Extracto
Antecedentes
El factor nuclear kappa B (NFkB) desempeña un papel clave en la regulación de la apoptosis. La función de NFkB se inhibe mediante la unión al inhibidor de NFkB (I? B), y la interrupción de la balanza de NFkB y I? B está relacionado con el desarrollo de muchas enfermedades, incluyendo tumores. Por lo tanto, la hipótesis de que el
NFκB1 (-94del /insATTG)
y
NFκBIA gratis (2758 A & gt; G). Polimorfismos se asocian con el cáncer colorrectal susceptibilidad (CRC)
métodos
En un estudio de casos y controles de base hospitalaria de pacientes con CCR 1001 y 1005 la frecuencia controles sin cáncer, emparejados por edad y sexo, genotipo polimorfismos utilizando la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) método y realiza ensayos de luciferasa y análisis de Western blot para identificar si las variantes genéticas en
NFκBIA
alteran sus expresiones y funciones de los genes y por lo tanto el riesgo de cáncer.
resultados
Se encontró que tanto
NFκB1-94 ins /delATTG
y
NFκBIA 2758 A & gt; G
polimorfismos fueron correlacionados con el riesgo de CCR (OR = 1,47; IC del 95% = 1,14 a 1,86 y OR = 1,38; 95% CI = 1,14-1,66, respectivamente). Por otra parte, cuando se evalúan estos dos polimorfismos en conjunto, los genotipos combinados con 2 variante (riesgo) alelos (
2758GG
y
-94ins /ins + del /ins
) se asociaron con un mayor riesgo de CRC (OR = 1,71; IC del 95% = 1,23 a 2,38) en comparación con la variante 0, y la tendencia significativa para los 2 alelos (variantes de riesgo) fueron más pronunciadas entre los subgrupos de edad y lt; 60 años, las mujeres, nunca bebedores, que nunca habían fumado, las personas con un IMC normal y aquellos con antecedentes familiares de cáncer (
P
tendencia Hotel & lt; 0,01). Por otra parte, los ensayos de luciferasa mostraron que el alelo G en el 3'UTR disminuyó significativamente
NFκBIA
la estabilidad del ARNm y la
Un alelo
regulación por
in vitro miRNA449a
y que el NFκBIA los niveles de expresión de proteínas de la
AA + AG
portadores de variantes fueron significativamente mayores en los tejidos peritumoral que los del
2758GG
genotipo.
Conclusión
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos parecen contribuir conjuntamente al riesgo de CCR. Estas dos variantes pueden ser un modificador genético de la susceptibilidad CRC en esta población del sur de China
Visto:. Canción S, Chen D, Lu J, Liao J, Luo Y, Yang Z, et al. (2011)
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos están asociados con mayor riesgo de cáncer colorrectal esporádico en una población del sur de China. PLoS ONE 6 (6): e21726. doi: 10.1371 /journal.pone.0021726
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 23 Marzo, 2011; Aceptado: 6 Junio 2011; Publicado: 30 de junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Natural de las subvenciones de China [81072042 Lei Wang, 81072366 a Jiachun Lu y 81001108 a Yisheng Wei], los provinciales Científicas becas de investigación de Guangdong [8151008901000059, 10251008901000008 a Lei Wang], el gobierno de la provincia Gongdong, Departamento de Educación del Gobierno chino, Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de china [00590101220610034 a Jianping Wang], y el Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de china, [200805580074 a Jianping Wang] y Yat-Sen Programa de Cultivo talento innovador para una excelente tutores [88000 -3126201 a Dianke Chen y Wang Lei] y el apoyo de los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades de Centroamérica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo cáncer más común en las mujeres en todo el mundo, y se estima que había aproximadamente 1,2 millones de casos de CCR recién diagnosticados y 608,700 muertes relacionados en la 2008 [1]. Los registros del registro de defunciones municipal de la ciudad de Guangzhou, provincia de Guangdong, China, indican que el CRC es el quinto cáncer más común. La tasa de mortalidad se incrementó dramáticamente de 4.33 /10
5 personas en 1970 a 12.13 /10
5 personas en de 2000 [2]. La mayoría de los casos de CCR (aproximadamente el 80%) son esporádicos [3], pero una predisposición hereditaria está presente en el 20-35% de los pacientes, lo que sugiere que los factores genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo de CRC [4]. El consumo de alcohol y el consumo de tabaco [5], [6], los factores dietéticos y de estilo de vida [7], y la enfermedad inflamatoria intestinal como la colitis ulcerosa [8], [9] han demostrado que se asocia con el riesgo de CCR. Aunque muchas personas están expuestas a estos factores de riesgo, sólo algunos de los individuos expuestos desarrollan CRC, lo que indica que la variación genética determina en parte la susceptibilidad individual a la tumorigénesis colorrectal.
