayo de cicatrización de heridas de Scratch se llevó a cabo para determinar la migración celular. Las células fueron infectadas con lentivirus, y 72 h más tarde cultivadas a plena confluencia. A continuación, se prepararon las heridas (alrededor de 1 mm de ancho) con una punta de micropipeta rayado a través de los pozos. La velocidad de migración de las células se calculó mediante la medición de la distancia migrada en 24 h. Las fotografías fueron tomadas con el microscopio de contraste de fases (Olympus, Japón) en diferentes puntos de tiempo después de cero.
Transwell ensayos
Los ensayos in vitro de invasión de células se llevaron a cabo en placas Transwell Matrigel basados esencialmente como descrito previamente por Pelletier et al [19], con ligeras modificaciones. 5 × 10
4 Las células se colocaron en las cámaras recubiertas con Matrigel superiores de las placas Transwell de 24 pocillos (Corning Costar, Cambridge, MA) con un tamaño de poro de 8 micras. Los compartimentos inferiores se rellenaron con medio suplementado con suero bovino fetal 20%. Después de 24 h de incubación, las células no migradas en la superficie superior de las membranas se rasparon suavemente con hisopos de algodón y las células que migraron que habían invadido a la superficie inferior se tiñeron con violeta cristal y se contaron. ensayos de migración celular se llevaron a cabo de una manera similar pero sin Matrigel.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los datos fueron analizados con el paquete estadístico SPSS 12.0. Una forma ANOVA y la prueba t de Student se utilizaron para comparar los datos.
p
valor inferior a 0,05 se consideró significativa estadística.
Resultados
NEDD9 se sobreexpresa en cáncer de los tejidos y líneas celulares cervical humano
Para encontrar una pista de la relación entre la proteína NEDD9 y carcinoma cervical humano, se empleó el análisis inmunohistoquímico para determinar la expresión de la proteína NEDD9 en tejidos de carcinoma cervical humano y analizado la asociación de la expresión NEDD9 con la progresión de carcinoma cervical humano. Se encontró que la proteína NEDD9 se sobreexpresa en la mayoría de tejidos de carcinoma de cuello uterino, pero mal expresa en los tejidos de epitelio cervical normal (figura 1A). Además, la proteína NEDD9 se sobreexpresa en los ganglios linfáticos metastáticos (Figura 1B). Por otra parte, NEDD9 sobreexpresión se correlaciona con el grado histológico, la metástasis, y la etapa FIGO (Figura 1C). Además, como se muestra en la Figura 1D, NEDD9 mRNA se sobreexpresa en cuatro líneas celulares de cáncer de cuello uterino comunes (SiHa, HeLa, C33A y CaSki) independientemente de HPV-positivos o negativos al pero relativamente mal expresados en la línea de queratinocitos humanos HaCaT y de células de riñón embrionario humano línea HEK293. El análisis de transferencia Western mostró que NEDD9 fue altamente expresado en las líneas celulares de cáncer de cuello uterino, de manera similar a los de la qPCR. El análisis de inmunofluorescencia mostró que la proteína de NEDD9 se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de cuello uterino y se distribuye principalmente en el citoplasma (Figura 1E).
(A) La tinción inmunohistoquímica de NEDD9 en el carcinoma escamoso del cuello uterino (SCC), adenocarcinoma de el cuello del útero (AC) y el tejido normal del cuello uterino. Aumento original, × 400. (B) tinción inmunohistoquímica de NEDD9 en ganglios linfáticos ilíacos externos izquierda metastásicos de SCC y derecho obturador ganglios linfáticos metastásicos de AC. Aumento original, × 400. (C) El análisis estadístico mostró sobreexpresión NEDD9 se correlacionó con el estadio de la FIGO, la clasificación histológica y la metástasis. (D) Expresión de NEDD9 mRNA y proteína en varias líneas de células se evaluó por PCR cuantitativa y análisis de transferencia Western. (E) NEDD9 (rojo) de localización y de expresión se evaluaron por análisis de inmunofluorescencia en el carcinoma cervical SiHa, CaSki, HeLa, células C33A y queratinocitos HaCaT humanos. Las células fueron teñidas con contra-Hoechest33342 (azul) y se visualizaron a 60 × magnificación.
