Extracto
Antecedentes
Se necesitan sistemas de entrega mejor para las vacunas usadas rutinariamente, a mejorar la absorción de la vacuna. Muchas vacunas contienen adyuvantes de alumbre o alumbre a base. Aquí se investiga un nuevo parche de micro-proyección matriz piel seca con recubrimiento densamente poblado-(Nanopatch ™) como un sistema de entrega alternativo para inyección intramuscular para la entrega de un alumbre como adyuvante virus del papiloma humano (VPH) (Gardasil) que se utiliza comúnmente como una vacuna profiláctica contra el cáncer de cuello uterino.
Metodología /Principales conclusiones
matrices de micro-proyección-seca recubierta con material de la vacuna (Gardasil) entregado a C57BL /6 piel de oreja de ratón vacuna liberado dentro de 5 minutos. Para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna, las dosis de componente correspondiente a HPV-16 de la vacuna entre 0,43 ± 0,084 ng y 300 ± 120 ng (media ± SD) se administraron a los ratones en el día 0 y día 14. Una dosis de 55 ± 6,0 ng entregado intracutánea por disposición de micro-proyección fue suficiente para producir una respuesta de anticuerpos séricos neutralizantes del virus máxima en el día 28 después de la vacunación. Títulos de anticuerpos neutralizantes se sostuviera a 16 semanas después de la vacunación, y, por dosis comparables de la vacuna, se observaron títulos de algo más altas con la entrega de parches intracutánea que con el parto por vía intramuscular con la aguja y la jeringa en este punto temporal.
Conclusiones /Importancia
el uso de matrices de micro-proyección secos (Nanopatch ™) tiene el potencial de superar la necesidad de una cadena de frío de las vacunas para las vacunas comunes actualmente entregados por la aguja y una jeringa, y para reducir el riesgo de lesiones por pinchazo de aguja y la evitación de la vacuna debido al miedo a la aguja especialmente entre los niños
Visto:. Corbett HJ, Fernando PME, Chen X, Frazer IH, Kendall MAF (2010) la vacunación contra el cáncer de cuello de piel de Associated Virus del papiloma humano con un nuevo micro-array de proyección en un modelo de ratón. PLoS ONE 5 (10): e13460. doi: 10.1371 /journal.pone.0013460
Editor: Sotirios Koutsopoulos, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de julio de 2010; Aceptado: August 16, 2010; Publicado: 18 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Corbett et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Cancer Council de Queensland, la Universidad de Queensland, National Health and Medical Research Council (Australia) Subvenciones ID#569726,#456150 ID, Australia y el Consejo de investigación de Grant ID#DP077464 y el Smart Esquema Estado de Queensland financiado esta investigación. El profesor Mark A. F. Kendall fue el destinatario de un futuro Fellowship Consejo de Investigación Australiano. El profesor Ian H. Frazer era el recipiente de Beca de un Premier Gobierno de Queensland. La Universidad de Queensland y el profesor Ian Frazer H. derivan ingresos por regalías de la venta de las vacunas de VLP de HPV. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de las vacunas son actualmente entregado por aguja y una jeringa. Sin embargo, como un dispositivo de administración de la vacuna, la aguja y la jeringa tiene muchas deficiencias importantes. Estos incluyen la posible transmisión de enfermedades transmitidas por la sangre a través de las lesiones por pinchazo de aguja [1] y la reutilización de agujas - aproximadamente el 30% de las inyecciones a los efectos de la vacunación en los países en desarrollo son inseguros [2], y que las lesiones por pinchazos de agujas causan más de 500.000 muertes por año [3]. Needle-fobia y el dolor asociado con una inyección intramuscular son también inconvenientes - se estima que fobia a las agujas está presente en al menos 10% [4] de la población, o más alto [5]. El músculo es también un sitio muy ineficiente para la vacunación, ya que no tiene una alta densidad de células presentadoras de antígeno. Por el contrario, la piel es un sitio alternativo atractivo para la vacunación debido a su densa red de células presentadoras de antígeno potentes (APC), incluyendo las células de Langerhans (CL) [6], y muchos subconjuntos de células dendríticas dérmicas (DDC) [7] . La proximidad de estas células a la superficie de la piel significa que podría ser posible dirigirse a ellos en formas que pueden reducir el dolor y el potencial de transmisión de agentes patógenos transmitidos por la sangre. Mientras que la entrega cutánea tiene un gran potencial, el método más cercano se utiliza actualmente en la clínica - inyección intradérmica - es técnicamente difícil, que requiere el desarrollo de métodos de segmentación avanzadas tal como fue revisado en [8], [9]
