Extracto
Además de los genes codificantes de proteínas, las las marcas del genoma humano una gran cantidad de ARN no codificante. ARN no codificantes largas (lncRNAs) se han descrito como el más grande subclase de la transcriptoma no codificante en ARN no codificantes humanos. En los últimos años, lncRNAs han sido considerados como los reguladores clave de comportamiento del tumor. En este estudio, basado en la investigación anterior, se determinó la expresión y la función biológica de una lncRNA relacionada con el cáncer recién identificado,
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.
1 |. Se analizó la relación entre el
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.
1 | y el cáncer colorrectal (CCR) en un total de 45 CRC y muestras de tejido adyacente, no tumorales pareadas. Hemos encontrado que
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1
expresión fue por lo general altamente expresado en el carcinoma en comparación con el tejido adyacente al carcinoma. A través de una serie de experimentos, los resultados mostraron que
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1 | regula CD44 como señuelo molecular para miR211-3p. Nuestros datos indican que la sobreexpresión de
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1 | proliferación celular mejorado en el CCR
Visto:.. Wu X, X Él, Li S, Xu X, Chen X, Zhu H (2016) ARN largo no codificante ucoo2kmd.1 regula el crecimiento celular CD44-dependiente al competir por el miR-211-3p en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 11 (3): e0151287. doi: 10.1371 /journal.pone.0151287
Editor: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: 10 Enero de 2016; Aceptado 25 de febrero de 2016; Publicado: 14 de marzo de 2016
Copyright: © 2016 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. el proyecto fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang de China (LY16H160048). Además, este trabajo fue apoyado por una beca del Proyecto de Tecnología (Y20140707) Wenzhou Bienestar Público y Ciencia, también fue apoyado por una beca de Incubación de Proyectos de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou (FHY2014009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es un importante problema de salud pública a nivel mundial y sigue siendo una de las principales causas de mortalidad por cáncer en el mundo desarrollado, en gran parte debido a su propensión a metástasis [1]. Es el segundo diagnóstico de cáncer más común entre las mujeres y el tercero más común entre los hombres [2]. A pesar de los logros en la investigación del cáncer colorrectal son notables aún son necesarias, nuevas y eficaces estrategias terapéuticas. La búsqueda de nuevos biomarcadores de la progresión metastásica en el cáncer colorrectal es urgente.
largos ARNs no codificantes (lncRNAs), que comprenden no codificante transcripciones de más de 200 nucleótidos, se han descrito como el más grande de la subclase transcriptoma no codificante en los seres humanos [3]. Una cantidad significativa de la investigación anterior se ha centrado en el papel regulador y estructural de lncRNAs en varios procesos biológicos importantes, tales como la inactivación del cromosoma, la diferenciación celular, la impronta genómica y el desarrollo y la proliferación celular [4, 5]. En los últimos años, con una amplia papel para lncRNA en el desarrollo de cáncer, un número creciente de estudios sobre su asociación con la ocurrencia de desarrollo del cáncer (por ejemplo, estudios sobre CRC [2, 6], carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) [7], y el cáncer gástrico (CG) [8]) han sido publicados. A pesar de estos hallazgos, nuestro conocimiento actual acerca de los patrones de expresión y el papel funcional de lncRNAs en el CCR sigue siendo limitada.
Recientemente, un estudio encontró una novela lncRNA en GC,
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1 |, también denominado
GAPLINC
. Este lncRNA forma un señuelo molecular para miR211-3p, que se dirige CD44 para la degradación, y la sobreexpresión de
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. Por lo tanto,
1 | podría mejorar la expresión de CD44 al competir por el miR-211- 3p, que se basa en un modelo para
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.
1 | migración celular mediada por la proliferación y en el cáncer gástrico [9, 10]. Como uno de los marcadores de células madre más putativos, CD44 juega un papel clave en muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento de células de cáncer y la migración [11]. Además, estudios previos han demostrado que CD44 es un marcador de células madre conocida por CRC [12].
Sobre la base de esta información, la hipótesis en este estudio que
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1 | podría desempeñar un papel similar en el CCR. Para probar esta hipótesis, hemos deducido una manera de delinear la aberración de la transcripción de la
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.
