Extracto
A pesar de que la expresión de las proteínas de señalización celular es utilizado como biomarcador pronóstico y predictivo, la variabilidad de los niveles de proteína dentro de los tumores es no se ha estudiado. Se evaluó la heterogeneidad intratumoral de expresión de la proteína en el cáncer de ovario primario. proteínas de longitud completa fueron extraídos de muestras de tejido 88 fijado en formol y embebidos en parafina de 13 carcinomas de ovario seroso de alto grado de primaria con 5-9 muestras cada una. Además, 14 muestras de epitelio trompa de Falopio normales sirvieron como referencia. arrays de proteínas de fase inversa cuantitativa se utilizaron para analizar la expresión de proteínas de señalización 36 de células incluyendo HER2, EGFR, PI3K /Akt, y las vías angiogénicos así como 15 activados proteínas (fosforilados). Encontramos considerable heterogeneidad intratumoral en la expresión de proteínas con un coeficiente medio de variación del 25% (rango 17 a 53%). El grado de heterogeneidad intratumoral difería entre las proteínas (P & lt; 0,005). Curiosamente, no hubo diferencias significativas en el grado de heterogeneidad entre las proteínas fosforilados y no fosforilados. En comparación, se evaluó la variación de los niveles de proteína entre tumores de diferentes pacientes, que reveló un coeficiente medio similar de variación de 21% (rango 12 a 48%). Sobre la base de la agrupación jerárquica, las muestras del mismo paciente en clúster más estrechamente en comparación con muestras de diferentes pacientes. Sin embargo, una clara separación de tumor frente al tejido normal por agrupaciones sólo se logró cuando los valores medios de expresión de todas las muestras individuales por tumores analizados. Mientras que la expresión diferencial de algunas proteínas se detectó de forma independiente del método de muestreo utilizado, la mayoría de las proteínas sólo demostró la expresión diferencial cuando se analizaron los valores de expresión media de múltiples muestras por tumor. Nuestros datos indican que la evaluación de las proteínas de señalización celulares establecidas y nuevos marcadores de diagnóstico o pronóstico que puedan requerir el muestreo de los cánceres de ovario seroso en varios lugares distintos para evitar el sesgo de muestreo
Visto:. Mittermeyer G, K Malinowski, Beese C, Höfler H, Schmalfeldt B, Becker KF, et al. (2013) Variación en la señalización celular expresión de la proteína pueden introducir sesgo de muestreo en el cáncer epitelial de ovario primario. PLoS ONE 8 (10): e77825. doi: 10.1371 /journal.pone.0077825
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: 4 Julio, 2013; Aceptado: 5 Septiembre 2013; Publicado: 28 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Mittermeyer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por subvenciones internas del Departamento de Patología y el Departamento de Obstetricia y Ginecología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el segundo cáncer ginecológico más común y la que tiene la mayor tasa de mortalidad en el mundo occidental [1]. Durante las etapas tempranas de la enfermedad es principalmente asintomáticos y en consecuencia la mayoría de los pacientes son diagnosticados con etapas avanzadas que resulta en un período de cinco años tasa de supervivencia global pobre de menos de 40% [2]. El tratamiento estándar para pacientes con cáncer de ovario es la cirugía seguida de platino y taxanos quimioterapia de combinación basada. Aunque la mayoría de los pacientes muestran una respuesta inicial a la quimioterapia, la mayoría posteriormente desarrolla resistencia y 50-75% de los pacientes recaen dentro de los cinco años [3]. La evaluación de las proteínas de señalización celular ofrece la oportunidad de identificar los posibles nuevos objetivos de medicamentos, así como para predecir la respuesta al tratamiento y la ayuda en las decisiones de tratamiento individualizadas [4]. Con el fin de servir como un biomarcador para una terapia dirigida optimizado acercarse a la identificación y el análisis cuantitativo de estructuras diana y /o las respectivas cascadas de señalización corriente abajo es de alta relevancia. Sin embargo, el potencial de la heterogeneidad intratumoral de señalización de expresión de la proteína puede introducir un sesgo de muestreo y la célula no se ha evaluado ampliamente en el cáncer de ovario.