La apoptosis, un proceso celular altamente regulado, participa en el desarrollo, el tejido mantenimiento de la homeostasis y la eliminación de células no deseadas [10]. La desregulación de este proceso es probable que contribuya a la tumorigénesis [11]. Los caminos bioquímicos de la apoptosis son complicados y dependen no sólo de las células, sino también los inductores de la apoptosis. La evidencia sustancial sugiere que la aparición y el desarrollo de cáncer se asocia tanto con la supervivencia celular prolongada y se suspendieron apoptosis en lesiones precancerosas y, en consecuencia, la apoptosis aberrante puede permitir para el crecimiento celular sin control [12].
factor nuclear kappa B ( NFkB) es un importante regulador de la transcripción de la respuesta inmune, la adhesión celular, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis [13]. Cinco miembros (p50 /p105, p65 /Rela c-Rel, RelB, y p52 /p100) en la familia NFkB se han identificado, y la forma dimérica de p50 NFκB1 /de RelA es la forma más importante [14]. En la célula en reposo, NFkB se inactiva en el citoplasma mediante la asociación con una proteína inhibidora de secuestrante, I? B?, Β o γ, y la proteína más común de esta familia es el inhibidor de α NFkB (NFκBIA) [15]. En la ruta de activación clásica, la fosforilación y la degradación de las proteínas inhibidoras conducen a la disociación de la NFkB NFkB complejo y translocación al núcleo, donde puede activar la transcripción de un gran número de genes [16]. Como un importante factor de transcripción, NFkB media la respuesta de supervivencia mediante la inhibición de la apoptosis dependiente de p53 y hasta la regulación de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 y los inhibidores de caspasas [17], [18]. Por el contrario, NFkB también se activa tanto por el intrínsecos y extrínsecos estímulos apoptóticos y media la regulación positiva de genes pro-apoptóticos como
TRAIL R2 /DR5
,
Fas
, y
Fas
ligando [19], [20]. Una activación inapropiada de NFkB podría perturbar la homeostasis del tejido y conducir a la apoptosis desregulada. Además, la actividad de NFkB se ha observado en varios tipos de cánceres, incluyendo CRC [21], [22], lo que indica que puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis [23], [24].
NFκB1 gratis (codificación de NFkB) mapas en el cromosoma 4q23-P24 y consta de 24 exones [25], [26], y su gen inhibidor
NFκBIA gratis (codificación de I? B) es de 3,5 kb de largo, con seis exones, y está localizado en el cromosoma 14q13 [27], [28]. polimorfismos genéticos han identificado los estudios de nucleótido único (SNP) en
NFκB1
y
NFκBIA
[29], [30]. Recientemente, una inserción común /deleción (/deletionATTG rs28362491 -94 inserción) polimorfismo en el
NFκB1
región promotora y una región 3 'no traducida (3'UTR) polimorfismo 2758A & gt; G (rs696) en
NFκBIA
se observó una correlación significativa con la enfermedad inflamatoria intestinal [31], [32] y el cáncer [33], [34], [35]. Los estudios epidemiológicos también han investigado la asociación entre
NFκB1
polimorfismos y el riesgo de CCR en los alemanes y los
NFκBIA
polimorfismo y el riesgo de CCR en el sueco con resultados contradictorios [36], [37].
