Extracto
necrosis tumoral apoptosis relacionada con el factor de inducción de ligando (TRAIL) induce la apoptosis en una variedad de líneas celulares de cáncer con poco o ningún efecto sobre las células normales. Sin embargo, su efecto es limitado, ya que algunos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas muestran la resistencia de novo a la apoptosis inducida por TRAIL. En este estudio nos informan de que la inhibición de GSK-3 utilizando el agente farmacológico AR-18, la sensibilidad TRAIL mejorada en una gama de líneas celulares de cáncer de páncreas y próstata. Esta sensibilización se encontró que era dependiente de caspasa, y ambos farmacológica y genética de derribo de GSK-3 isoformas resultó en características apoptóticas como se muestra por la escisión de PARP y la caspasa-3. Los niveles elevados de intermediarios reactivos del oxígeno y una perturbación del potencial de membrana mitocondrial punto a un bucle de amplificación mitocondrial de la apoptosis inducida por TRAIL después de la inhibición de GSK-3. En consonancia con esto, la sobreexpresión de objetivos mitocondriales anti-apoptóticas tales como Bcl-XL, MCL-1 y Bcl-2 rescatado PANC-1 y PPC-1 células de sensibilización TRAIL. Sin embargo, la sobreexpresión del inhibidor de caspasa-8 CrmA también inhibió los efectos sensibilizadores de inhibidor de GSK-3, lo que sugiere una función adicional para GSK-3 que inhibe la señalización del receptor de muerte. El tratamiento agudo de ratones portadores de xenoinjertos de PANC-1 con una combinación de AR-18 y TRAIL también resultó en un aumento significativo en la apoptosis, tal como se mide por la caspasa-3 de escisión. La sensibilización a TRAIL produjo a pesar de un aumento de la β-catenina debido a la inhibición de GSK-3, lo que sugiere que el enfoque podría ser eficaz incluso en los cánceres con desregulado β-catenina. Estos resultados sugieren que los inhibidores de GSK-3 podrían combinarse eficazmente con TRAIL para el tratamiento de cáncer de páncreas
Visto:. Mamaghani S, Simpson CD, Cao PM, Cheung M, Chow S, Bandarchi B, et al. (2012) glucógeno sintasa quinasa-3 células del cáncer pancreático La inhibición sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL. PLoS ONE 7 (7): e41102. doi: 10.1371 /journal.pone.0041102
Editor: Shawn B. Bratton, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: December 2, 2011; Aceptado: 21 de junio de 2012; Publicado: July 19, 2012
Derechos de Autor © 2012 Mamaghani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por el Instituto de la Familia Campbell para la Investigación del cáncer. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Recombinante humana Apo2L /TRAIL fue un regalo de Genentech, South San Francisco, CA. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La ruta de apoptosis extrínseca se inicia con la unión de ligandos de receptores de muerte como ligando de Fas, tumor factor de necrosis α (TNF-α) y de necrosis tumoral apoptosis relacionada con el factor de inducción de ligando (TRAIL) para receptores de muerte, la activación de una serie de señales que pueden conducir a dos modos separados, pero relacionados entre sí, de la inducción de apoptosis. En algunos casos, la activación de la muerte receptor-4 (DR-4) y la muerte del receptor de 5 (DR-5) conduce al reclutamiento de proteínas adaptadoras para formar la activación induce a la muerte complejo de señalización (DISC), y posterior del iniciador caspasas-8 o -10 es suficiente para activar las caspasas efectoras-3, -6, y -7, y los resultados de la apoptosis [1]. Sin embargo, la unión de TRAIL a DR-4 o DR-5 y la activación de las caspasas-8 o -10 es frecuentemente insuficiente para inducir la apoptosis, y requiere la liberación de mediadores mitocondriales tales como el citocromo C para amplificar la señal de muerte inducir [2]. Esta diafonía entre extrínsecos e intrínsecos vías de la apoptosis requiere de la caspasa-8 mediada por la división del miembro de la familia Bcl-2 de la subasta [2], [3]. Truncado Oferta (tBid) actúa como un mecanismo de bloqueo para inhibir la acción de anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas tales como Bcl-2, MCL-1 y Bcl-XL, que conduce a la muerte celular mitocondrias inducida por [3].