En este estudio a. novedoso parche para la piel llamada la Nanopatch ™ se utiliza para apuntar estas células del sistema inmune de la piel. El Nanopatch ™ es una matriz de micro-proyección con forma única densa embalaje proyección (& gt; 20.000 /cm
2) y las proyecciones cortas (110 micras de longitud). Esta densidad de la aguja fue diseñado de tal manera que suministra la vacuna ha sido co-localizada con 50% de la piel células inmunes - tanto en la epidermis y la dermis -. Después de la aplicación cutánea sin depender de difusión (véase la Figura 1) [10]
A matriz bidimensional de salientes localiza vacunas revestidos en seco a las capas de la piel rica en células inmunes. Una vez que los hidratos de vacunas, que se difunde a través de la epidermis y la dermis viables. Ovoalbúmina
Estudios anteriores con Nanopatch ™ inmunización han utilizado y la vacuna de la gripe fraccionados como antígenos sin la adición de un adyuvante. Crichton et. al [11] demostraron altos niveles de anticuerpos después de una inmunización con menos de 2 mg a través Nanopatch ™ usando el antígeno ovoalbúmina modelo en ratones C57BL /6, sin el uso de un impulso de 65 micras proyecciones Nanopatch largos. Fernando et. Alabama. [10] demostraron inducción de niveles protectores de anticuerpos funcionales contra la gripe en ratones con 110 micras proyecciones largas Nanopatch ™ (mismo que el utilizado en este estudio) usando un virus fraccionado, vacuna trivalente influenza sin adyuvante (Fluvax 2008®); con un factor de 100 en el ahorro de dosis entregado, en comparación con la aguja y la jeringa. En estos estudios previos, las vacunas fueron entregados sin adyuvante.
En el estudio actual extendemos para explorar la utilidad de la Nanopatch ™ en la entrega de un adyuvante de alumbre. Esto es importante, ya que muchas vacunas se adyuvantes -. Con alumbre en el más ampliamente utilizado [12]
De hecho, hasta la reciente licencia de AS04, el alumbre es el único adyuvante para ser autorizada por la FDA [13] . AS04 es a base de alumbre, con la adición de un lípido basado Toll-like receptor 4 agonista de 3-O-desacil-4 'monofosforil lípido A (MPL) [14]. "Alum" es químicamente ya sea oxihidróxido de aluminio, o hidroxifosfato de aluminio. Para las nuevas tecnologías para tomar ventaja de las vacunas actualmente autorizadas, idealmente se debe trabajar con las vacunas con adyuvante de alumbre-. Hasta el momento, el trabajo de formulación sólida se ha realizado con adyuvante de alumbre en polvo para la inmunización epidérmico (PAI) de la hepatitis B [15], [16], [17], y toxoides diftérico y tetánico [17]. Amplia coagulación gel de alumbre durante el secado se sospecha que inhiben la liberación de antígeno de tal manera que no es recuperable después de la rehidratación [16], y se ha informado de pérdidas de eficacia después de la liofilización o congelación [18], [19], [20]. Para minimizar estas pérdidas, sin reducir significativamente la cantidad de alumbre en el total de sólidos (& lt; 1% [18])., La congelación rápida se utiliza para prevenir la concentración por congelación de solutos en combinación con excipientes que forman el vidrio
Sin embargo, en nuestro revestimiento micro-proyección, un paso de congelación no sólo es más exigente técnicamente, pero tiene el potencial de reducir la integridad mecánica de la capa revestida. El recubrimiento debe ser mecánicamente lo bastante fuerte para permanecer unido en la penetración de la aguja, y diferentes propiedades de expansión térmica entre las proyecciones y la vacuna puede causar agrietamiento o deslaminación de las capas de recubrimiento mientras el dispositivo se lleva a temperatura ambiente.