no ha habido ningún informe anterior sobre la asociación entre el
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos y el riesgo de CCR. A medida que el sistema de NFkB /I? B juega un importante papel regulador en la ruta apoptótica y la expresión desregulada de la
NFκB1
y
NFκBIA
se ha observado en el CCR, la hipótesis de que combinaba
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos pueden estar asociados con un mayor riesgo de CCR. Para probar esta hipótesis, genotipo del
NFκB1-94 inserción /deletionATTG
y
NFκBIA 2758A & gt; G
polimorfismos en nuestro estudio de casos y controles de base hospitalaria en curso de CCR en una población del sur de China, y llevaron a cabo otros ensayos de luciferasa y análisis de Western blot para identificar si las variantes genéticas en
NFκBIA
alteran sus expresiones y funciones de los genes y por lo tanto el riesgo de cáncer.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
El protocolo de estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Sun Yat-Sen. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante después de una explicación completa del estudio.
Los sujetos del estudio y recogida de muestras
Entre julio de 2002 abril de 2010, un total de 1001 pacientes con confirmada por histopatología y sin tratar CCR esporádicos fueron reclutados prospectivamente a partir de la Primera y hospital Afiliado Sexta (gastrointestinal & amp; hospital anal) y el Centro de cáncer de la Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, china, el tumor Afiliado del hospital de Guangzhou Medical College, Guangzhou, china, Guangdong Provincial Popular de hospital, Guangzhou, china, y el hospital Popular de Panyu, Guangzhou, china. Todos estos sujetos estaban relacionados genéticamente étnicos chinos Han y eran de la ciudad de Guangzhou y las regiones circundantes en el sur de China. De los 1001 casos incluidos en este estudio, hubo 169 (16,9%) casos de cáncer de colon derecho, 309 (30,9%) casos de cáncer de colon izquierdo, y 523 (52,2%) de cáncer de recto. De acuerdo con American Joint Committee on Cancer Staging Manual, había 171 (17,1%) casos de la etapa I, 320 (31,9%) en estadio II, 345 (34,5%) en estadio III, y 165 (16,5%) en estadio IV. Mientras tanto, un total de 1.005 controles sin cáncer fueron seleccionados al azar de un grupo de sujetos de más de 10.000 personas que participaron en los programas de chequeo de salud en los puestos de salud de la comunidad en Guangzhou, China.
El estudio los participantes fueron entrevistados y se obtuvieron datos sobre el consumo de tabaco, consumo de alcohol y otros factores, incluyendo la historia familiar de cáncer utilizando un cuestionario estructurado. El nivel de tabaquismo, consumo de alcohol y antecedentes familiares de cáncer se definieron como se describe anteriormente [38]. Los sujetos cuyo índice (IMC) de masa corporal era & lt; 18,5 kg /m
2 fueron clasificados como tener bajo peso, sujetos cuyo índice de masa corporal era de 18,5 a 24,0 kg /m
2 tenían un peso corporal normal, los que tienen un índice de masa corporal & gt; 24.0 kg /m
2 tenían sobrepeso [39]. Se excluyeron los casos pertenecientes a la poliposis adenomatosa familiar y aquellos casos que cumplieron con los criterios de Amsterdam por poliposis hereditario CRC.