1 | entre CRC y pareadas tejidos adyacentes no neoplásicas.
materiales y Métodos
los sujetos del estudio
homogénea chinos Han comprendían los sujetos que participaron en este estudio. Cuarenta y cinco muestras de tejidos adyacentes y CRC correspondientes se obtuvieron de los pacientes en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou (Wenzhou). No hubo restricciones en la edad, etapa de CRC, el sexo o la histología. Tras su contratación, cada participante fue programado para una entrevista utilizando un cuestionario epidemiológico, después de proporcionar el consentimiento informado por escrito. El Comité de Ética Médica de la Universidad de Medicina de Wenzhou aprobó este estudio. Las características clínicas de todos los pacientes se enumeran en la Tabla 1, como se ha descrito en detalle previamente [13].
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW480, HCT116 y, eran comprado en el Banco de células de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china, Shanghai Instituto de Biología celular, y se hace pasar durante menos de 6 meses. Los procedimientos de cultivo celular se han publicado en otros lugares [13]. Las células se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2 en un medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina en una placa de cultivo de 10 ml.
extracción de RNA y real reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa tiempo
TRIzol
® se utilizó reactivo (Invitrogen) para aislar el ARN total de las células y tejidos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión génica relativa de
GAPLINC
se determinó utilizando el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
GAPDH
se utilizó como un control estándar interno, y todas las reacciones se realizaron por triplicado [14, 15]. Los cebadores utilizados para la amplificación por PCR cuantitativa incluyen la GTTTCCTGGAAGGGCATTTT hacia adelante y el CAATCAGGGCTCTTGGACTC inversa.
Construcción de plásmidos indicadores
El método para la construcción de plásmidos indicadores ha sido publicado en otra parte [9]. El vector del promotor pGL3 (GENECHEM) se utilizó para construir los plásmidos pGL3-
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.
1 | -3'UTR (el plásmido que contienen
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1 | 3'UTR) y pGL3- CD44-3'UTR. Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciación del ADN.
transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
HCT116 y SW480 se transfectaron con los plásmidos indicadores utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.), de acuerdo con el fabricante de instrucciones. El uso del sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.) para medir la actividad luciferasa ha sido publicado en otra parte [16]. Tres experimentos independientes se llevaron a cabo y cada grupo incluyen 6 repeticiones.
actinomicina D ensayo
HCT116 y SW480 fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se co-transfectaron con miR-211-3p, como se indica, durante 24 h; las células fueron expuestas a la actinomicina D (Sigma, St Louis, MO). Se recogieron las células y la estabilidad de la
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.
1
ARNm se analizaron mediante PCR de transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR), como se describe anteriormente [13].
blot
Western blot Western se llevó a cabo para evaluar la expresión de CD44 y â-acción, como se describe anteriormente [13]. El análisis de transferencia Western se repitió al menos tres veces.
viabilidad de las células de ensayo
Se utilizó el sistema Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratorio, Kumamoto, Japón) Recuento celular para medir la viabilidad celular, de acuerdo con las instrucciones del fabricante [16]. Había 6 repeticiones para cada grupo, y los experimentos se repitieron al menos 3 veces.
análisis estadísticos
La correlación entre la expresión de
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.
1 | y el
CD44
gen en el tejido CRC se evaluó mediante análisis unidireccional de modelos de regresión lineal y la varianza. Las diferencias entre los grupos se evaluaron utilizando la prueba t pareada, 2 colas de Student. Un
P
-valor de & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
caracterización celular de
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1
Para determinar la localización celular de
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.
1 |, los niveles de control de la transcripción nuclear (
U6
) y citoplasmática trascripción de control (
GAPDH
ARNm) fueron detectados por RT-qPCR en las fracciones nucleares y citoplasmáticas, respectivamente. Para la línea celular HCT116, QRT-PCR análisis reveló que (media ± SEM) 89,8%
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1 | se detectó en la fracción nuclear, y el 13,1% se encuentra en el fracción citoplásmica. Se obtuvieron resultados similares con la línea celular SW480, en concreto, el 89,2% y el 11,8%
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1 | se detectó en la fracción nuclear y las fracciones citoplasmáticas, respectivamente (figura 1A) .
(A) los niveles de transcripción nuclear de control (U6), control de la transcripción citoplasmática (GAPDH ARNm) y
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1 | fueron evaluados por QRT PCR en fracciones nucleares y citoplasmáticas. Los datos son la media ± SEM. (B) Análisis de transferencia de Northern de
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.