Una serie de proteínas de señalización celular han sido identificados previamente como posibles dianas terapéuticas o como potencial de pronóstico o biomarcadores predictivos. Estos incluyen VEGF, VEGFR, PDGFR, el EGFR o HER2, PI3K, Akt, mTOR y otros [5], [6], [7], [8]. Del mismo modo importante es la activación de las vías de señalización celular reflejados por las formas fosforiladas de las proteínas diana o componentes de sus respectivas vías de señalización corriente abajo [9], [10], [11].
El objetivo general de este estudio fue evaluar el grado de heterogeneidad de la expresión de proteínas de señalización celular en el cáncer de ovario seroso. Se analizaron 36 proteínas de señalización celular, incluidos 15 proteínas fosforiladas que representan la proliferación y rutas relacionadas con la angiogénesis. Estamos, además, investigó el impacto potencial de la heterogeneidad en la detección de la expresión diferencial de proteínas entre el tumor y el tejido normal o entre subgrupos de tumores.
En comparación, se evaluó la variación fisiológica de la expresión de la proteína en el tejido seroso epitelial normal entre los distintos pacientes. epitelio de las trompas de Falopio de individuos sanos y de los tubos contralateral no afectados de pacientes con cáncer se utilizó como un tejido de referencia, ya que estudios previos han demostrado que los cánceres serosos son molecularmente más estrechamente relacionados con el epitelio de las trompas. las células epiteliales de las trompas de Falopio se han sugerido como las células de origen para al menos algunos carcinomas serosos de alto grado [12], [13].
Para el análisis de un gran número de muestras y proteínas diana tal como se aplica en este estudio, la metodología de inmunotransferencia convencional no es adecuado ya que se necesitarían más de 3500 carriles de Western blot para llevar a cabo un solo análisis de todas las muestras y los anticuerpos. La matriz de proteína de fase inversa (RPPA) permite el análisis simultáneo de múltiples muestras para la expresión de varias proteínas bajo las mismas condiciones experimentales [14], [15]. Análisis de proteínas en los duplicados y las diluciones en serie permite la detección cuantitativa reproducible de expresión de la proteína. RPPA ha demostrado ampliamente su viabilidad para el análisis de muestras clínicas crioconservados [16], [17], [18]. Más recientemente, nuestro grupo y otros establecieron que la tecnología RPPA también permite de forma fiable el análisis de (FFPE) muestras de tejido fijado en formol e incluidos en parafina [19], [20], [21], [22] y es una herramienta adecuada para la heterogeneidad de proteínas dirección dentro de este tipo de muestras [23].
Materiales y Métodos
muestras de tejido
Un total de 88 muestras de FFPE de 13 pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado de primaria fueron estudiados. 14 muestras de epitelio de las trompas de Falopio normales, incluyendo 10 individuos sanos y 4 tubos contralateral no afectados de pacientes con cáncer fueron utilizados como referencia. Un esquema de la cohorte de pacientes y selección de muestras se representa en la Figura 1.
En los 13 casos, 5-9 muestras de tejido estaban disponibles. En diez pacientes con tumores bilaterales, las muestras se obtuvieron de ambos ovarios
H & amp;. Secciones E manchadas de todas las muestras incluidas en parafina fueron revisados por un patólogo experimentado (SA) para caracterizar el subtipo histológico, el porcentaje de tumor invasivo viable células, fibrosis o necrosis, el porcentaje de la infiltración de células inflamatorias, y la frecuencia de mitosis.