Genotipado
Cinco ml de sangre se recogió de cada participante y se extrajo el ADN genómico utilizando el DNA Mini Kit Blood (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. La genotipificación se realizó por el método (PCR-RFLP) reacción en cadena de polimerasa-restricción de longitud de fragmentos polimorfismo. Para la determinación del polimorfismo
NFκB1
promotor (rs28362491), el fragmento que contiene SNP fue amplificado utilizando los siguientes cebadores: 5'-TGGGCACAAGTCGTTTATGA-3 '(hacia delante) y 5'-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3' (hacia atrás) . PCR se realizó a 94 ° C durante 3 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 60 s con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR (281/285 pb de tamaño) se digirieron con
PFI hotels, MI (Fermentas, Vilnius, Lituania) a 37 ° C durante la noche seguido por electroforesis en gel de agarosa al 2%. Para la determinación del polimorfismo
NFκBIA gratis (rs696), el fragmento que contiene SNP fue amplificado utilizando los siguientes cebadores: 5'-GGCTGAAAGAACATGGACTTG-3 '(hacia delante) y 5'-GTACACCATTTACAGGAGGG -3' (inverso). La PCR se realizó a 94 ° C durante 5 min seguido de 32 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 54,3 ° C durante 45 s y 72 ° C durante 60 s con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Los fragmentos amplificados fueron digeridos con
Hae III
(Fermentas, Vilnius, Lituania) durante la noche a 37 ° C, seguido por electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Genotipo análisis fue realizado por dos experimentadores independiente que eran cegado a la condición de los sujetos como paciente o de control. A fin de validar los resultados de genotipado, se seleccionaron al azar 10% de las muestras para cada uno de los SNPs 2 para llevar a cabo ensayos repetidos, y los resultados fueron 100% concordantes. Además, el 5% de los productos de PCR para cada genotipo diana se purificaron y se confirmó por secuenciación directa (Figura S1 y S2 Figura).
Bioinformática análisis
Para investigar si las variantes genéticas de
NFκBIA
podría unirse a los microARN (miARN), se realizaron búsquedas de microARN objetivo de variantes genéticas de
NFκBIA
utilizando los programas de algoritmo (http://www.targetscan.org y http: //microrna.sanger .ac.uk /cgi-bin /blancos /v5 /search.pl).
cultivo de células
Tres líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano, HCT116, HT29 y SW480 se adquirieron de Colección de Cultivos de Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y cultivaron de forma rutinaria en la Dulbecco Modificado de Eagle Medium o el medio RPMI 1640 suplementado con 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células fueron cultivadas a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador humidificado.
interferencia de ARN, transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
miR-449a
imita la orientación
NFκBIA
, 5'-UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3 '(sentido) y 5'-CAGCUAACAAUACACUGCCAUU-3' (antisentido),
miR-449a
inhibidor, 5'-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3 ', MIR -34b imita la orientación
NFκBIA
, 5'-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3 '(sentido) y 5'-GGCAGUGGAGUUAGUGAUUGUU-3' (antisentido), y
miR-34b
inhibidor, 5 ' -AUGGCAGUGGAGUUAGUGAUUG-3 'se sintetizaron por GenePharma Co. (Shanghai, china). Además, el 3'UTR del
NFκBIA 2758A
alelo (2575-2955 pb respecto al sitio de inicio de la traducción) que contiene el
miR-449a
y
miR-34b
sitio de unión fue amplificado utilizando los siguientes dos cebadores, 5'-CCGCTCGAGCAAAGGGGCTGAAAGAA-3 '(sentido) y 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAATGTGGTCCTTCCATGA-3' (antisentido). Los fragmentos amplificados fueron restringidos con
Xho I y
No
I (New England Biolabs, Ipswich, MA) y luego se ligó en el
Xho I y
No
I sitio de restricción del plásmido de doble luciferasa, psiCHECK ™ -2 (Promega, Madison, WI). Además, el 3'-UTR de la
NFκBIA 2758G
alelo, que contenía un sitio de unión de mRNA mutado, se amplificó utilizando PCR mutagénesis dirigida al sitio y se clonó en psiCHECK ™ -2. Para la transfección, se sembraron células en placas de 24 pocillos a 1 x 10
5 células /pocillo y, después de una noche de incubación, las células fueron co-transfectadas con el plásmido informador (2758G o 2758A alelo) y miR imita o inhibidores usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se lisaron 48 h después de la transfección, y se midió la actividad de luciferasa usando un Dual Luciferase-Reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Cada experimento se realizó por triplicado y por lo menos tres veces independientemente
Western Blot análisis
Para analizar la correlación entre los
NFκBIA
polimorfismos en su gt 3'UTR (2758A y;. G ) y NFκBIA niveles de expresión de proteínas en los tejidos, 32 emparejados tejidos tumorales y peritumoral se obtuvieron de pacientes con CCR esporádicos resecados en la Sexta hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen y archivados en el banco de tumores. Todas las muestras de tejidos fueron confirmados histológicamente. Immunoblotting ensayos se realizaron como se describe anteriormente [38] y los anticuerpos contra NFκBIA y β-actina (Precision Task Group, Chicago, EE.UU.) fueron utilizados para el procedimiento. densitometría de proteínas se realizó utilizando el software Gel-Pro Analizador 4.0 (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD) y la expresión NFκBIA se normalizó en contra β-actina.