La expresión alterada de influencias NEDD9 la migración y la invasión de células de cáncer cervical
Para identificar la función de NEDD9 las células de cáncer de cuello uterino, que derribaron NEDD9 en las células SiHa y HeLa utilizando un siRNA (S: 5 'GAG ACA CCA UCU CAC AAG T [dT] [dT] 3', AS: 5 'ACU UGG UAG agosto GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 '), que se selecciona de entre tres candidatos por qPCR. Como se muestra en la Figura 2A, 2B y 2C, el siRNA mostró fuertes efectos de interferencia contra NEDD9 mRNA y proteína en células SiHa y HeLa de cáncer cervical. Además, tratamos de decidir si la migración y la invasión de células de cáncer cervical serían atenuadas por la reducción de la expresión a través de NEDD9 shRNA lentivirus realizado. Los resultados de los ensayos mostraron que transwell NEDD9 shRNA reducir la capacidad invasiva y migratoria de cáncer cervical SiHa y HeLa (Figura 2D y 2E). Por otra parte, los resultados de ensayos de curación de heridas mostraron cierre de la herida significativamente lento en el NEDD9 shRNA tratados vs células SiHa y HeLa de control a las 24 h después de cero (Figura 2F, 2G y 2H). Se determinó aún más los efectos del aumento de NEDD9 sobre la migración celular y la invasión. Se emplearon vectores de lentivirus para sobreexpresar NEDD9 en HaCaT células (Figura 3A). TGF (5 ng /ml) también aumentó la expresión de NEDD9 en células HaCaT (Figura 3B). Los resultados del ensayo mostraron que la sobreexpresión Transwell exógena de NEDD9 dio lugar a un aumento de la invasión y migración celular en las células HaCaT sin estimulación TGF (Figura 3C y 3D).
NEDD9 fue derribado por los siRNA o shRNA en el carcinoma de cuello de útero y SiHa células HeLa. (A) Los efectos de interferencia se confirmaron mediante PCR cuantitativa en células SiHa y HeLa. Expresión de NEDD9 se examinó por transferencia de Western en SiHa (B) y las células HeLa (C). Las células se infectaron con vectores lentivirales que codifican shRNA contra NEDD9. Los resultados de ensayo Transwell mostraron que la entrega lentiviral de shRNA orientación NEDD9 resultó en la invasión celular reducida (D) y la migración (E) en las células SiHa y HeLa. Los resultados de ensayo de cicatrización de heridas de Scratch verificado además que el silenciamiento NEDD9 resultó en la migración celular reducida (F, G y H). Barra de escala, 100 micras. *
P Hotel & lt; 0.05.
Se emplearon vectores de lentivirus que sobreexpresan NEDD9 en los queratinocitos humanos HaCaT (A). TGF (5 ng /ml) también aumentó la expresión de NEDD9 en queratinocitos HaCaT humanos (B). Los resultados de ensayo Transwell mostraron que la entrega lentiviral de NEDD9 consecuencia un aumento de la invasión de células (C) y la migración (D) en las células HaCaT sin estimulación TGF. Barra de escala, 100 micras.
La regulación mutua entre NEDD9 y FAK o SRC
Además, la expresión de FAK y SRC, dos proteínas asociadas a NEDD9 [4], en SiHa infectadas y las células HeLa se determinaron por Western blot. Los resultados mostraron que la expresión de fosfo-FAK (Tyr397) y fosfato Src (Tyr416), pero no total de FAK y proteínas totales SRC, se redujo significativamente después de la caída NEDD9 (Figura 4A y 4B). En experimentos de sobreexpresión, tirosina fosforilada FAK y SRC, en lugar de FAK total y SRC total, se upregulated significativamente, mientras que NEDD9 se sobreexpresa de forma exógena en células HaCaT (Figura 4C y 4D). Además, se empleó la inmunoprecipitación para determinar si FAK inhibidor PF-228 (Sigma, 10 mM) o un inhibidor de SRC PP2 (Sigma, 10 mM) regulan la expresión de NEDD9. Los resultados mostraron que la expresión de NEDD9 tirosina fosforilada, en lugar de NEDD9 total se redujo significativamente, mientras que FAK o SRC fue suprimida por PF-228 o PP2 en SiHa y TGF-estimulación de las células HaCaT (Figura 4E y 4F). Además, PF-228 (10 M) o PP2 (10 mM) reducen la fosforilación de FAK o SRC en TGF-estimulación de las células HaCaT (Figura S1). PF-228 o PP2 suprimen la invasión y migración de SiHa y TGF-estimulación de las células HaCaT (Figura S2). Del mismo modo, los resultados de ensayo Transwell mostraron que ambos inhibidores suprimen la invasión celular y la migración incrementado por la sobreexpresión exógena de NEDD9 en células HaCaT (Figura 4G).