El secado al aire de alumbre que contiene formulaciones se investigó en Maa et al [17], y se encontró de causar una coagulación incluso en presencia de trehalosa, y /o manitol y /o dextrano. Como protocolos de revestimiento actuales están más cerca de los protocolos de secado al aire se describe en [17] en lugar de la liofilización o secado por congelación, se espera que la vacunación con micro-proyecciones dry recubierto con una formulación que contiene alumbre daría lugar a una respuesta inmune pobre. En este trabajo se utiliza el polímero soluble en metil-celulosa para reducir la coagulación del gel sobre la deshidratación, y para ayudar a la disolución de rehidratación después de la aplicación.
Nuestro caso de prueba para la enfermedad de este estudio es el Virus del Papiloma Humano (VPH), porque - aparte de la importancia social de la vacuna - ensayos para medir la neutralización del virus están bien establecidas. estructura del antígeno es importante para generar una respuesta de anticuerpos neutralizantes de virus [19], haciendo que el sistema sensible a las perturbaciones en la estructura de antígeno que puede ser causada por la deshidratación alumbre durante el revestimiento seco.
infección por VPH es causal en prácticamente todos los casos de cáncer de cuello uterino - con ADN de VPH presente en el 99,7% de los carcinomas cervicales [20]. La vacunación fue posible gracias a modernos sistemas de expresión de proteínas recombinantes y el descubrimiento de que la expresión de la proteína principal de la cápside L1 sola era suficiente para producir virus de auto-montaje como partículas (VLP) [21], [22]. La VLP es una partícula viral vacía -. Por lo que no contiene el genoma viral que codifica para las proteínas oncogénicas que causan malignidad [23], [24], [25] en una infección natural
vacunas comercialmente disponibles Gardasil® [Merck] y Cervarix® [GlaxoSmithKline] demostraron una excelente acción profiláctica en los ensayos clínicos, la prevención de pre-cánceres y cánceres posteriores en casi el 100% en el protocolo de acuerdo a los análisis [26], [27], [28]. Ambas vacunas contienen una forma de adyuvante de alumbre. Las vacunas se dan como tres dosis en el transcurso de seis meses. Estas vacunas son profiláctico. El VPH es la infección más común de transmisión sexual [29], y la incidencia de la infección acumulada durante 2 años posteriores a la primera relación sexual es de aproximadamente 30%, con el uso del condón no muestra el efecto protector significativo [30]. La inmunización debe ocurrir antes de la primera relación sexual sea de protección total. Muchos países tienen programas nacionales de vacunación dirigidos a 11 y 12 años de edad, las niñas. Esto no ha estado exento de problemas. desmayos y dolores de cabeza masa se cree que es causada por una fobia a las agujas y la histeria de masas [31], y la vacunación sin agujas pueden mejorar la absorción de la vacuna y la aceptación.
La eficacia a largo plazo de las vacunas contra el VPH es importante. Mientras que la incidencia varía con la edad, la prevalencia incluso en mujeres entre las edades de 40 y 49 se estima en 25,2% [32], por lo que el potencial de infección continúa durante toda la vida. Duración de la protección es un factor significativo en la rentabilidad de las vacunas contra el VPH [33], y cualquier vacunas de segunda generación debe demostrar una protección duradera.
La inyección intra-cutánea del virus del papiloma oral canino (COPV) L1-glutatión pentámeros de fusión S-transferasa - similar a pentámeros VPH - ha demostrado tener un efecto protector en beagles a 400 ng /perro [33]. Suzich, J. A., et al. [34] demostraron que ensamblada COPV-VLP dio lugar a una protección completa a un nivel de dosis de 50 ng, y la protección parcial a 0.125 ng utilizando la vía intradérmica en beagles.