El análisis estadístico
Dos caras chi-cuadrado pruebas se utilizaron para evaluar las diferencias en las distribuciones de la edad, sexo, tabaquismo, consumo de alcohol, índice de masa corporal, historia de la menstruación, y la historia familiar de cáncer entre los casos y controles. El equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) se puso a prueba mediante una prueba de chi-cuadrado de bondad de ajuste para comparar las frecuencias genotípicas esperadas con las frecuencias observadas genotipo (+ 2PQ + q2 = 1 p2) en los controles sin cáncer. La asociación entre el estado de casos y controles y de cada SNP, medida por el odds ratio (OR) y su intervalo de confianza del 95% (IC), se estimó mediante un modelo de regresión logística no condicional, con y sin ajuste por edad, sexo, estado de fumar , el estado de consumo de alcohol, índice de masa corporal, sitio del tumor, y la historia familiar de cáncer. Estudios recientes indican que un análisis de los genotipos combinados podría ser más científicamente significativo que un análisis de polimorfismo de un solo en la predicción de las asociaciones de enfermedades. Por lo tanto el genotipo de datos combinados fueron estratificados además por edad, sexo y tabaquismo, el estado de consumo de alcohol, índice de masa corporal, sitio del tumor, y la historia familiar de cáncer. El modelo de regresión logística se utilizó también para la prueba de tendencia. se realizó la prueba t de Student para examinar la diferencia en los niveles de expresión del gen indicador de luciferasa entre los diferentes constructos. Kruskal-Wallis ANOVA de una sola vía se utilizaron para el análisis de la expresión de proteínas en los tejidos NFκBIA peritumoral de diferentes genotipos. Todas las pruebas fueron dos caras utilizando el software SAS (versión 9.1; SAS Institute, Cary, NC).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Características de la población estudiada
La distribución de las características demográficas de los 1001 casos de CCR esporádicos y 1005 controles sin cáncer se muestran en la Tabla 1. en general, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la edad, el estado de sexo y tabaquismo entre los casos y controles (
P Hotel & gt; 0,05 en total). En comparación con los controles, hubo más historia bebedores (casos frente a los controles, el 45,5% vs. 23,6%) (
P Hotel & lt; 0,01) en la cohorte de casos de CCR. Por otra parte, en comparación con los controles, los casos de CCR eran más propensos a tener una historia familiar de cáncer o un IMC más alto (
P Hotel & lt; 0,05 en ambos). En consecuencia, estas variables se ajustaron aún más en el modelo de regresión logística multivariante para evitar la posible confusión de los principales efectos de los SNPs en estudio. También fueron utilizados en la estratificación posterior y el análisis de interacción entre genes y medio ambiente.
estudio de PCR-RFLP de la
NFκB1
región promotora y el
NFκBIA Estrellas: 3 ' UTR región
Se realizó un análisis de la
NFκB1
región promotora por el método de PCR-RFLP. Dos repeticiones ATTG están presentes en el
NFκB1
región promotora, y un alelo que tiene una inserción ATTG (INS) se escindió en una de 45 pb y un fragmento de 240 pb después de la digestión con
PFI
MI mientras que el otro alelo eliminación (del) que tiene un solo ATTG a su promotor no se escindió (Figura 1.a). Por otra parte, después de la digestión con
Hae III
, el
2758GG
genotipo produjo un 316 pb y una banda de 108 pb mientras que el genotipo 2758AA produce una sola banda de 424 pb, y heterocigotos muestran todos 3 bandas (Figura 1.b).