Protein Extraction
Todas las muestras de tejido del mismo paciente fueron procesadas simultáneamente. La extracción de proteínas se realizó como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las secciones de tejidos FFPE se desparafinaron, y las proteínas se extrajeron usando tampón EXB Plus y el tratamiento térmico (Qiagen, Hilden, Alemania). 2-7 secciones de espesor 10 micras fueron procesadas en 100 a 170 l de tampón de extracción. El ensayo de proteínas de Bradford (BioRad, Hercules, EE.UU.) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar las concentraciones de proteínas. Las concentraciones de proteína se ajustaron a 2 mg /ml con tampón EXB Plus. Un Western blot de sondeo para β-actina se realizó a partir de lisados seleccionados al azar (n = 11) para demostrar con éxito la extracción de proteínas y la idoneidad para el análisis conjunto de proteínas de fase inversa. Todos los lisados de proteína producida una banda clara β-actina en el Western blot.
Análisis de la expresión de proteínas mediante arrays de proteínas de fase inversa (RPPA) guía
Los niveles de expresión de 36 proteínas, incluyendo proteínas fosforiladas 15 eran determinado por RPPA. Los anticuerpos y las condiciones experimentales se resumen en la Tabla S1. RPPAs se generaron utilizando el SpotBot® Extreme Microarray Spotter acuerdo con las instrucciones del fabricante (Arrayit, Sunnyvale, CA 94089, EE.UU.). Para cada lisado y dilución (ajustado (2 mg /ml), 01:02, 01:04, 01:08, 01:16, tampón de extracción), 2 repeticiones se aplicaron sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de nitrocelulosa (Grace Bio-Labs, bend, Estados Unidos), que produjo 12 puntos de datos por muestra.
La inmunodetección se realizó similar a análisis de transferencia de Western y como se describe anteriormente [25]. Para la estimación de las cantidades de proteína total, las matrices se tiñeron en paralelo con Proteína Sypro Rubí Blot de la mancha (Molecular Probes, Eugene, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Otros detalles de la metodología RPPA, validación y reproducibilidad técnica se han descrito anteriormente [23], [25]. Todos los anticuerpos utilizados en este estudio fueron validados para la especificidad por Western blot.
Análisis estadístico
heterogeneidad intratumoral, así como la gama de la expresión de proteínas entre los diferentes pacientes (variación inter-paciente), y la variabilidad de la expresión de proteínas entre el epitelio de Falopio de individuos sanos se evaluaron utilizando el
coeficiente de variación gratis (CV). El CV, definida como la relación de la desviación estándar de la media multiplicado por 100, proporciona una medida relativa de la variación independiente de los valores absolutos, y por lo tanto permite la comparación de la variación de las proteínas con diferentes niveles de expresión absolutos.
heterogeneidad intratumoral se evaluó por separado para cada proteína mediante el cálculo de la CV de todas las muestras de tumor primario del mismo paciente. Como resumen estadístico, el (RMS) promedio de la raíz cuadrada de la media de los CV [26] se calculó para incluir los 13 pacientes para evaluar la heterogeneidad intratumoral general para una determinada proteína.
La variación entre los tumores de diferente pacientes se evaluó para cada proteína individual mediante el cálculo de la CV de los valores medios de expresión entre los diferentes pacientes. Los resultados se representan gráficamente mediante una caja de parcelas que muestran el valor medio de expresión, 25
º y 75
º cuartiles, y bigotes (1,5 veces el rango intercuartil) para cada paciente.
La prueba de Friedman era se utiliza para comparar los CV de diferentes proteínas y se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar la expresión de proteínas entre los grupos de muestras no relacionadas a un nivel de dos caras 5% de significancia. Todos los análisis estadísticos se realizaron con IBM Estadísticas (IBM Corporation, Versión 19.0).
Para comparar la expresión de proteínas entre los tejidos normales y tumorales y visualizar la variación entre muestras de pacientes individuales, el agrupamiento no supervisado jerárquica se realizó mediante el uso de Cluster y TreeView [27]. Después de la transformación de registro y el centrado de valores de la mediana, la media de la agrupación jerárquica se realizó para el cálculo de correlación de Spearman.