1 | expresión en células de CRC. (C) las puntuaciones máximas en LCR de
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.
1 | por análisis con PhyloCSF. La puntuación es -178.6075. (D) El
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1 | se expresó en un nivel superior en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos adyacentes coincida con CRC. El nivel de expresión de
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1 | se analizó mediante qRT-PCR normalizada a
GAPDH
. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes. (E) Las correlaciones lineales entre el
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.
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los niveles de expresión de ARNm de CD44 y se pusieron a prueba. El valor relativo de expresión se normalizó por
GAPDH
nivel de expresión. (F, G)
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1 | expresión afectada significativamente la expresión de CD44 mRNA. Desmontables de
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.
1 | disminución de la expresión de CD44, mientras que la expresión ectópica de GAPLINC aumentó el nivel de ARNm de CD44. (H) Los niveles de proteína de CD44 fue evaluada en células CRC (células HCT116 y SW480) por Western blot.
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1 | podría ser detectada como una transcripción del tamaño esperado por el norte de secante (figura 1B) en las células de CRC. Al mismo tiempo, se analizó el potencial de codificación de
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1 | usando PhyloCSF, la puntuación es PhyloSCF -178.6075, este resultado mostró el potencial bajo de la codificación de
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.
1 | (figura 1C).
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1 | está regulado en los tejidos CRC
El nivel de expresión de
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.
1 | se examinó el uso de PCR en tiempo real en 45 pares de tejidos CRC y el tejido normal adyacente emparejado. características clínicas detalladas se presentan en la Tabla 1. El
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.
1 | transcripciones se expresaron en niveles más altos en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal adyacente (Figura 1D).
Asociación de
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1 | y
Hoteles en CD44 CRC
Hemos probado la correlación entre los
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.
1 | y
CD44 Hoteles en otros 15 pares de CRC adyuvantes tejidos no cancerosos. Los resultados mostraron que los pacientes con mayor
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.
1 | niveles de expresión en el tejido CRC muestran sustancial sobre regulación de CD44 (
R
2
= 0,24,
P Hotel & lt; 0,05; Fig. 1E)
El uso de siRNAs específicos, desmontables de
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1
disminuido sustancialmente la expresión de CD44, mientras que la sobreexpresión de
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.
1 | mejorado los niveles de CD44 mRNA (Fig 1F y 1G). Western Blot resultados mostraron consistentemente que desmontables de
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.
1 | disminuyó los niveles de proteína CD44 en la línea celular HCT116, mientras que la sobreexpresión de lncRNA-uc002kmd.1 aumentó los niveles de proteína CD44. Resultados similares se encontraron en la línea celular SW480 (Fig 1H).
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.
1
regula
CD44 expresión
al competir por el miR -211-3p objetivo
Coincidentemente, el miARN conocido como miR-211-3p fue el previsto para ambos
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.
1 Opiniones y CD44. Para verificar el papel de miR-211-3p en las células de CRC, hemos clonado el 3 'UTR de CD44 y
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.
1
aguas abajo de un gen de la luciferasa y co-transfectaron estos reporteros con imita el miR-211-3p en las células CRC. Como se muestra en la figura 2A, miR-211-3p disminuyó significativamente las señales de luciferasa de los dos reporteros. Por otra parte, se midió el CD44 y
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.
1
niveles en las células CRC después de tratar con los imitadores de miR-211-3p. Como era de esperar, el CD44 y
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.
1
niveles disminuyeron significativamente (Figura 2B). Además de esto, ponemos a prueba el nivel de expresión de CD44 y miR-211-3p en 15 pares de tejidos de CRC, los resultados demuestran una correlación negativa entre miR211-3p y los niveles de expresión de CD44 (
R
2
= 0,24,
P Hotel & lt; 0,05;. La Fig. 2C)
(A) Tanto
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1 Opiniones y CD44 son el blanco de miR-211-3p. MIR-211-3p disminuyó significativamente las señales de luciferasa de ambos
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.
1 Opiniones y CD44. (B) El CD44 y
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.
1
niveles disminuyeron significativamente. Los datos son la media ± SEM, normalizado a
GAPDH
. (C) Las correlaciones negativas entre el
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.