(a)
PFI
perfil de banda digestión MI de la
NFκB1
gen, el 2% agarosegel. El carril 1 Gen Regla 100 pb rango bajo de la escala, los carriles 2 y 7 del /ins heterocigoto genotipo, las calles 4 y 6
ins /ins
genotipo, Lanes3, 5
del /del
genotipo. (B)
Hae III
perfil de banda digestión de los
NFκBIA
el 2% agarosegel. Carril 1 escalera de Gene Regla 100 pb rango bajo, carriles 3, 5 homocigoto G /G genotipo, carriles 2 y 6 homocigoto A /A genotipo, carriles 4, 7 heterocigoto A /G genotipo.
El
NFκB1-94ins /delATTG gratis (rs28362491) y
NFκBIA 2758A & gt; G gratis (rs696) polimorfismos están asociados con el riesgo de CCR esporádico
los genotipo y el alelo distribuciones de la
NFκB1-94ins /delATTG gratis (rs28362491) y
NFκBIA 2758A & gt; G gratis (rs696) polimorfismos entre los casos y los controles se resumen en la Tabla 2. El genotipo frecuencias observadas de estos dos polimorfismos fueron todos de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg en los sujetos de control (
P Hotel & gt; 0,05). Como se muestra en la Tabla 2, para rs28362491, la distribución del modelo genético co-dominante (del /del frente ins /ins /ins del frente), y el modelo dominante (ins /ins + del /ins frente del /del) difirió significativamente entre los casos de CCR y controles (ins /ins: OR = 1,70; IC del 95% = 1.29 a 2.25;
P Hotel & lt; 0,01; del /ins: OR = 1,33; IC del 95% = 1,03 -1.74;
P Hotel & lt; 0,01; ins /ins + del /ins: OR = 1,47; IC del 95% = 1,14-1,86;
P Hotel & lt; 0,01, respectivamente). Para rs696, había una diferencia significativa en la distribución de los genotipos rs696 entre los casos de CCR y controles (
P
& lt; 0,01). También se observaron diferencias significativas en la distribución del modelo recesivo de rs696 (GG frente a AA + AG) entre los casos de CCR y los controles (OR = 1,38; IC del 95% = 1,14-1,66;
P Hotel & lt; 0,05) . En consonancia, se encontró asociación significativa entre los dos SNPs y el riesgo de CCR esporádico.
análisis de la estratificación de la asociación de
NFκB1
y
NFκBIA
combinados con polimorfismos riesgo de CCR
Asimismo, analizaron los genotipos combinados de la
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos mediante el examen de la edad, el sexo, fumar, beber, el IMC, la localización del tumor, y la familia antecedentes de cáncer por regresión logística. Se combinaron los
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos basados en el número de variantes (alelos) de riesgo (es decir,
2758GG
y
-94ins /ins + del /ins
). Como se muestra en la Tabla 3, en comparación con el
NFκB1-94 del /del
y
NFκB1IA 2758AA + AG
genotipo, una variante portadores del genotipo combinado que eran & lt; 60 años de edad tenían un mayor riesgo de CCR (OR = 1,57; IC del 95% = 1,04-2,38) (
P Hotel & lt; 0,05). Un análisis más detallado reveló que la estratificación de los individuos con dos variantes tenían un riesgo significativamente mayor de CCR entre los subgrupos de pacientes de edad y lt; 60 años (OR = 2,18; IC del 95% = 1,37-3,44) (
P Hotel & lt; 0,01) , las mujeres (OR = 2,36; IC del 95% = 1,35-4,10) (
P Hotel & lt; 0,01), nunca fumadores (OR = 2,05; IC del 95% = 1.30 a 3.22) (
P
& lt; 0,01), nunca bebieron (OR = 1,87; IC del 95% = 1,23-2,84) (
P Hotel & lt; 0,01), las personas con un IMC normal (OR = 1,80; IC del 95% = 1.21- 2,69) (
P Hotel & lt; 0,01) y los que tienen antecedentes familiares de cáncer (OR = 4,57; IC del 95% = 1,34 a 15,6,
P
. & lt; 0,05)
miR-449a
imita suprime las actividades de la
NFκBIA
2758 A & gt; G polimorfismo
además, se analizó el 3'UTR del em
NFκBIA
2758 a & gt; G polimorfismo usando un algoritmo de computadora y encontró que el polimorfismo podría afectar miARN vinculante.