Resultados
Evaluación morfológica de muestras de tejido
Todas las muestras mostraron una celularidad tumoral de & gt; 10% de células inflamatorias; 70% y terc. No hubo diferencias significativas en el contenido de células epiteliales del tumor y el estroma tumoral o infiltrados de células inflamatorias entre las muestras del mismo paciente. Además, no se identificaron diferencias regionales en la actividad mitótica entre muestras del mismo paciente.
intratumoral La heterogeneidad de los niveles de proteína
Todas las 36 proteínas analizadas en este estudio mostró una considerable heterogeneidad intratumoral con un CV media de 25% (rango 17 a 53%) (Tabla 1 y la Tabla S2). El grado de heterogeneidad intratumoral fue diferente entre los 36 proteínas analizadas (p = 0,005), con p4EBP1, pp44 /42 MAPK y VEGF que muestra mayor variabilidad, y EGFR, JNK /SAPK y p38MPK que muestra menos variabilidad dentro de los tumores individuales. No hubo diferencia significativa en el grado de heterogeneidad intratumoral entre fosforilada (media CV 28%) y no fosforilados (media CV 23%) proteínas (p = 0,252). La heterogeneidad intratumoral de todas las proteínas se resume en la Tabla S2. La figura 2 ilustra la heterogeneidad intratumoral de las proteínas ejemplares de VEGF, VEGFR y EGFR p1068EGFR.
Los diagramas de caja muestran la mediana (línea dentro de la caja), percentiles 25 y 75, y los bigotes están mostrando 1,5 veces el rango intercuartil.
variación de los niveles de proteína entre los pacientes
la variación de la expresión de proteínas entre los diferentes pacientes fue similar a la extensión de la heterogeneidad intratumoral con un CV media de 21% (rango 12 48%). La variabilidad entre pacientes difería significativamente entre las proteínas analizadas. Mientras Hif1α, PDGF y PI3K demostraron baja variación entre todos los pacientes analizados, p4EBP1, pp44 /42 MAPK y p1068EGFR mostró una muy alta variabilidad entre pacientes. Variación entre diferentes pacientes no fue significativamente diferente para fosforilada (media CV 25%) y no fosforilados (media 18% CV) proteínas (p = 0,072). Tabla S2 resume la variación entre los diferentes pacientes para todas las proteínas. La figura 2 ilustra la variación entre los pacientes para las proteínas ejemplares VEGF, VEGFR, EGFR y p1068EGFR.
variación Inter-paciente de expresión de la proteína también se evaluó para epitelio seroso normal de las trompas de Falopio de individuos sanos y para morfológicamente normales contralateral tubos de pacientes con cáncer. La variabilidad entre pacientes del epitelio de las trompas de individuos sanos (media CV 27%, rango 14-47%) fue similar a la variación inter-individual de tubos contralateral de pacientes con cáncer (media CV 31%, rango 3-78%). En general, la variación de epitelio seroso normales entre diferentes individuos estaba en un rango similar en comparación con la variación entre los tumores de diferentes pacientes (21%). La variabilidad no fue diferente entre las proteínas fosforilados y no fosforilados en cualquier tipo de tejido de referencia. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
La variación entre muestras tumorales individuales evaluadas por la agrupación jerárquica
Para evaluar la variación entre muestras tumorales individuales que realizó la agrupación jerárquica no supervisada con las 88 muestras tumorales tomadas de forma individual 13 pacientes en base a la expresión de los 36 proteínas analizadas (Figura 3). Las muestras del mismo paciente en clúster más estrechamente en comparación con muestras de diferentes pacientes. Sin embargo, las muestras de cuatro pacientes (pacientes 3, 4, 6, 11), se dispersaron por todos los grupos, y para los pacientes restantes dos o más muestras por paciente no se agrupan con el resto. No había ningún paciente a la que todas las muestras agrupados juntos (Figura 3).
Diferentes pacientes están codificados por colores como se indica en la leyenda de la figura. Alta expresión relativa de las proteínas se muestra en la expresión rojo y bajo en color verde. espacios grises indican la falta de puntos de datos.
Importancia de la heterogeneidad de Distinción entre tumor frente al tejido normal
La agrupación de tumor frente al tejido normal.