(A y B) Expresión de oncoproteínas asociados-NEDD9, FAK y SRC, se examinó por transferencia de Western. Tirosina fosforilada-FAK y SRC, en lugar de FAK y SRC, fueron significativamente las reguladas mientras NEDD9 fue silenciado en las células SiHa y HeLa. (C y D) Por otra parte, la tirosina fosforilada FAK y SRC se upregulated significativamente mientras NEDD9 se sobreexpresa de forma exógena en células HaCaT. (E y F) Los resultados de la inmunoprecipitación mostraron que la tirosina fosforilada NEDD9, en lugar de NEDD9, fueron significativamente las reguladas mientras FAK o SRC fue suprimida por el inhibidor de FAK PF-228 o el inhibidor de SRC PP2 en SiHa y TGF-estimulación de las células HaCaT. (G) Los resultados del ensayo mostraron que Transwell aumento de la invasión celular y la migración por la sobreexpresión exógena de NEDD9 fueron suprimidos por la FAK inhibidor PF-228 o SRC PP2 inhibidor en las células HaCaT. Barra de escala, 100 micras.
NEDD9 regula vimentina y E-cadherina en células de cáncer cervical
La vimentina y E-cadherina eran proteínas importantes en relación a la celda invasión y migración. Western blot mostró que vimentina se había reducido regulado y E-cadherina se reguló mientras NEDD9 fue suprimida por shRNA en las células SiHa y HeLa (Figura 5A). Por otra parte, vimentina se reguló y E-cadherina se redujo reguladas mientras NEDD9 se sobreexpresa en células HaCaT (Figura 5B). Los resultados sugieren que vimentina y E-cadherina están involucrados en la función reguladora de NEDD9 sobre la migración celular y la invasión en las células de cáncer cervical. Los resultados de ensayo Transwell mostraron que la disminución de la invasión de células y la migración inducida por shRNA específico para NEDD9 se aumentaron por transfección de siRNA contra E-cadherina (Figura 5C y 5D). Los resultados confirmaron además que la E-cadherina era una proteína reguladora de supresión en NEDD9 promoción de la migración celular y la invasión de células de cáncer cervical. Por otra parte, la E-cadherina las reguladas a través de la sobreexpresión de NEDD9 se reguló de manera significativa en virtud de PF-228 o PP2 en las células HaCaT, por su parte, la expresión de vimentina-regulada hasta fue significativamente las reguladas (Figura 5E). En el experimento inverso, ni tirosina fosforilada ni total de NEDD9 fue cambiado significativamente, mientras que la E-cadherina fue suprimida por siRNA en células HaCaT (Figura 5F).
La expresión de marcadores de EMT, vimentina y E-cadherina, se examinó mediante transferencia Western. (A) La vimentina se había reducido regulado y E-cadherina se reguló mientras NEDD9 fue silenciado en las células SiHa y HeLa. (B) La vimentina se reguló y E-cadherina se redujo reguladas mientras NEDD9 se sobreexpresa en las células HaCaT. Los resultados de ensayo Transwell mostraron que la disminución de la invasión de células (C) y la migración (D) por shRNA de NEDD9 se incrementaron por siRNA contra E-cadherina en células SiHa y HeLa. Barra de escala, 100 micras. (E) E-cadherina se reguló y vimentina se había reducido regulado en virtud de la FAK inhibidor PF-228 o el inhibidor de SRC PP2 en las células HaCaT con NEDD9 exógeno. (F) Los resultados de la inmunoprecipitación mostraron que la tirosina fosforilada y total de NEDD9 NEDD9 no estaban regulados de manera significativa, mientras que la E-cadherina fue suprimida por siRNA en células HaCaT.
E6 /E7 oncoproteína no regula NEDD9 de cuello de útero células de cáncer de
se ha sabido que el VPH E6 y E7 genes son oncogenes clave para iniciar el desarrollo del cáncer cervical, pero el efecto de E6 y E7 en los genes del huésped asociados a la progresión del cáncer sigue siendo incierto. De este modo, se observó posibles vínculos entre E6 /E7 y NEDD9 en células de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, la privación de HPV16 E6 /E7 de siRNA no cambió la expresión de NEDD9 en las células SiHa y CaSki HPV16-positivas (Figura 6A y 6B), viceversa, la baja regulación de NEDD9 no afectó la expresión de E6 /E7 (Figura 6C y 6D). Nuestros resultados sugieren que NEDD9 es un evento molecular tarde que participa principalmente en la progresión o metástasis de cáncer de cuello uterino.