TRAIL también se puede unir dos conjuntos de receptores señuelo no funcionales, en cuyo caso, la inducción de la apoptosis se bloquea [1]. El equilibrio entre la muerte receptores y receptores señuelo inducir es un determinante importante de la inducción de apoptosis en las células diana [4]. En contraste con el TNF-α y Fas, TRAIL parece mostrar una mayor especificidad hacia la inducción de la apoptosis en células tumorales
in vivo
, con el consiguiente menor toxicidad para el huésped [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Aunque el mecanismo exacto de la diana especificidad por TRAIL no se conoce, la falta de toxicidad en las células normales se atribuye en parte a la menor expresión de receptores de muerte (DR-4 y DR-5) y el aumento de la expresión de receptores señuelo en la superficie de las células normales [4], [7]. Por el contrario, una variedad de tipos de cáncer muestran una mayor expresión de DR-4 y -5 receptores, haciéndolos susceptibles a la apoptosis inducida TRAIL [3]. Mientras que el efecto tumoricida de TRAIL es prometedor, que tiene efectos limitados y muchos tumores son resistentes a TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].
El trabajo previo de nuestra laboratorio y otros sugieren que NF-kappa B está regulada positivamente por la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) y está implicada en la quimio-resistencia, la supervivencia de células de cáncer, el crecimiento y metástasis [12], [13], [14]. GSK-3 inducida por la inhibición efectos anti-supervivencia en células de cáncer pancreático, asociados con la regulación a la baja de la actividad de NF-kappa B y la expresión de genes diana anti-apoptóticas tales como XIAP, Bcl-XL, y la ciclina D1 [14] reducidos.
GSK-3 también puede proteger las células de citotoxicidad de TNF-α mediada, lo que indica que la GSK-3 tiene un papel en el bloqueo del receptor de muerte mediada por apoptosis [15], [16], [17]. Curiosamente, los efectos inhibidores de GSK-3 se han extendido a otros receptores de muerte tales como TRAIL y Fas [18], [19]. La inhibición de la GSK-3 ha demostrado potenciar la apoptosis inducida por TRAIL en hepatoma y de próstata líneas celulares de cáncer humano [10], [20]. En el curso de experimentos descritos en nuestro trabajo anterior, se observó que la inhibición de GSK-3 bloquea la activación de NF-kappa B por TNF-α [14]. Desde la activación de NF-kB se ha sugerido anteriormente para suprimir la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de páncreas [21], este hallazgo sugiere la posibilidad de que la inhibición de GSK-3 para sensibilizar cáncer de páncreas a TRAIL. En este informe, hemos probado si la inhibición de la GSK-3 tuvo un efecto sensibilizante sobre la apoptosis inducida por TRAIL ambos
in vitro utilizando
de páncreas y líneas celulares de cáncer de próstata y
in vivo usando
PANC-1 xenoinjertos .
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
líneas celulares de adenocarcinoma pancreático PANC-1 y BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) se mantuvieron como se ha descrito anteriormente [ ,,,0],14]. -1 PPC líneas celulares de cáncer de próstata se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10% de FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, a 37 ° C y 5% de CO2 en aire.
recombinante humana Apo2L /TRAIL fue un regalo de Genentech, South San Francisco, CA. El inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK era de Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, PA.
Las transfecciones estables
Para los estudios de sobreexpresión, pcDNA3.1-myc construcciones que contienen contra marcadores -apoptotic: Bcl-2, Bcl-XL, CRMA, y MCL-1 que contengan pcDNA3.1-Su construcción se utilizaron etiqueta (Sidnet, Toronto, Canadá)
células PANC-1 y PPC-1. fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 0,95 g /pocillo de ADN. Los transfectantes se seleccionaron con G418 durante 14 días para generar clones estables como se describe anteriormente [22]. La funcionalidad de las proteínas expresadas se confirmó mediante el ensayo de inducción de la apoptosis estaurosporina [23].
Ensayo de proliferación celular
El efecto dependiente de la dosis de AR-A014418 (AR-18) (sintetizado de encargo, Toronto Investigación Chemicals Inc., North York, Ontario, Canadá), TRAIL (rh-TRAIL, R & amp; D Systems, Inc., Minneapolis, MN) y su combinación en PANC-1, BxPC-3 y células PPC-1 y su variantes modificadas genéticamente se evaluó por el sulforodamina B (SRB) colorante (Invitrogen, Carlsbad, CA) ensayo de unión tal como se describe anteriormente [14] por triplicado y se repitieron seis veces.