miR-449a
y
miR-34b
, que están involucrados en una amplia variedad de funciones biológicas, se encontró que tenían un sitio de unión dentro de la 3'-UTR del
NFκBIA
2758 A & gt; G polimorfismo (Figura 2a). Para determinar el efecto específico de alelo de la
NFκBIA
2758 A & gt; G variante en la actividad de la 3'UTR y si este polimorfismo afectada la unión de los genes miARN, transfectadas líneas celulares de CRC SW480, HT29 y HCT116 con el reportero plásmidos que llevan el
2758G
o
2758A
alelo y miR imita o inhibidores (Figura 2a). Se encontró que, en ausencia de miR imita o inhibidores, en comparación con el
2758A
alelo, el
2758G
alelo mostraron una disminución de las actividades de luciferasa (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 2b).
miR-449a
imita podría reducir las actividades relativas de luciferasa de la
2758A
alelo mientras que
inhibidores de miR-449a
significativamente hasta regulan las actividades relativas de luciferasa de la
2758A
alelo en todas las tres líneas celulares (
P Hotel & lt; 0,01 para HT29;
P Hotel & lt; 0,05 para SW480 y HCT116) (Figura 2b). Por otro lado,
miR-34b
imita no ejerció ningún efecto notorio sobre las actividades relativas de luciferasa de la
2758G
alelo en estas líneas celulares (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el
2758G
alelo en el 3'UTR de la
NFκBIA
reduce la actividad de la luciferasa normalizada en comparación con el
2758A
alelo, probablemente debida a una menor la estabilidad del ARNm o la eficacia de la traducción y que
miR-449a
tiene la capacidad de unirse y parcialmente reprimir la expresión de luciferasa a través del segmento de
NFκBIA
3'UTR cuando se lleva a la
2758A
alelo de
NFκBIA
2758 a & gt;. G polimorfismo
(a) un sitio putativo objetivo de
miR-449a y miR-34b
altamente conservadas en el
NFκBIA
mRNA 3'UTR. (B) psiCHECK-2 de doble ensayo de luciferasa en tres líneas celulares: SW480, HT29 y HCT116. Las células fueron transfectadas con plásmidos informadores solo o co-transfectadas con microARN. La expresión de luciferasa se midió 48 horas después de la transfección. La actividad de la luciferasa de cada construcción se normalizó contra el control interno de la luciferasa de Renilla. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; bares, Dakota del Sur. *,
P
. & Lt; 0,05 para todas las comparaciones de cada línea celular entre las actividades de las construcciones del gen indicador
Asociación de los
NFκBIA3'UTR
polimorfismos con la expresión de la proteína NFκBIA
también estábamos interesados en investigar si el
NFκBIA3'UTR
polimorfismos (
2758A & gt; G
) se asociaron con un aumento o reducción de la expresión de la proteína NFκBIA . Hemos recogido 32 emparejados tejidos tumorales y peritumoral de los pacientes con CCR tratados de diferentes genotipos. Immunoblotting análisis reveló que los niveles de NFκBIA (NFκBIA /proporción de proteína β-actina) en los tejidos peritumoral de 12 casos de la 2758AA
genotipo fue de 0,80 ± 0,09 y los de 8 casos de la
genotipo fue de 0,63 ± 0,11, ambos de los cuales fueron significativamente más altos que los de los otros 12 casos de la
2758GG
genotipo (0,47 ± 0,06) (análisis de varianza,
P & lt
; 0,05) (Figura 3). Sin embargo, en los tejidos tumorales, NFκBIA niveles de expresión no difirieron significativamente entre los casos de diferentes genotipos (datos no mostrados). Estos resultados indican que los niveles de NFκBIA fueron significativamente mayores en los tejidos de los pacientes peritumoral de los
2758AA + AG
genotipos que las del
2758GG
genotipos.