Se evaluó la influencia de la heterogeneidad en la clasificación molecular de muestras de tejidos diferenciados como cancerosas o normales basados en la agrupación jerárquica. No hubo una clara separación de las muestras de tumor en comparación con el epitelio normal cuando serosa utilizando todas las muestras tumorales individuales por caso (datos no mostrados). En contraste, el análisis de la expresión de los valores medios de cada tumor resultó en muy buena separación de los tejidos normales y tumorales (Figura S1).
expresión diferencial de proteínas en el tumor en comparación con el tejido normal.
A continuación evaluó diferencias en la expresión de proteínas entre el cáncer de ovario seroso y el epitelio normal, ya sea tomando seleccionados al azar muestras individuales a cada caso o valores de expresión de proteínas significan. El análisis se repitió tres veces con tres diferentes muestras individuales seleccionados al azar por caso y los resultados se compararon con los obtenidos utilizando los valores de expresión por caja decir como patrón de referencia.
Dieciséis proteínas identificadas como diferencialmente expresado utilizando los valores de expresión de la media todas las muestras por tumor (AKT, pAKT, angiopoyetina 2, B-Raf, p1068EGFR, p1148EGFR, FAK, pGSK-3β, pGSK-3β, HIF-1α, JNK /SAPK, mTOR, pmTOR, p38 MAPK, pPRAS40, PRAS40, PTEN , pPDGFR, S6RP) no se detectaron cuando se analizan muestras individuales seleccionados al azar por caso. Diez proteínas, es decir, PB-Raf, EGFR, HER2, 4E-BP1, pPTEN, pVEGFR, VEGF, VEGFR, pS6RP, y BVS fueron identificados como diferencialmente expresado por los cuatro enfoques. PI3K y pHER2 fueron identificados como diferencialmente expresado sólo en muestras individuales. P-valores para todas las proteínas identificadas como diferencialmente expresado en por lo menos uno de los enfoques se resumen en la Tabla 2.
Discusión
Se encontró una considerable heterogeneidad intratumoral en la expresión de biomarcadores de proteínas relacionadas con vías de señalización celular en el carcinoma de ovario seroso de alto grado. Las 36 proteínas analizadas por matriz de proteína de fase inversa (RPPA) mostraron una marcada heterogeneidad en el cáncer de ovario primario con un coeficiente medio de variación (CV) de 25% (rango 17 a 53%) dentro de un tumor individual. Un grado similar de variación se encontró entre diferentes pacientes con un CV media de 21% (rango 12 a 48%). Nuestros resultados sugieren que el sesgo de muestreo significativo puede ser introducido en el análisis de muestras individuales de un tumor primario para la evaluación de biomarcadores de proteínas. A pesar de los 36 proteínas candidatas mostraron una considerable heterogeneidad intratumoral, el alcance general de la heterogeneidad fue diferente para las proteínas específicas con p4EBP1, pp44 /42 MAPK y VEGF mostrando mayor variabilidad y EGFR, JNK /SAPK y p38MPK que muestran menor variabilidad. No hubo diferencia en el grado de heterogeneidad entre las proteínas fosforilados y no fosforilados, lo que sugiere que las formas activadas de las proteínas de señalización celular pueden ser evaluados con una fiabilidad similar.
Un estudio previo en el cáncer de mama detectado un grado similar de intratumoral heterogeneidad en la expresión de proteínas (media CV 31%) [23]. Por el contrario, la variación de la expresión de proteínas entre los diferentes pacientes fue considerablemente más baja en el cáncer de ovario en comparación con el cáncer de mama (media CV 21% vs. 51%). Una posible explicación es un grupo de pacientes más homogéneos en nuestro estudio que contiene exclusivamente los carcinomas serosos de alto grado, que comparten una vía patogénica común y por lo tanto son genéticamente menos heterogénea que diferentes tipos de cánceres de mama [28]. El cáncer de mama estudio incluye diferentes subtipos morfológicos y moleculares, tales como receptores hormonales negativos cánceres de mama positivos, HER2 positivo y triples, que pueden haber representado una mayor variación en la expresión de proteínas entre los tumores de diferentes pacientes
.