Flujo Análisis de citometría de apoptosis
medición combinada de potencial mitocondrial membrana, generación de intermedios de oxígeno reactivo (ROI), y la integridad de la membrana externa mediante citometría de flujo se describe como anteriormente [24]. células PPC-1 PANC-1, BxPC-3, y se trataron con AR-18 (25 M) durante 24 h seguido de TRAIL (10 ng /ml) durante 24 h, con un solo agente o los controles no tratados. Las células se tiñeron con (40 nM) DiIC1 (5) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y diacetato de dichlorodihydrofluorescin (H2-DCFDA) (5 mM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), y yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 mg /mL
Desmontables genética de GSK-3.
GSK-3 isoformas fueron eliminados genéticamente en células Panc-1 transfectadas con siRNA contra GSK-3 α y ß isoformas utilizando una inversa protocolo de transfección como se describe anteriormente [14].
el cáncer pancreático modelo de xenoinjerto
los experimentos se realizaron de acuerdo a las regulaciones del Consejo canadiense de Cuidado de animales y directrices institucionales para el bienestar de los animales. PANC-1 se establecieron xenoinjertos por vía subcutánea en los flancos de ratones de 6 semanas de edad, macho inmunodeficiencia combinada severa (SCID), y se dejaron crecer a aproximadamente 10 mm en el diámetro más grande. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula: longitud x anchura
2 × 0,5 [25]. Los ratones se asignaron aleatoriamente a 4 grupos (n = 5) para recibir AR-18 20 mg /kg (5 mg /ml en DMSO) dos veces al día durante dos días, seguido de un período de reposo 24 h antes de i.p. la inyección de TRAIL 25 mg /kg, o grupos de agentes o de control de vehículos individuales. Los animales se pesaron y evaluaron los signos de toxicidad al día, y se sacrificaron en el día 5. Los tumores fueron extirpados, piezas congelaron rápidamente, fijadas con formalina o lisadas como se describe a continuación.
inmunotransferencia
procedimiento de Western blot fue realizado como se describe anteriormente [14] utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra la caspasa-3 escindido, β-catenina, PARP escindida, Bcl-2, Bcl-XL, (Signaling Technology, Danvers, MA de la célula), y anticuerpo monoclonal de ratón contra GSK-3 α /β (Biosource Inc., Camarillo, Canadá).
La inmunohistoquímica y la captura de la imagen
Los tejidos de hígado, los riñones y el tumor se fijaron con formalina, embebido en parafina, y se procesó como 4 micras secciones. Las secciones seriadas se immunostained utilizando H & amp; E y troceados caspasa-3 como se describe anteriormente [26] y se visualizaron bajo un microscopio Olympus BX41 utilizando 4X y 40X lentes del objetivo
La cuantificación de exfoliados caspasa-3
Los portaobjetos se tiñeron para exfoliados caspasa-3 se analizaron en una forma ciega para obtener una visa H-score. La intensidad de la tinción de cada muestra se evaluó con respecto a la intensidad de una corredera de control de ratones que recibieron tratamiento con vehículo. Una puntuación de 1+ indica tinción débil en relación con el fondo, 2+ = tinción moderada, y 3 + = fuerte tinción. intensidad de la tinción se informó en el más alto nivel de intensidad observada en todos los elementos del tejido. Para la comparación de la tinción entre los tejidos, los resultados se cuantificaron mediante el cálculo de un H-score completo que considera tanto intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas en un rango específico de intensidades. A H-score total se calcula multiplicando la intensidad en el porcentaje de células teñidas positivamente (H = P × I) tal como se describe anteriormente [26].
Análisis estadístico
Para investigar la posible sinérgico efecto de la combinación AR18 con TRAIL, la interacción entre los dos tratamientos con fármacos se probó por su montaje en un modelo que considera el hecho de que algunos experimentos no se llevaron a cabo al mismo tiempo. Los valores de densidad óptica (por SRB) fueron log transformado para estabilizar la varianza de los residuos. Los valores resultantes se analizaron mediante la comparación entre las diferentes concentraciones de cada fármaco usando modelos de regresión lineal. Una interacción de drogas se consideró sinérgico cuando el efecto de la combinación de fármacos fue significativamente mayor que la suma de los efectos de ambos medicamentos, y sub-aditivo cuando era menos que eso. Los efectos del tratamiento se compararon mediante la prueba t de Student y se consideraron diferencias entre las medias de ser significativa cuando P £ 0,05. El análisis se realizó con la ayuda de software "R" como se ha descrito anteriormente [14]. Los resultados se expresaron como media ± SE.