El HPV VLP se ensambla a partir de 72 pentámeros la proteína L1 [35], [36]. El desmontaje de las VLP se puede realizar de forma reversible
in-vitro
a pH alto, baja concentración de sal, y con la adición de agentes reductores (por ejemplo pH 8,2, NaCl 0,166 con DTT 2 mM). La diálisis contra un tampón de pH 6,8 con una concentración de sal de 0,5-1 M resultados en el montaje de las partículas [37]. Lenz, P., et al. [38] demuestra que HPV16L1 VLP solo, pero no sus constituyentes L1-pentámeros inducir la maduración de las células dendríticas
in-vitro
. Thönes et. Alabama. [39] estiman que la inmunización con L1-pentámeros también requiere de 20-40 veces más proteína administrada para obtener respuesta de anticuerpos similar. proteína L1 desnaturalizado no da una respuesta de anticuerpos neutralizantes del virus [19], y mientras que las formulaciones secas pueden significar la vida útil más larga a temperatura más alta, una formulación pobre puede causar degradación significativa de productos de proteína. Las formulaciones líquidas adecuadas para la estabilidad del VPH-VLP se han definido tanto para Gardasil [40] y Cervarix [41]. A medida que la formulación tiene un impacto en el montaje de las VLPs (y potencialmente la estructura de los propios capsómeros) y VLPs son más inmunogénicos que los capsómeros, la formulación es importante para la potencia de una vacuna recubierto seco. Ambas vacunas un componente de adyuvante de alumbre - Gardasil contiene hidróxidofosfato aluminio. A nuestro entender, los estudios que utilizan formulaciones sólidas no se han publicado para el VPH, o VPH adsorbido en alumbre.
El diseño Nanopatch ™ utilizado en este estudio utiliza una variedad de micro-proyecciones 110 micras altos 58 × 58, y 30 micras de diámetro de la base, con una separación de 70 micras entre los centros de proyección (véase la Figura 2). La vacuna se recubre seco sobre micro-proyecciones como se describe en [42], y Nanopatches ™ se aplica a los 2 ms
-1. Esta configuración proporciona material en las capas epidérmicas y dérmicas de la piel de oreja de ratón con una profundidad de penetración de 42 micras (SD = 9,9, N = 365), como se determina por formación de imágenes del trazador fluorescente en crio-seccionada orejas de ratón como se describe en [11] , pero con proyecciones similares a los utilizados en [10]
imágenes de electrones secundarios muestran la morfología de la superficie mientras que las imágenes de electrones retrodispersados muestran composición -. con elementos de masa atómica bajas que dan señal baja - es decir, área revestida aparece oscuro en comparación con el no recubierto Nanopatch ™. Micro-proyecciones se recubran en b) 800 ng, c) 80 ng, d) ye 8 ng) 0,8 ng de proteína de HPV-16 por parche. Mientras que algunos de puente se está produciendo en el grupo de 800 ng (panel b - flecha blanca)., Revestimiento se ve en la parte cónica de las proyecciones en todos los grupos de dosis
En este trabajo se demuestra recubrimiento seco y liberación de una vacuna contra el VPH-VLP alumbre como adyuvante con la Nanopatch ™. a continuación, demostramos una respuesta inmune posterior que es de larga duración, y neutraliza el virus a niveles comparables con la inyección intramuscular con la aguja y una jeringa.
Resultados
Proyección de la morfología seco recubierto Nanopatches ™ es adecuado para la aguja de penetración
parches revestidos se examinaron por microscopía electrónica de barrido (SEM), utilizando de electrones secundarios y retrodispersados modos (Figura 2) para investigar la distribución de la vacuna revestido a lo largo de las proyecciones. el modo de electrones secundarios mostró la forma de la superficie de las agujas revestidas, mientras que el modo de electrones retrodispersados se utilizó para confirmar cualitativamente el espesor del recubrimiento debido a las diferencias en la masa atómica de la superficie Nanopatch ™ oro y el revestimiento. Los intentos de secar la capa adyuvante de alumbre sin excipiente dio lugar a la vacuna recubrimiento mínimo sobre puntas de aguja, y la cristalización del adyuvante de alumbre (Figura S1). Por lo tanto hemos añadido metil-celulosa para estabilizar la vacuna y mejorar la morfología de revestimiento (Figura 2). Una proporción significativa del revestimiento se localiza en la parte cónica de las proyecciones. Esto se puede ver en las imágenes de electrones secundarios por la diferencia en la morfología antes y después de recubrimiento, y en las imágenes de electrones retrodispersados de la señal oscura en las puntas de proyección. En el grupo de 800 ng, se observó algo de puente entre las proyecciones en ciertas áreas de la Nanopatches ™ (indicada por la flecha en la Figura 2b), probablemente debido a la mayor concentración de vacunas que en otros grupos.