NFκBIA los niveles de proteína en el 32 esporádicos tejidos peritumoral CRC de individuos con diferentes genotipos de
2758A & gt; G
. Las proteínas NFκBIA niveles de expresión se normalizaron a la de la β-actina mediante el cálculo de los niveles de expresión relativos. designación genotipo individual: Para 2758A & gt; G, carriles 1-3, 9-11, 17-20, 25-26, el genotipo AA (n = 12); carriles 4-6,12-14, 21-24, 27-28, genotipo GG (n = 12); carriles 7-8, 15-16, 29-32, el genotipo AG (n = 8).
Discusión
En el presente estudio, hemos investigado las asociaciones de la
NFκB1-94del /insATTG
y
NFκB1IA 2758A & gt; G
polimorfismos con riesgo de CCR en una población del sur chinos Han. Se encontró que tanto la
NFkB1-94del /ins ATTG
y
NFKBIA 2758A & gt; G
polimorfismos se asociaron con un mayor riesgo de CCR. Para el
NFKB1 CD -
94del /insATTG
polimorfismo, con los
-94del /del
como referencia, se encontró que los
-94 (ins /ins + del /ins)
genotipo se asoció con un aumento estadísticamente significativo del riesgo de CCR. Para el
NFKBIA 2758A & gt; G
polimorfismo, con el
2758 (AA + GA)
como referencia, también se encontró que el
2758GG
genotipo se asoció con una reducción estadísticamente aumento significativo del riesgo de CCR. Además, cuando evaluamos
NFKB1
y
NFKBIA
polimorfismos en combinación, se encontró que la combinación
2758GG
y
-94ins /ins + del /ins
genotipo se asoció con un aumento significativo del riesgo de CCR en comparación con aquellos sin el
2758GG
y
-94ins /ins + del /ins
genotipo, y este aumento del riesgo era más pronunciado entre los más jóvenes que 60 años, mujeres, nunca, nunca fumadores bebedores, las personas con un IMC normal y aquellos con antecedentes familiares de cáncer. En los ensayos in vitro, también se encontró que, en comparación con el 2758A
alelo, el
2758G
alelo variante mostró disminuyó significativamente la estabilidad del ARNm y /o la eficacia de la traducción. Por otra parte, se encontró que los niveles de NFKBIA significativamente más altos en los tejidos de los pacientes peritumoral de los
2758AA + AG
genotipos que las de los
2758GG
genotipos, lo que sugiere que el
2758A & gt; G
polimorfismo es potencialmente funcional y el polimorfismo
2758A & gt; G Restaurant at 3'UTR de
NFKBIA
podría afectar la expresión génica. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio para investigar si
NFKB1
y
NFKBIA
polimorfismo y su polimorfismo combinado se asociaron con riesgo de CCR.
Hay varias líneas de evidencia que respalda nuestras conclusiones. La
NFkB
1 Rutas parecen jugar un papel crítico en múltiples patologías humanas mediante la regulación de la transcripción de genes implicados en la respuesta inmune, proliferación celular, y la apoptosis [13]. Se ha demostrado que las alteraciones de
NFkB
1 expresión juega un papel importante en la protección de células de la apoptosis [40].
NFkB
1 actividad se ha observado en varios tipos de cáncer [41], incluyendo el cáncer de mama [42] y CRC [21], para contribuir a la angiogénesis tumoral y la progresión [43]. También hay muchos datos experimentales sugieren que la vía NFκB1 /I? B puede participar en la invasión de células tumorales, así [44]. Por lo tanto, las variantes de la
NFκB1
y
NFκBIA
genes, si es funcional, se podría esperar que tenga un efecto sobre la muerte de las células, y por lo tanto, la carcinogénesis.
Varios asociación los estudios han informado de que el
NFκB1
y
NFκBIA
polimorfismos se relaciona con el desarrollo de enfermedades inflamatorias y otras, incluyendo la colitis ulcerosa, enfermedad de Graves, y la diabetes mellitus, y la susceptibilidad a tumores como el melanoma, cáncer de vejiga y el CRC en diferentes grupos étnicos [32], [36], [45], [46], [47], [48].