El análisis estadístico de los H-resultados completos se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas con datos no apareados de igualdad de varianza. La significación estadística se consideró que el valor p =. & lt; 0,05
Resultados
La inhibición de GSK-3 sensibiliza TRAIL células resistentes a la apoptosis del cáncer pancreático
El tratamiento de la PANC-1 y BxPC-3 células con AR-18 (25 y 50 mM) o DMSO durante 24 h, seguido de la adición de TRAIL (5, 10, 20, 40 ng /ml) durante 24 h reveló que el tratamiento con ambos conductores drogas a la inhibición del crecimiento dependiente de la concentración a lo determinado por el ensayo de SRB, aunque las células PANC-1 eran relativamente resistentes a TRAIL (Figura 1). Sustancialmente mayor toxicidad se observó en ambas líneas celulares tras la combinación de los dos agentes, y este efecto es altamente sinérgico cuando se analizó como se describe anteriormente [14] (por BxPC-3, p = 0,0002 mediante la combinación de 40 ng /ml de TRAIL y 50 M AR-18 y p & lt; 0,005 para todos los esquemas de dosis restante; para PANC-1, p & lt; 0,005 para todos los esquemas de dosis, excepto para 25 M AR-18 combinado con 5 y 10 ng /ml de TRAIL que no fue significativa) (Figura 1 y en la Tabla S1). El efecto fue más evidente después de pre-tratamiento con 50 mM AR-18, lo que sugiere que el efecto sinérgico depende de la extensión de la inhibición de GSK-3 en lugar de la concentración de TRAIL.
PANC-1 (A) y BxPC- 3 (B) fueron tratados con TRAIL después de 24 h antes de la exposición a AR-18 a las concentraciones indicadas, y la proliferación celular medida mediante ensayo SRB. Cada uno significa gráfico de barras significan partir de tres experimentos independientes con seis repeticiones. barras de error = ± SEM.
El análisis por inmunotransferencia de la escisión de PARP en los lisados celulares extraídos de PANC-1 y las células tratadas con 25 mM AR-18, 10 ng /ml de TRAIL, o la combinación 3 BxPC- mostró que mientras que no hubo escisión PARP detectable usando AR-18 solo, el tratamiento combinado con TRAIL mejora de forma significativa la escisión de PARP en ambas líneas celulares. En consonancia con los efectos observados mediante ensayo con SRB, BxPC-3 células mostraron sensibilidad a TRAIL basada en la escisión de PARP, mientras que las células PANC-1 fueron resistentes.
Para probar si la sensibilización TRAIL de células de cáncer pancreático por GSK-3 inhibición es dependiente de caspasa, PANC-1 y BxPC-3 células fueron tratadas con 25 mM AR-18 y /o 10 ng /ml de TRAIL en presencia del inhibidor de caspasa z-VAD-fmk general. Como se muestra en la figura 2B, aunque sí z-VAD produce algunos efectos tóxicos, sin embargo, rescató significativamente tanto las líneas celulares de la combinación AR-18 además de TRAIL. Por otra parte, TRAIL tuvo un efecto dependiente de caspasas en células PANC-1 no BxPC-3, pero, en consonancia con su mayor sensibilidad a TRAIL se muestra mediante ensayo con SRB. Como se ve en la Figura 2B, rescate parcial de AR-18 se produjo con z-VAD-fmk, lo que sugiere que los efectos inhibidores de la inhibición de GSK3 son, en cierta medida, dependiente de caspasa. Estos datos indican que la sensibilización TRAIL por GSK-3 inhibición implica la activación de la caspasa
.
células (A) BxPC-3 y Panc-1 se trataron con AR-18, en combinación con o sin TRAIL para 24 h y analizada por la escisión de PARP. (B) BxPC-3 (izquierda) y PANC-1 (derecha), las células fueron tratadas con AR-18 (25 uM), TRAIL (10 ng /ml), z-VAD-FMK 50 mM, o las combinaciones indicadas y SRB ensayo después de 22 h de incubación. Cada uno significa gráfico de barras significan partir de tres experimentos con seis repeticiones. barras de error = ± SEM. * P & lt; 0,005, ** p & lt;.