vacuna es liberado de la punta de proyección, y la mayor eficiencia en la entrega es consistente con las expectativas basadas en la morfología del recubrimiento y los datos de penetración
diluciones decimales de Gardasil® se prepararon y 14C marcado ovoalbúmina añaden como trazador a cada muestra, recubierta por Nanopatches ™ , y se aplica al lóbulo de la oreja ventral de ratones C57BL /6 (N = 5 por grupo de dosis) como se detalla en Materiales y Métodos. Un balance de masa usando el trazador radiomarcado se lleva a cabo entre la cantidad recubierta total y que que se entregó en la piel del oído, a la izquierda en la Nanopatch ™, o se deposita en la superficie de la piel. Eficiencia de la liberación era: 19% (SD = 7,5), 34% (SD = 4,7), 36% (SD = 10) y 27% (SD = 5,2) para 800 ng, 80 ng, 8 ng y 0,8 ng de HPV-16 revestido respectivamente (véase la Figura 3).
la liberación se determina por balance de masas, y varió entre cantidades recubiertas con un promedio de 19%, 34%, 36% y 27% para las formulaciones utilizadas de 800 ng, 80 ng, 8 ng y 0,8 ng de VPH-16 recubierto por Nanopatch ™.
porcentajes de entrega se utilizaron para calcular las dosis eficaces multiplicando la eficiencia de la entrega por la cantidad revestida. cantidades de entrega se estimaron en 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6), y 0,43 ng (SD = 0,084) del VPH-16L1.
Nanopatches ™ post-aplicación también se visualizaron con SEM para determinar si cualquier solución de recubrimiento todavía permanecía en las proyecciones. se detectó material de baja masa molecular en la base, en algunos casos, pero rara vez en las puntas de proyección (Figura S3)
vacunación Nanopatch ™ provoca virus de larga duración neutralizar la respuesta inmune, comparable con intramuscular
Nanopatch ™ las dosis se divide sobre cada oreja (es decir, un parche por oído), y se administró en el día 0 y de nuevo en el día 14. los sueros se recogieron en el día 28 y día 112 después de la vacunación para examinar la respuesta inmediata y la persistencia a largo plazo de anticuerpos publicar vacunación. Los sueros se ensayó en cuanto a la capacidad para neutralizar el virus HPV con el ensayo de neutralización basado en pseudovirión (PBNA) (Figura 4). Se utilizó un análisis de no inferioridad (Materiales y Métodos) similares a anteriores estudios de comparación de inmunización Virus del Papiloma Humano [43].
dosis Nanopatch ™ fueron de 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6.0), 5,7 ng (SD = 1,6) y 0,43 ng (SD = 0,084). Las dosis intramusculares eran 10 mg, 1 g, 100 ng, 10 ng, y 1 ng. Al día 28, Nanopatch ™ grupos de dosis de 300 ng y 55 ng han alcanzado virus comparable títulos neutralizantes a todos los grupos de inyección intramuscular (p & lt; 0,05). Por día 112, todas las dosis Nanopatch ™ han alcanzado títulos neutralizantes comparables contra todos los grupos de inyección intramuscular (p & lt; 0,05). Las réplicas se escalonan en el eje x para ayudar en la visualización. No inmunizado representa a una dosis de 0,05 ng debido a la escala logarítmica.
En el día 28 después de la inmunización, los títulos en el ng 300 ± 120 y 55 grupos de dosis ± 6,0 ng Nanopatch ™ fueron estadísticamente no inferior a todas las dosis intramusculares (p & lt; 0,001) con el título de media geométrica (GMT) de 30.500 y 26.000 respectivamente (Figura 4). En cada uno de los 5,7 ± 1,6 ng y 0,43 ± 0,084 ng nivel de dosis grupos Nanopatch ™, dos ratones no seroconversión.
Los anticuerpos neutralizantes se titularon en el día 112 después de la inmunización (Figura 4) para establecer a largo plazo eficacia. En el día 112 después de la inmunización, todos los grupos mostraron Nanopatch ™ 100% de seroconversión. En el día 112, todas las dosis Nanopatch ™ fueron estadísticamente no inferior a todas las dosis intramusculares (p & lt; 0,05).