La presencia de diferentes clones de células tumorales es una fuente potencial para la heterogeneidad intratumoral en la expresión de proteínas. Un estudio reciente demostró considerable heterogeneidad intratumoral clonal de cáncer de ovario basado en la auto-renovación y diferenciación tumorigénico de las células tumorales derivadas de una única carcinoma de células claras de ovario [29]. Otro estudio informó heterogeneidad intratumoral clonal y la variación entre los tumores primarios y metástasis de la pérdida de heterozigosidad de los cromosomas 17q y 18q en los carcinomas de ovario seroso avanzada [30]. Del mismo modo, la amplia heterogeneidad clonal se demostró recientemente para el carcinoma de células renales [31]. Un análisis exhaustivo de la clonalidad de las células tumorales se necesitarían datos de ADN, el ARN y los niveles de proteína, lo que fue más allá del alcance de este estudio integrado. Sin embargo, es menos probable que una sola explicación de las variaciones considerables en la expresión de las proteínas de señalización celular que se encuentran en nuestro estudio. carcinomas serosos de alto grado son caracterizados por su elevado proliferativa y la actividad mitótica [28]. A pesar de las diferencias en el crecimiento del tumor y la proliferación celular pueden tener algún grado contribuido a la heterogeneidad intratumoral, no se identificaron diferencias regionales en la proliferación de células tumorales basados en la evaluación morfológica de mitosis. Otra posible explicación para la heterogeneidad intratumoral es la composición celular de los cánceres de ovario seroso. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el contenido de las células tumorales del epitelio y el estroma del tumor o de células inflamatorias se infiltran entre las muestras de un mismo paciente.
Los estudios anteriores reportaron un menor grado de variación intratumoral de expresión de la proteína en el cáncer de ovario. Dos estudios realizados en la década de 1990 encontraron baja variación de la expresión de proteínas entre las diferentes áreas de 9 carcinomas primarios de ovario [32] o entre los sitios primarios y metastásicos de 12 tipos de cáncer epitelial de ovario [33] utilizando electroforesis en gel de 2 dimensiones e inmunohistoquímica, respectivamente. Sin embargo, el número de tumores en ambos estudios fue relativamente pequeño. Una reciente serie incluyendo 123 de alto grado de carcinomas de ovario seroso con tumores de ovario pareadas y metástasis omental expresión de diez proteínas evaluadas por inmunohistoquímica, incluyendo marcadores de subtipo de tumor, microambiente, y la adhesión celular [34]. Los autores demostraron que la mayoría de las proteínas, incluyendo marcadores de diagnóstico de uso común, tales como p53, WT1, CA125, y p16 no mostró diferencias significativas en la expresión entre el cáncer de ovario primario y la metástasis peritoneales o epiplón. Dos marcadores de la respuesta del tumor del estroma (PDGFRB, SPARC) mostraron expresión diferencial marcada entre ovárica primaria y muestras tumorales metastásicas [28]. Sin embargo, una comparación directa de nuestro estudio con los informes anteriores se ve limitada por la falta de criterios uniformes para la evaluación de la heterogeneidad y la falta de medidas estadísticas de variación intratumoral. Además, estudios anteriores han comparado a menudo los cánceres de ovario primario y lesiones metastásicas mientras que nuestro estudio se centró exclusivamente en la variación dentro de un mismo cáncer primario. Una posible explicación para el mayor grado de heterogeneidad intratumoral en la expresión de proteínas observada en este estudio puede ser el más amplio muestreo de los tumores primarios de ovario en 5-9 lugares diferentes, así como la mayor resolución cuantitativa de análisis RPPA.
a fin de evaluar la variación entre muestras tumorales individuales que realizó la agrupación jerárquica no supervisada. Aunque habíamos observado un grado similar de la heterogeneidad dentro de un tumor y entre tumores de diferentes pacientes sobre la base de coeficiente de variación, las muestras del mismo paciente en clúster más estrechamente en comparación con muestras de diferentes pacientes. Esto podría indicar que a pesar de un alto grado de heterogeneidad en los valores cuantitativos de expresión de proteínas, un enfoque basado en el ranking como la agrupación puede ser menos afectada. Del mismo modo, un análisis exhaustivo de las proteínas en una red de señalización, teniendo en cuenta la expresión relativa y la clasificación de proteínas individuales, podría estar menos afectada por la heterogeneidad.