0,0001
Efectos de derribo genética de GSK-3 en TRAIL sensibilización de las células del cáncer pancreático
Para probar si el efecto sensibilizante de TRAIL AR-18 era debido a la inhibición de GSK-3, y para poner a prueba para la redundancia funcional en los GSK-3 isoformas, se examinaron a continuación los niveles de expresión de PARP escindida y se escindió de la caspasa-3 en los lisados celulares a partir de células Panc-1 transfectadas de forma transitoria con siRNA dirigido contra GSK-3α, β, o ambos, en presencia o ausencia de 10 ng /ml de TRAIL. Las células transfectadas con siRNA codificado o que no recibieron tratamiento se utilizaron como controles negativos, mientras que las células tratadas con AR-18 solo o en combinación con TRAIL se consideró el control positivo. La inmunotransferencia mostró & gt; 80% de reducción de la proteína total de cada isoforma (Figura 3) en respuesta a 3 días de incubación con siRNAs contra GSK-3 isoformas si se compara con las células tratadas no tratados o revueltos. El tratamiento con TRAIL (10 ng /ml) solo tuvo un efecto menor sobre la apoptosis medida por PARP o la caspasa-3 de escisión, mientras que caída transitoria de isoformas ß GSK-3 α o solo no tuvo efectos significativos. La combinación de TRAIL con la caída genética GSK-3β, por el contrario, ha mejorado sustancialmente la PARP y caspasa-3 división, en comparación con los tratamientos no tratados, individuales, o revueltos siRNA. knockdown GSK-3α en combinación con TRAIL inducida efectos menores sobre PARP y la caspasa-3 escisión, pero caída simultánea con GSK-3 tuvo un efecto significativo que era comparable a la de AR-18 (Figura 3). Estos resultados apoyan la idea de que la inhibición de GSK-3 es responsable de la TRAIL efectos de la AR-18 sensibilizante, y sugieren además que la GSK-3β juega un papel más prominente. Sin embargo, el papel de GSK-3α es menos claro porque no éramos capaces de lograr el mismo grado de caída como GSK-3β.
células PANC-1 fueron pre-tratados con AR-18 o siRNA contra de ambos isoformas de GSK-3, y luego expuestos a TRAIL. Inmunotransferencia confirma caída exitosa de GSK3α y β. Esto dio lugar a una mayor división de PARP y caspasa-3 tras la exposición a TRAIL. Scr:. Revueltos siRNA inespecífico
TRAIL Sensibilización sobre la inhibición de GSK-3 Involucra Las mitocondrias
señalización del receptor de muerte inicia una cascada de eventos que resulta en la activación de la caspasa efectora 3 y la inducción de la apoptosis [6]. Sin embargo, en algunas células la activación de caspasa-3 requiere amplificación de la señal a través de la escisión y activación mitocondrias Bid [2], [6]. Esto a su vez conduce a un estado fisiológico desequilibrada de la mitocondria que resulta en aumento de la generación de intermediarios reactivos de oxígeno y perturbación del potencial de membrana mitocondrial [24]. Para la prueba de la participación de la mitocondria durante la sensibilización por TRAIL AR-18, la citometría de flujo se utilizó para medir el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y la generación de ROI. Combinación de TRAIL y la formación inducida por AR-18 de poblaciones heterogéneas de PANC-1 y BxPC 3-células que tenían las características de aumento de la generación de ROI, la pérdida de ΔΨm, y la captación de PI, en comparación con el control sin tratamiento o tratamientos individuales (Figura 4) . Consistente con los resultados del ensayo de SRB y PARP escisión, AR-18 de tratamiento no provocó características apoptóticas en cualquiera de las líneas celulares ensayadas. El tratamiento con TRAIL solo produjo una cierta pérdida de ΔΨm y el aumento de ROI en BxPC-3, pero no las células PANC-1, aunque este efecto no fue tan extensa como el tratamiento de combinación. Estos resultados sugieren que TRAIL de sensibilización en la inhibición de GSK-3 implica la mitocondria.
células PANC-1 y BxPC-3 se dejaron sin tratar o se incubaron con AR-18 (25 M), TRAIL (10 ng /ml), o su combinación durante 24 h, y después se analizó por citometría de flujo. gráficos de densidad de puntos de yoduro de propidio (PI) absorción vs ΔΨm muestran que la pérdida de ΔΨm precede a la captación de PI. TRAIL pérdida de ΔΨm inducida en BxPC-3, pero no en PANC-1, en consonancia con su mayor sensibilidad visto utilizando el ensayo SRB (Figura 1). El tratamiento combinado con RUTA y AR18 sensibilizado con claridad las dos líneas celulares a la pérdida de ΔΨm, y esto fue acompañado por un aumento de la generación de ROI y la pérdida de integridad de la membrana a cabo.