Cuando se compara la respuesta en el día 112 y el día 28 dentro de cada grupo (Figura 4), el día 112 título no cumplía con los criterios de no inferioridad frente a la titulación día 28, tanto en el 100 ng y 1 ng grupos intramusculares (proporción de títulos: 100 ng IC del 90% (0.40, 1.2), y 1 ng 90% CI (0.39,1.2) ). Por el contrario, dentro de las comparaciones de titulación grupo Nanopatch ™ mostró títulos en el día 112 no fueron inferiores en todos los casos, y superior al nivel de dosis de 0,43 ± 0,084 ng, con el título de 112 días siendo 1.2-5.8 veces mayor que el título (el día 28 p & lt; 0,05) a la misma dosis
Discusión
Este documento demuestra recubrimiento y la liberación de un alumbre que contiene la vacuna Gardasil de una novela de micro-proyección parche matriz efectiva (Nanopatch ™) diseñado para. entregar la vacuna directamente a alrededor de 50% de la abundancia de células de antígeno de la piel que presentan [10], para la inducción eficaz de una respuesta de anticuerpos neutralizantes del virus.
eficiencia de salida varió entre los grupos de dosis. Se predice que esto depende principalmente de la morfología del recubrimiento. Esto es apoyado por nuestras expectativas teóricas de entrega (Figura S2). Nuestros comunicados predichos (figura S2) en comparación con la liberación medidos fueron más precisa dentro de los grupos de dosis más bajas. Nosotros predijimos exceso de la liberación en los grupos de dosis más altas. Esta discrepancia es probable que sea debido a la reducción de entre las proyecciones y revestimiento excesivo en la base de Nanopatches ™ (figura 2b) que conduce a pérdidas de solución de revestimiento. Dado que el recubrimiento en la base y la reducción de las proyecciones no se tuvieron en cuenta en los cálculos, cuando estos importes son significativos, que daría lugar a una sobreestimación de la cantidad entregada como los cálculos teóricos solamente se basaron en solución de revestimiento en las proyecciones. Este puente es probable que se alivia mediante la adición de un agente tensioactivo en formulaciones posteriores. Estos datos, y las imágenes de la aplicación de post demuestran que la liberación de las proyecciones es completa, y por lo tanto con los avances en la tecnología de recubrimiento para aislar recubrimiento únicamente a las porciones de las proyecciones que penetran en la piel, la liberación completa del 100% de eficiencia es posible con estas formulaciones.
es probable que ayudar a hacer posible dosis de vacuna se entrega constante, ya que es más fácil de asegurar el cumplimiento del protocolo de inmunización
liberación rápida. Un período de observación de 15-20 minutos después de una vacunación intramuscular norma general, se recomienda que ocurrirá dentro de este período [44] choque anafiláctico más. La liberación de la vacuna emulsionada Secar de la Nanopatch ™ se produjo dentro de los cinco minutos -. Por lo tanto cumplen fácilmente directrices período de observación
Para demostrar que los anticuerpos neutralizantes del virus fueron criados, el suero se proyectó por el Ensayo de Neutralización pseudovirión-Based (PBNA) - considerado el "patrón oro" en las directrices de la OMS para las vacunas contra el VPH [45], [46]. Este ensayo mide la eficacia de los anticuerpos u otros compuestos en el bloqueo de la entrada del virus HPV en células 293TT [47]. Esto es significativo, ya que se cree protección a ser el resultado de la neutralización del virus mediada por anticuerpos [48], [49]. El método también elimina el sesgo de usar el mismo material tanto para la inmunización y el ensayo inmunológico que se produce cuando se utiliza ELISA. Ensayo señal se genera solamente por pseudovirions intactas que imitan el virus nativo, de este modo cualquier respuesta inmune generado contra contaminantes o proteína desnaturalizada no tendrá impacto en los resultados de el ensayo de neutralización. Nanopatch ™ inmunización con 0,43 ± 0,084 ng de VPH-16 dio como resultado la neutralización de virus de la respuesta en el día 112 después de la vacunación. Esto implica que la proteína L1 recubierto seco mantiene una estructura similar a virus nativo. Los autores especulan que algún grado de desensamblaje de VLP en pentámeros puede haber ocurrido. Esta afirmación se basa en nuestros estudios similares utilizando vectores virales (datos no publicados). Debido a la mayor inmunogenicidad de las VLP en comparación con pentámeros, si el desmontaje en pentámeros se está produciendo actualmente durante-revestimiento en seco, un gran aumento de la actividad es probablemente a través de la reformulación para preservar aún más la estructura de VLP.