(A y B) El resultado de qPCR y transferencias de Western mostraron que la privación de E6 /E7 de siRNA didn 't cambiar la expresión de NEDD9 en las células SiHa y CaSki VPH positivas. (C y D) Interferencia de NEDD9 no afectó la expresión de E6 /E7 en las células SiHa y CaSki.
Discusión
A pesar de que inicialmente NEDD9 se identificó por primera vez como uno de los nuevos genes expresados por las células precursoras neurales pero las reguladas siguiente desarrollo fetal [3], varios estudios actuales encontraron que NEDD9 sobreexpresión, como anormalidades de señalización oncogénicas, estaba asociado con la metástasis del cáncer en el cáncer de mama [6,20,21], glioblastoma [9] , melanoma [10] y de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) [13], así como vinculado a la resistencia a fármacos en tumores del estroma gastrointestinal (GIST) [22]. Estudios recientes mostraron que NEDD9 regula vía TGF en cáncer de mama [23,24] y el cáncer hepatocelular [25] y la señalización de Wnt en el cáncer colorrectal [26]. Por otra parte, TGF es un potente inhibidor de ciclo celular en células HaCaT de queratinocitos humanos, sin embargo, también se ha demostrado que la promoción de la invasión y la migración en las células HaCaT [27,28]. De este modo se emplearon células HaCaT como un modelo para estudiar la migración de un fenotipo inducido /invasión.
Se ha demostrado mediante análisis inmunohistoquímico que NEDD9 se expresa en el epitelio bronquiolar humano [29], los linfocitos humanos en sinovial artritis reumatoide [30 ], rata de la corteza cerebral y el hipocampo neuronas [31], nevos humano y melanoma [10], encefálica embrionaria murina y el tubo tronco neuronal [32], la aparición tardía de la enfermedad de Alzheimer humana [33], ratón y pollo cresta neural embrionaria [34] , carcinoma de cabeza y cuello humano de células escamosas (HNSCC) [13]. Además, el análisis inmunohistoquímico también ha revelado que NEDD9 sobreexpresión se correlaciona con HNSCC y melanoma progresión [10,13]. El cáncer cervical posee una característica clínica que la metástasis a los ganglios linfáticos generalmente se produce en una etapa temprana y presenta un mal pronóstico. Por lo tanto, hemos detectado y comparó la expresión NEDD9 mediante análisis inmunohistoquímico en 67 cáncer de cuello uterino y 22 tejidos normales de cuello uterino, así como líneas celulares de cáncer de cuello uterino y de la línea de queratinocitos no tumoral. Nuestros resultados revelaron que la proteína NEDD9 se sobreexpresa en la mayoría de tejidos de carcinoma de cuello uterino y las células en comparación con los tejidos epitelio normal y queratinocitos no tumorales. Además, se encontró que NEDD9 sobreexpresión se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos, grado histológico, y la FIGO etapa de pacientes con carcinoma de cuello uterino. Nuestros resultados fueron similares a los reportados por Lucas JT, Jr. et al [13] en HNSCC y por Kim M et al [10] en el melanoma y sugieren que la sobreexpresión NEDD9 puede implicar en la progresión y la metástasis de cáncer de cuello uterino.
proteína NEDD9 conserva un dominio NH2-terminal Src homología 3 (SH3), que se une a la proteína que contiene motivos polyproline como FAK. FAK es una de las proteínas asociadas más importantes de NEDD9 especialmente en la adhesión focal [4]. Natarajan M et al [9] pensó que NEDD9 actuó como efectores específicos de FAK que promovieron la migración celular y la invasión de glioblastoma. Nos encontramos en el estudio que NEDD9 y FAK distribuidos de manera similar en el citoplasma de las células de carcinoma cervical SiHa HPV16-positivas (datos no mostrados), lo que sugiere que hay quizá algunos vínculos especiales entre NEDD9 y FAK. la interferencia de ARN (RNAi) es una herramienta poderosa para silenciar genes específicos. Varios estudios [9,10,14,25,34-38] han demostrado que siRNAs específicos dirigidos a ARNm del gen NEDD9 son capaces de expresión de NEDD9 regular a la baja. Aquí, hemos empleado RNAi como una herramienta para investigar el papel de NEDD9 en la progresión del cáncer cervical. Por otra parte, se utilizó un vector de transferencia génica lentivirus para sobreexpresar exógenamente NEDD9 en el estudio. En nuestros experimentos, siRNAs dirigidos gen NEDD9 inhibe eficazmente tanto ARNm y la expresión de proteínas de NEDD9. FAK y SRC fueron implicados como objetivos importantes de NEDD9 y fueron fosforilados y activan mutuamente, lo que fue considerado