Mecanismos moleculares de TRAIL sensibilización por GSK-3 Inhibición
para investigar más a fondo los mecanismos de sensibilización TRAIL por la inhibición de GSK-3, se emplearon PPC-1 de células de cáncer de próstata con sobreexpresión de Bcl-2, Bcl-XL, y MCL-1 para inhibir la vía mitocondrial, o la respuesta de citoquinas modificador a (CrmA) para inhibir la vía del receptor de muerte de la activación de caspasa. Evaluación de las células PPC-1 de tipo salvaje utilizando el SRB y citometría de flujo ensayos mostraron que la combinación de drogas fue más eficaz que los agentes individuales (Figura S1). A continuación, se evaluaron los efectos de las proteínas anti-apoptóticos en la sensibilidad a TRAIL y AR-18. células de PPC-1 que sobreexpresan CrmA, MCL-1, Bcl-XL, y Bcl-2 mostraron una mayor significativamente la proliferación celular después del tratamiento con el TRAIL + AR-18 de combinación, en comparación con las células no sobreexpresan cualquier marcador anti-apoptóticos (Figura 5A) .
PPC-1 (A) y PANC-1 (B) clones estables transfectadas con Bcl-2, Bcl-XL, CrmA, y MCL-1 que contiene constructo pcDNA3.1-His tag fueron tratados con el combinación de AR-18 (50 M) y TRAIL (10 ng /ml) durante 24 h. Los resultados se expresan como la viabilidad celular medida por el ensayo de SRB. Cada uno significa significan gráfico de tres experimentos con seis repeticiones. barras de error = ± SEM.
Al igual que los resultados obtenidos con las células de PPC-1, la sobreexpresión de CrmA y Bcl-2 en células PANC-1 protegidas de la combinación de TRAIL + AR-18, aunque había diferencias en los efectos relativos de los miembros de la familia Bcl-2 y los efectos de la Bcl-XL no fueron estadísticamente significativas en las células PANC-1. El efecto protector que sobreexpresan CrmA, que actúa para suprimir la activación de caspasa receptor de muerte, sugiere la posibilidad de que la inhibición de GSK-3 podría sensibilizar a sendero a través de la mejora de las caspasas iniciadoras, tales como la caspasa-8, así como a través de moléculas anti-apoptóticas tales como Bcl- 2 y MCL-1 en células de cáncer pancreático. Sin embargo, se necesita más trabajo para establecer esto.
AR-18 sensibiliza las células PANC-1 a TRAIL
in vivo
Con el fin de examinar el efecto de corto plazo la exposición a la combinación de AR-18 y TRAIL sobre la inducción de la apoptosis en PANC 1-tumores de xenoinjertos, que primero estableció que la dosis máxima de AR-18 tolerada por los ratones SCID utilizados por nuestro laboratorio era 20 mg /kg, dos veces al día por inyección intraperitoneal inyección (ip). ratones SCID machos que llevan PANC-1 xenoinjertos se dividieron en cuatro grupos de tratamiento diferentes y i.p. tratados inyección con DMSO o AR-18 (20 mg /kg; cada 12 horas durante 2 días), seguido de i.p. la inyección de TRAIL (25 mg /kg) dentro de las 24 h después de la última dosis AR-18. 24 horas después del último tratamiento los ratones fueron sacrificados y los tumores cosechadas (Figura 6A)
.
(A) Esquema de
in vivo
protocolo de tratamiento en. (B) β-catenina niveles de expresión se cuantificaron utilizando densitometría y los valores resultantes se normalizaron contra α-tubulina. prueba t de Student indicó que la combinación vs control: p = 0,0012, y para AR-18 vs control: p & lt; 0,0001. (C) Cuantificación de la apoptosis en las muestras tumorales utilizando puntuación H-. Escindido diapositivas manchadas (como se muestra en la Figura S2) 3 caspasa-se anotó para la intensidad de la tinción (I), así como el porcentaje de células positivas para la mancha correspondiente (H = I x P). Los resultados de la prueba t de Student para datos independientes (n = 5 en cada grupo de tratamiento) son los siguientes: TRAIL versus control (p = 0,0002), combinación frente al control (p = 0,0004), combinación frente TRAIL (p = 0,0261), combinación frente al AR -18 (p = 0,0035). (D) Evaluación de peso de los animales durante el tratamiento.