Mientras que los primeros resultados mostraron solamente 50% de seroconversión en el 5,7 ± 1,6 ng y 0,43 ± 0,084 ng grupos Nanopatch ™, las ventajas más claras en el sangrado terminal cuando todos los ratones tienen sero-convirtieron. A las dosis más bajas intramuscular comenzó a tambalearse, con los títulos de dos ratones que caen por debajo del límite de detección. Es posible que Nanopatch ™ inmunización, con las vacunas de alumbre que contiene, tiene una cinética de liberación más lentas en comparación con la administración intramuscular - debido a la diferente sitio de administración y un mayor efecto de depósito de alumbre deshidratado. Mientras que dosis extremadamente bajas de HPV-VLP parecen intramuscular inmunogénica en ratones, las dosis para los seres humanos en las vacunas aprobadas están en el rango de 20 a 40 g por subtipo. la cinética de liberación lenta pueden alterar favorablemente resultados inmunológicos y ayudar en la consecución de la activación óptima de APCs sin la necesidad de aplicar físicamente más dosis. Se requiere trabajo adicional para investigar esto.
Los estudios previos de la inmunización intradérmica con COPV [33], [34] utilizaron un ensayo ELISA por lo que una comparación directa con nuestros resultados no es posible. Suzich et al [34] estudiaron la administración intradérmica de ensamblado COPV-VLP y obtuvo una protección parcial al nivel de dosis sub-nanogramos. En comparación, un estudio posterior de Yuan, et. Alabama. [33] con la administración intradérmica de proteína de fusión COPV-L1-GST (incapaz de montar en VLP) no mostraron respuesta detectable por ELISA por debajo de una dosis de 400 ng. Este trabajo se centró en la asamblea pentámeros incompetentes como una alternativa de bajo costo para las VLP. En ambos casos, se observó una protección parcial frente a la exposición incluso cuando no se detectaron anticuerpos. Nanopatch ™ inmunización con la vacuna antigripal de virus de división da reducción de la dosis superior contra intramuscular [10] en comparación con lo que se ha demostrado en la administración intradérmica [50]. Si el desmontaje de las VLP de HPV-está ocurriendo en nuestro revestimiento seco Nanopatch ™, la comparación de dosis efectiva más cercano es con el trabajo de Yuan et al. Esto sugeriría que Nanopatch ™ inmunización puede dar mayor inmunogenicidad en una comparación directa con la administración intradérmica (y por lo tanto, presumiblemente, la administración intramuscular) de L1-pentámeros. Sin embargo, como las vacunas actualmente autorizadas se basan VLP, la reformulación de preservar la integridad de VLP será el tema central de los trabajos futuros
Nuestra ensayos de liberación de medir la proporción de recubrimiento que se libera en la piel -. No miden lo proporción de antígeno se libera de manera efectiva desde el alumbre, ni su conformación en la liberación. Si se coagula el gel de alumbre, de acuerdo con estudios anteriores [17], el antígeno puede no escapar de la matriz de alumbre colapsado - reduciendo así la dosis efectiva. Este efecto puede de hecho negar cualquier beneficio adyuvante alumbre disponga otra cosa, aunque se necesitan más estudios para determinar el grado en que la matriz de alumbre deteriora la liberación, y su impacto. El trabajo futuro se investigará la estructura de proteínas y la coagulación del alumbre, así como excipientes para reducirlo. Como el VPH-L1-VLP son altamente inmunogénicas, incluso sin adyuvante, también se estudiarán las formulaciones sin alumbre. Especulamos que con formulaciones mejoradas, Nanopatch ™ inmunización con el tiempo puede significar menores dosis de alumbre como adyuvante VLP se puede utilizar para inducir una respuesta inmune duradera en los seres humanos.
El trabajo futuro se centrará en mejorar la preservación de la dosis en Nanopatch ™ inmunización, y la investigación de termoestabilidad. Con este fin, la integridad de VLP recubierta seca, la exploración de las VLP no adyuvadas y mejorar formulaciones serán exploradas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Se llevaron a cabo todos los experimentos con animales de acuerdo con el Universidad de Queensland reglamentos de ética animal.