La expresión de proteínas de señalización celular también se está utilizando como un biomarcador para el diagnóstico distinguir tumor del tejido normal asociado. No se encontraron diferencias significativas en la señalización celular expresión de la proteína entre el cáncer de ovario seroso y el epitelio normal. Sin embargo, cuando se combinaron los valores de expresión de varias muestras por tumor, se detectó una diferencia significativa en la expresión entre el cáncer y el epitelio normal para la mayoría de las proteínas. Esto pone de relieve la importancia del muestreo múltiple. Un enfoque práctico en estudios futuros puede ser poner en común múltiples muestras de diferentes regiones de un tumor individual antes del análisis.
En comparación, también se evaluó la variación fisiológica de la expresión de proteínas en el epitelio de las trompas serosa normal. Por razones técnicas y la disponibilidad limitada de muestras de tejido normal, no pudimos comparar diferentes muestras del mismo paciente. Entre el epitelio normal de serosa de diferentes pacientes se observó una variación similar (media CV 27-31%) en comparación con la variación entre los cánceres de ovario de diferentes pacientes (media de CV 21%).
Para descartar sesgo debido a la técnica variaciones que evaluaron previamente la reproducibilidad técnica de cuantificación de proteínas. Alta reproducibilidad de las mediciones de proteínas a partir de extracciones independientes y de los análisis RPPA independientes se demostró [23] y, por tanto, que no encontró ninguna razón para creer que la heterogeneidad en la expresión de la proteína detectada en este estudio fue atribuible a variaciones técnicas.
Las limitaciones de el estudio actual incluye el número de casos y muestras tumorales individuales (n = 88). Se analizó la heterogeneidad macroscópica, mientras que las diferencias a nivel celular no se evaluaron. Una fuerza importante es el grupo de pacientes altamente homogénea que comprende exclusivamente los cánceres de ovario seroso de alto grado conocidos para compartir vías patogénicas comunes, así como el amplio muestreo de los tumores en 5-9 áreas diferentes. Se analizaron diferentes regiones dentro de cada cáncer de ovario primario y no se puede comparar las lesiones primarias y metastásicas.
En conclusión, la heterogeneidad intratumoral puede llevar a un sesgo de muestreo, y la evaluación fiable de la señalización celular expresión de la proteína en el cáncer de ovario para la evaluación del pronóstico o biomarcadores predictivos deben incluir el muestreo del tumor primario en varios lugares diferentes.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Comparación de tumor frente a tejido normal por la agrupación jerárquica no supervisada de 13 tumores y 14 muestras de epitelio seroso normales, sobre la base de los valores de expresión de proteínas medias por tumor. Diferentes pacientes están codificados por colores como se indica en la leyenda de la figura. grupos principales identificados por el software se nombran los grupos A y B. Alta expresión relativa de las proteínas se muestran en rojo y expresión baja en color verde. espacios grises indican la falta de puntos de datos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s001 gratis (DOC)
Tabla S1.
Los anticuerpos y condiciones utilizadas para la detección de proteínas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
intratumoral heterogeneidad y la variación entre los pacientes para la expresión de 36 proteínas evaluada por matrices de fase inversa de proteína (CV: coeficiente de variación) guía doi:. 10.1371 /journal.pone.0077825.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
los autores desean agradecer a la Alianza Múnich Biobanco del cluster M4 y Claudia Wolff útil para los debates y las observaciones y Simone Keller para proporcionar anticuerpos JNK /SAPK.