A medida que esta lectura de los efectos farmacodinámicos de la AR-18, que mide el nivel de β-catenina que está regulado por la GSK-3 a través de la vía Wnt. Hubo una disminución significativa (p & lt; 0,0001) aumentar los niveles de β-catenina cuando se compara con muestras de DMSO tratados después del tratamiento con AR18 (Figura 6B), lo que sugiere que la inhibición de GSK-3 se consiguió con éxito en los xenoinjertos PANC-1. Inesperadamente, los niveles de β-catenina se incrementaron significativamente en los ratones tratados con TRAIL. Esto parece ser un hallazgo novedoso, el significado de que es actualmente incierto. Además, la combinación de ambos fármacos aumentó significativamente los niveles de β-catenina en comparación con los controles de DMSO, pero los valores no fueron significativamente mayores que AR-18 solo.
Aumenta la terapia de combinación exfoliados caspasa-3
in vivo
Las mediciones H-score de la caspasa-3 escinde indicaron que solo RUTA produjo significativa (p = 0,0002) inducción de la apoptosis en PANC-1 tumores (Figura 6C y la Figura S2), mientras que AR-18 como un único agente tuvo efectos insignificantes. Sin embargo, la combinación de AR-18 y TRAIL mostró un mayor efecto en la apoptosis que induce cuando se compara con los tratamientos individuales o DMSO controles tratados: combinación frente al control (p = 0,0004), la combinación vs. TRAIL (p = 0,0261), vs. combinación AR-18 (p = 0,0035). Para investigar los efectos tóxicos potenciales en los animales que recibieron 20 mg /kg AR-18 solo o en combinación con TRAIL, el hígado y los riñones fueron fijados con formalina, embebidos en parafina y las secciones se tiñeron con H & amp; E y escindidos de caspasa-3. No se observaron cambios morfológicos evidentes de lesión incluyendo necrosis o apoptosis. El peso corporal de los animales midió diariamente durante el transcurso de este experimento de dosificación aguda no muestran diferencias significativas entre los grupos de tratamiento, excepto que los animales que recibieron TRAIL solo mantenido su peso en comparación con el control de DMSO (Figura 6D).
Discusión
Este estudio sugiere que el potencial de sensibilizar a los cánceres de páncreas TRAIL por la inhibición de GSK-3. En primer lugar, se observó sensibilización TRAIL través de la inhibición de GSK-3 en ambas líneas celulares de cáncer de páncreas y próstata. En segundo lugar, el proceso de sensibilización TRAIL se demostró que era dependiente de caspasa. Tercera caída, genética de GSK-3 utilizando siRNAs específicos de isoforma era igualmente eficaz en la sensibilización por TRAIL como fue el inhibidor de molécula pequeña AR-18. En cuarto lugar, GSK-3 sensibilización TRAIL inducida por inhibidores de se asoció con la pérdida de potencial de membrana mitocondrial acompañado por un aumento de la generación de ROI. En quinto lugar, los estudios de sobreexpresión en células de cáncer de páncreas indicaron que ambas proteínas mitocondriales caspasa-8 (CrmA) y NF-B-dependientes (Bcl-2, y Mcl-1) estuvieron involucrados en el proceso de sensibilización TRAIL. El uso de TRAIL en combinación con la inhibición de GSK-3 tiene relevancia para el tratamiento de cáncer de páncreas, ya que estos tumores tienen una alta frecuencia de K-ras y las mutaciones de p53 que probablemente contribuyen a su resistencia a los agentes estándar [27], [28], mientras sensibilidad a TRAIL se informa, es independiente de p53 y TRAIL es eficaz en tumores con p53 inactiva [29]. Además, se ha informado de la activación de mutaciones K-ras para sensibilizar a las células cancerosas a la apoptosis inducida por TRAIL [30], [31].
probó por primera vez el fenómeno TRAIL sensibilización y optimizar nuestro estudio utilizando células de cáncer de próstata debido a la prueba anterior de concepto en estos tipos de cáncer [20]. Curiosamente, aunque hubo una variación en la sensibilidad a TRAIL entre las líneas celulares ensayadas, con PANC-1 siendo el más resistente a TRAIL, la combinación con GSK-3 supresión proporciona una sensibilización consistente y altamente significativa para TRAIL en todas las líneas celulares ensayadas. Esta sensibilización parecía ser más dependiente del nivel de inhibición de GSK-3, en lugar de la concentración de TRAIL.