1 | niveles de expresión de ARNm de CD44 y se pusieron a prueba.
Después de la caída
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.
1 fotos: por siRNA, hemos clonado la región 3'UTR de CD44 en un indicador de luciferasa y co-transfectadas con el constructo
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.
1
siRNA o el control de siRNA. Los resultados mostraron que después de la caída
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.
1 | redujo significativamente la intensidad de la luciferasa. Todos estos resultados sugieren que el miR-211-3p podría apuntar a
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.
1 Opiniones y CD44 y que
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.
1 | se requiere para la expresión abundante de CD44 (figura 3A).
(a) el vector reportero fue co-transfectadas a las células de CRC, que fueron tratados por
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.
1 | siRNA o controlar siRNA. La señal de luciferasa se redujo significativamente. (B) Las células se recogieron y la estabilidad de
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1
mRNA se analizó mediante qRT-PCR con respecto al tiempo 0 después de bloquear nueva síntesis de ARN con actinomicina D.; los datos son la media ± SEM, normalizado a
GAPDH
. células HCT116 y SW480 (C) se sembraron en placas de 96 pocillos después sido transfectadas, y la proliferación celular se llevó a cabo diariamente durante 3 días usando el ensayo de CCK-8. Seis réplicas para cada grupo y el experimento repetido tres veces. Datos aremean ± SEM. *
P
& lt; 0,05 en comparación con los controles. (D) Los datos mostraron volúmenes de los tumores de xenoinjertos en cada grupo de 4 semanas después implantaron subcutáneamente células CRC estables. La media de los volúmenes tumorales de seis ratones desnudos de cada grupo se muestran en diferentes puntos temporales. *
P Hotel & lt;.. 0,05 en comparación con los controles
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1 | modula el crecimiento celular
además, investigó el efecto de
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.
1 | sobre la proliferación celular en
in vitro
. CRC células fueron transfectadas con imita el miR-211-3p o con un inhibidor de miR-211-3p, y los niveles de transcripción de la
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las reguladas después de la síntesis de ARN fue bloqueada con actinomicina D en el presencia de miR-211-3p (reguladas por debajo de 100% a 54% ± 3,2% en presencia de 1 pmol de miR-211-3p, y el regulado de 100% a 28% ± 3,2% en la presencia de 40 pmol miR-211-3p).
Se realizó CCK-8 ensayos para probar los efectos de
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1 | sobre la proliferación celular en las células de CRC. Se observó un incremento consistente en la proliferación de células de la HCT116 (aumento del 38%) y SW480 (31% de aumento) líneas celulares cuando
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1 | se sobreexpresa en niveles fisiológicos a través de CCK ensayos -8, en comparación con el control. Mientras que
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1 | las reguladas las células, la proliferación de la HCT116 (disminución del 50%) y SW480 líneas celulares (27% de disminución) se redujo constantemente (Figura 3C) .
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.
1 | acelerar el crecimiento del tumor en xenoinjerto
Para examinar la importancia biológica de
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.
1
sobre el crecimiento tumoral, xenoinjerto se inyectaron por vía subcutánea con células de CRC. Como se muestra en la figura 3D, el crecimiento de los tumores de hasta reguladas
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1 | xenoinjertos fue significativamente mayor en comparación con la de los xenoinjertos de control:. 423,3 ± 71,6 mm
3 frente a 600 ± 17,6 mm
3 para las células HCT116 (
P Hotel & lt; 0,05); y 420 ± 70,8 mm
3 frente a 616,7 ± 21,7 mm
3 para las células SW480 (
P Hotel & lt; 0,05)., respectivamente
Discusión
este estudio, se identificó el
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.
1 | en el CCR y se encontró que era dramáticamente hasta reguladas en el tejido CRC utilizando el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, lo que indica la función potencial de
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.
1 | en el CCR. Una serie de experimentos han demostrado la correlación entre los
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.
1 |, miR-211-3p y CD44, que concluye que
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1 | regula el crecimiento celular dependiente de CD44 al competir por el miR-211-3p en el cáncer colorrectal. Nuestros hallazgos indican el importante papel de
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.