Nanopatch ™ Fabricación
Nanopatches ™ fueron fabricados por Deep Reactive Ion Etching según la patente [51] en el Laboratorio Rutherford Appleton, Oxford, Reino Unido. Nanopatches ™ se revistieron por pulverización iónica con oro con un espesor de 100 nm. morfología uniforme fue confirmada por microscopía electrónica de barrido (SEM) en un Philips XL30. Las muestras fueron inclinadas a 45 ° para confirmar el perfil de proyección adecuada.
Nanopatch ™ Recubrimiento
Gardasil (Merck, EE.UU.) se centrifugó a 5000 g durante 15 minutos para sedimentar el alumbre con el virus adsorbido como partículas. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se re-suspendió en metilcelulosa a una concentración final de 10 g /l de metilcelulosa, y 100 ng /l de HPV-16-VLP. Diez veces diluciones en serie se prepararon en 10 g /l de metilcelulosa a la formulación de diferentes dosis. Methocel 60 HG - metil-celulosa (cat#646555) se adquirió de Sigma Aldrich (Castle Hill, Nueva Gales del Sur, Australia)
Nanopatches ™ con 110 micras largas agujas se recubrieron con la pipeta 8 l de solución de recubrimiento sobre. la superficie y revestimiento en seco por medio de chorro de nitrógeno como se describe anteriormente [42]. la morfología de revestimiento apropiado se confirmó por SEM.
Nanopatch ™ Inmunización
cuatro grupos (n = 5) de ratones hembra C57BL /6 a las 6 semanas de edad fueron anestesiados con Ketamil® y Xylasil®. Ratones fueron parcheados una vez en cada oreja en la cara ventral utilizando un dispositivo de aplicación de la primavera de aplicar el parche a 2,0 ms
-1 - una velocidad encontrado que da una penetración máxima de la aguja sin dañar los tejidos (datos no mostrados). Las dosis se indica en este documento se refieren a la dosis total de HPV-16 para cada inmunización distribuidos en dos Nanopatches ™, y los ratones se inmunizaron en el día 0 y aumentó en el día 14. Los parches se llevan a cabo in situ durante 5 minutos. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación en Salud y Medicina (Australia). El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad de Queensland (Número de permiso de AIBN /020/10 (NF)). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Las inyecciones intramusculares
dosis Gardasil® se concentraron por centrifugación a 5000 g durante 15 minutos. El exceso de sobrenadante se retiró y sedimento se resuspendió en la cantidad apropiada de sobrenadante para dar una concentración de VLP de HPV-16 de 0,2 g /l. Cuatro diluciones seriadas de 10 veces se prepararon en el exceso de sobrenadante.
Cinco grupos (N = 5) de ratones C57BL /6 a las 6 semanas de edad fueron inmunizados por vía intramuscular en el día 0 y aumentó a los 14 días con 25 uL entregados aproximadamente 2 mm en cada músculo caudal de la pata trasera con cada grupo que recibió 10 mg, 1 mg, 100 ng, 10 ng o 1 ng de HPV-16 por ratón por inmunización.
Aplicación de control
Control tópico: Un grupo (N = 5) de ratones C57BL /6 a las 6 semanas de edad fueron anestesiados con ketamil y xylasil. Los ratones fueron restringidos con la superficie ventral del oído plana, y 125 l de Gardasil® (que contiene 10 g de HPV-16) se aplica tópicamente durante cinco minutos
Fluvax inmunizados de control:. Un grupo (N = 5) de C57BL /6 ratones a 6 semanas de edad fueron anestesiados con Ketamil® y Xylasil®, y se inmunizaron por vía intramuscular con 6 g de Fluvax 2008® (CSL Ltd., Melbourne, Australia) en un volumen de 30 l.
de control no inmunizados : Un grupo (N = 5) de ratones C57BL /6 a las 6 semanas se anestesiaron con Ketamil® y Xylasil® y sacrificado inmediatamente después de la cesación de los reflejos mediante punción cardíaca
colección de sueros
sangre. Las muestras se obtuvieron en el día 28 después de la vacunación y 112 por hemorragias retro-orbital, y se separan del suero. Sueros fueron almacenados a -20 ° C hasta su análisis.
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
Las muestras fueron examinadas en electrones secundarios y retrodispersados modos de electrones en un Philips XL30.