Los estudios anteriores atribuyeron la RUTA resistencia de las células de cáncer de páncreas a la sobreexpresión de ligado al cromosoma X inhibidor de la apoptosis (XIAP ) [32]. Volger
et al.
Mostró que la apoptosis tanto
in vitro
y el bloqueo de XIAP sensibiliza las células de cáncer de páncreas a inducida por TRAIL
in vivo
[33]. Otros estudios han puesto de relieve el papel de NF-kB en la resistencia a TRAIL a través de la regulación al alza de los inhibidores de la apoptosis tales como XIAP, Bcl-2, Bcl-XL, y MCL-1 [21], [34], [35], [ ,,,0],36], [37]. la inhibición de GSK-3 regula a la baja el nivel de expresión de estos NF-kB genes diana [14], [38] y también puede bloquear la vía del receptor de muerte [15], lo que sugiere que la inhibición de GSK-3 podría sensibilizar a las células cancerosas al tratamiento TRAIL a través de múltiples mecanismos .
de acuerdo con la anterior conclusión de que GSK-3 puede bloquear el receptor de muerte aguas arriba de señalización de la caspasa-8 [15], la sobreexpresión CrmA rescatado de la combinación de TRAIL + AR18. Aunque sugerente de un papel adicional para GSK-3 en la señalización del receptor de muerte, serían necesarios más estudios para confirmarlo. También encontramos la escisión de la caspasa-3 y PARP en células sensibles a TRAIL por cualquiera de AR-18 o genético desmontables de GSK-3 isoformas. Curiosamente, el efecto de GSK-3β en la apoptosis inducida por TRAIL era más prominente que GSK-3α, aunque la intensidad de doble caída isoforma fue significativamente mayor en comparación con GSK-3β solo, y fue comparable a la observada con AR-18. Estos resultados fueron similares a nuestro informe anterior, indicando que el bloqueo genético de GSK-3β y dobles desmontables de GSK-3 isoformas son relativamente más eficaz que la GSK-3α en la supresión de la actividad de NF-kB [14]. Sin embargo, eso no fue probado formalmente en estos experimentos y requeriría una investigación adicional.
Varias de las proteínas diana NF-kB inhiben la vía mitocondrial, y por lo tanto nos preguntamos si la combinación de TRAIL AR-18 + altera la función mitocondrial . Hemos encontrado una mayor liberación de ROI en conjunción con una disminución de potencial de membrana mitocondrial en las células tratadas con TRAIL + inhibidor de GSK-3, lo que sugiere la participación de las mitocondrias. Aunque la generación de ROI como un mecanismo efector durante la apoptosis inducida por el fármaco en las células cancerosas es bien conocido [39], nuestros resultados son de interés ya que sugieren un vínculo entre la sensibilización TRAIL por GSK-3 y la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Tal efecto se observó previamente en un estudio realizado por Jung
et al
., El uso de la curcumina para sensibilizar a las células de cáncer renal de TRAIL [40]. La curcumina tratamiento mejorado de generación de ROI en células sensibilizadas TRAIL. Además, también se observó un aumento de la DR-5 la expresión de una manera dependiente de retorno de la inversión [40]. Resultados similares fueron reportados previamente en las células astroglial humanos, haciendo hincapié en el ROI dependiente sobre regulación de los receptores de muerte TRAIL [41]. La escisión de la caspasa-3 observada en nuestro estudio podría favorecer la producción influencia retorno de la inversión, como la caspasa-3 activada puede inducir un bucle de retroalimentación en la cadena respiratoria mitocondrial [42]. Ya sea aumento de la generación de ROI en células de cáncer de páncreas es la causa fundamental de la sensibilización TRAIL después de la inhibición de GSK-3, o que se genera como efecto colateral de la ejecución de la apoptosis, queda por investigar. También vale la pena señalar que la generación de ROI podría volver a vincular NF-kappa B en el proceso de sensibilización TRAIL de GSK-3 inhibidores en el cáncer de páncreas.