como el "proceso de regulación central" de NEDD9 [7]. En realidad, funciones de las proteínas FAK y SRC dependen de su fosforilación de tirosina en algunos residuos de aminoácidos específicos en las proteínas (por ejemplo, Tyr416 de SRC y Tyr397 de FAK). De este modo, se detectó la fosforilación de la tirosina de la proteína FAK y SRC siguiente regulación a la baja o la regulación positiva de NEDD9 y encontramos que el silenciamiento de NEDD9 resultó en la desfosforilación de la tirosina, en lugar de disminuir la expresión de ambos FAK y SRC. Curiosamente, la sobreexpresión de NEDD9 llevó a la fosforilación de tirosina de la FAK y SRC. Por otra parte, también encontramos la tirosina-fosforilación en lugar de expresión de NEDD9 se inhibió mientras que la tirosina-fosforilación de FAK o SRC fue suprimido por los inhibidores selectivos tales como PF-228 y PP2. Muchos grupos han encontrado NEDD9 es una molécula de aguas abajo de la FAK y SRC que promueven la migración y la invasión relacionados con la señalización [39,40]. Sin embargo, varios estudios han demostrado recientemente que NEDD9 probablemente actuó como señal aguas arriba de FAK y SRC [6,41]. Persistentemente reducen FAK [6] y SRC [41] La activación se muestran en las células derivadas de NEDD9 knockout cepa. Nuestros hallazgos sugieren que puede haber un bucle de retroalimentación positiva de la fosforilación de la tirosina entre NEDD9 y FAK o SRC. Por lo tanto, la fosforilación de tirosina era continuo reforzado a través de la así llamada "proceso de regulación núcleo" y en última instancia formar señales de invasión y metástasis
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Desde su análisis funcional inicial en 1996 [4,5], NEDD9 se asoció con la migración , invasión y metástasis en diferentes estudios. Law et al. descubrió por primera vez NEDD9 podría regular la polarización de las células [4], que era un paso indispensable en el proceso de la migración celular. La migración de células es la base de la invasión de células de cáncer y la metástasis. Hasta ahora, NEDD9 se encontró a participar en la metástasis del cáncer en glioblastoma [9], melanoma [10], y el cáncer de mama. Actualmente, se cree que la proteína NEDD9 se asocia con la migración, invasión y metástasis de las células cancerosas [7,42]. Nuestros resultados mostraron que la proteína NEDD9 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de cuello uterino con metástasis. Por otra parte, la inhibición de la expresión NEDD9 por RNAi atenúa la migración y la invasión de células de cáncer cervical. Las células que sufren epitelial-mesenquimal transición (EMT) pierden su morfología epitelial y adquieren un fenotipo móviles, que desempeña un papel clave en la invasión y la metástasis del cáncer [43]. Vimentina y E-cadherina eran importantes biomarcadores de transición epitelio-mesenquimal (EMT). Western blot mostró que el shRNA contra NEDD9 reduce la expresión de vimentina y el aumento de la expresión de E-cadherina y la sobreexpresión NEDD9 upregulated vimentina y hacia abajo-regulado E-cadherina, que es similar a los reportados por Tikhmyanova N [21]. Por otra parte, abajo-regulada a través de E-cadherina sobreexpresión de NEDD9 se reguló de manera significativa en virtud de inhibidor de FAK o SRC. Ni NEDD9 tirosina fosforilada ni totales se regula de manera significativa, mientras que la E-cadherina fue suprimida. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión NEDD9 promueve la migración y la invasión de células de cáncer cervical probablemente a través de, al menos parcialmente, vía la transición epitelio-mesenquimal (EMT). E-cadherina es una proteína de aguas abajo de NEDD9 y puede ser un modulador clave de la migración de células de cáncer mediada por NEDD9 y la invasión.
Es bien sabido que el virus del papiloma humano (VPH) es el factor etiológico más importante en cervical cáncer [44]. La infección por VPH de alto riesgo (VPH-AR), en particular los tipos de VPH 16 y 18, está causalmente relacionada con el desarrollo de cáncer de cuello uterino. Numerosos informes han demostrado que el VPH de alto riesgo (HR-HPV) cepas particularmente los tipos de VPH 16 y 18 son oncogénicos, que depende de los oncogenes virales E6 y E7 que se dirigen a p53 y pRb proteínas supresoras de tumores [45]. Dada la importancia de E6 /E7, la hipótesis de que había algunos vínculos entre E6 /E7 y NEDD9 en el inicio del estudio. Sin embargo, no establecer una conexión entre E6 /E7 y NEDD9.