1 | CRC durante la tumorigénesis.
lncRNAs están surgiendo como actores clave en diversos procesos biológicos fundamentales y una cantidad cada vez mayor de la investigación ha propuesto que lncRNAs son actores importantes en el desarrollo del cáncer [17-19]. El lncRNA más conocida, de aire caliente, es hasta reguladas en el cáncer de la vesícula biliar (GBC) que conduce a la metástasis tumorales a través de la metilación alterada de lisina de la histona H3 27 (H3K27) y la expresión de genes [20, 21].
Linc-POU3F3
se incrementa en muestras CECA, que, a través de las interacciones con los
EZH2
para promover la mutilación de los
POU3F3
, a continuación, promover el desarrollo de tumores [22]. Aparte de estas anotado-lncRNA, no anotada lncRNA ha estado teniendo el efecto deseado en el desarrollo de muchos tumores malignos, tales como lncRNA asociada a cáncer colorrectal (CCAL) promover CRC progresión por la vía activada Wnt /β-catenina [23] . Un informe reciente encontró que
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1 |, también conocido como GAPLINC, fue hasta reguladas en GC y también se muestra efectos predictivos considerables en el diagnóstico y pronóstico del cáncer gástrico, mientras , en nuestro estudio,
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.
1 | también estuvo implicado en la promoción del desarrollo de CCR.
a continuación, se investigó los mecanismos por los que
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1 | ejerce su función en fenotipos malignos CRC. Nuestros resultados muestran claramente que cuando el silenciamiento
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1 | expresión, la proliferación celular se inhibió CRC. Nuestros datos también afirmó que
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1 | forma un señuelo molecular para miR211-3p. Es de conocimiento común que los miRNAs son secuencias cortas de ARN, aunque las secuencias diana de ARNm de 3'UTRs entonces manipulan negativamente la expresión génica. MiRNAs están implicados en diversos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, el desarrollo, la diferenciación y el metabolismo. En general, los miRNAs juegan un papel fundamental en la regulación génica, principalmente por dirigir genes codificadores de proteínas abundantes. Cada vez más, sin embargo, más investigación ha encontrado que los miRNAs también puede realizar su función de orientación por lncRNAs [24]. La teoría de la ARN endógeno competitivo mostró que codifican genes y lncRNAs pueden regular entre sí a través de su competencia por miRNA de unión [25]. De acuerdo con esta teoría, lncRNAs puede ejercer su influencia sobre los objetivos, al servir como señuelos para miRNAs.
En el presente trabajo, hemos identificado la proteína CD44 como una parte importante de la
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.
1 | - red de regulación de los genes miARN. Usando el ensayo indicador de luciferasa, se encontró que CD44 es reprimida por el miR-211-3p, y esta función es atenuada por
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1 | sobreexpresión. También se encontró que el nivel de proteína CD44 aumentó gradualmente con el aumento de los niveles de
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.
1 |.
CD44 es una glicoproteína transmembrana de la superficie celular que desempeña un importante papel en un número de funciones biológicas [26]. Estudios anteriores han demostrado que CD44 desempeña un papel crítico en el desarrollo de AML y las variaciones de CD44 podría afectar a su expresión, dando lugar a diferentes riesgos de AML [15]. Además, CD44 es un marcador de células madre importante para tumores sólidos múltiples, lo que conduce al desarrollo y progresión del cáncer [27]. CD44 podría ser utilizada como un nuevo marcador para las características y la gestión de muchos tumores tales como GC [28] o CRC [11]. Recientemente, muchos estudios han demostrado una correlación significativa entre el nivel de
CD44
tumorigenicidad expresión y el cáncer de mama, lo que pone de relieve la importancia del papel de
CD44
en la progresión tumoral y la metástasis [11, 29, 30 ]. En nuestro estudio, hemos demostrado que miR211-3p une a la región 3'UTR del CD44, CD44 orientación para la degradación. A través del señuelo miR211-3p, el
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1 | aumenta la expresión de CD44.
En conjunto, nuestros resultados indican que
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.
1 | puede mejorar la expresión de CD44 al competir por el miR-211-3p, posteriormente mediar la migración celular y la proliferación en el CCR.
Reconocimientos
El proyecto fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang de China (LY16H160048). Además, este trabajo fue apoyado por una beca del Proyecto de Tecnología (Y20140707) Wenzhou Bienestar Público y Ciencia, también fue apoyada por una beca de Incubación de Proyectos de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou (FHY2014009).